液体菌种制作过程

液体菌种制作过程 液体菌种的的制作过程 一、 母种纯化 1、配方:1000ml为例 (1)小麦(麦夫或豆芽)50克，土豆200克，葡萄糖20克，蛋白胨2克，琼脂18-20克，KH2 PO4 1.5克，MgSO4 0.75克，PH自然(6左右) (2)蔗糖24g，蛋白胨2g，酵母膏1g， 2、制作 小麦煮开花，土豆煮酥而不烂;琼脂剪碎，放入溶解，加入其他配料，总体积称到 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 量，装入试管，进行常规灭菌(121?，40分钟)。 3、接种 将所用母种及新制的试管放入接种箱，灭菌20分钟后将手用75%的医用酒精擦洗(消毒)，伸入接种箱等待5-10分钟再开始接种(接种前所有接种工具都要在酒精灯火焰上匀烧灭菌)，在酒精灯火上方切取0.3cm?一小块菌丝，放入新培养基上，塞好试管口;放在该菌最适合的温度下培养。 4、培养 在培养过程中，每天都要仔细逆光观察，发现有任何疑常现象都要淘汰不要。 二、 摇瓶种子制作 1、配方:1000ml为例 a. 可以用母种纯化配方(不加琼脂) b. 土豆200克，黄豆8克(需打凝浆)或脱脂豆奶8克，葡萄糖30克，蛋白胨2克，KH2 PO4 1.5克，MgSO4 0.75克。 c. 玉米小麦各50克，蔗糖20克，葡萄糖10克，蛋白胨2克，酵母膏2克，KH2 PO4 1克， MgSO4 0. 5克。 d(蔗糖24g，蛋白胨2g，酵母膏1g，KH2 PO4 2g,MgSO4 1g, 豆浆50ml. 2、制作 将以上配方任选一种用类似母种的方法制成液体培养基，装入摇瓶，塞好瓶口，包上放潮纸， 放入灭菌锅，封好锅口，打开放气阀，当有大量蒸气排出时关闭放气阀，温度升至121?后，计 时40分钟，让其自然冷却，压力归零时，打开灭菌锅盖，将一边掀起3-5cm，利用余热将棉塞 烘干。 3、接种 将摇瓶及纯化好的母种一起放入接种箱，灭菌后，去掉防潮纸，扭松棉塞，在酒精灯火焰上方， 挑取0.3cm?的菌丝皮左手拿起棉塞,右手迅速将菌丝接入,然后立刻盖上棉塞,用同样的方法一 20块,让其均匀地分布在液体表面。 个摇瓶接入15- 4、培养 将接好种的摇瓶放在适温下静止培养4天左右，逆光观察，或放在光线下培养24-48H，没有任 何杂菌，放在电磁摇床上搅拌培养;放在旋转摇床上，150-220r/分，28?下培养4-6天，当瓶 壁上有白色菌丝生长或静止1小时后，澄清液不超过1CM就可应用。 三、 发酵设备的安装 1、安装 一般的电控箱、补料罐、过滤器、降温器、热安换器组装到一个平台上，它的管道滤芯都要消 毒灭菌再装入，将气管道与料管道连接完毕后，即可进行密封测试。 2、密封性能检测 打开气泵，将整个系统通满气压，用肥皂水检查每一个接口，若没有任何漏气现象即可使用。 四、 系统的无菌处理(约两小时) 1、空消 将灭菌补料罐内罐加水62-65L，打开加热层排气阀门，给加热层加水至视镜的1/2处，关闭底 部中心的进水口阀门。接通电源，按下总开关，打开灭菌开关，将温度设定到121?-125?。当 加热层排气口有大量蒸气排出时，关闭此阀门，当内罐温度达到设定标准后，关闭空气总管道 阀门及二级过滤器空气进入阀门。 a. 对过滤系统灭菌(1小时) 打开蒸气总阀门，让蒸气通过二级过滤器进入三级，四级过滤器，最后进入发酵罐[注:每 5-6分钟要排一次过滤器下部的冷凝水]，从发酵罐底部的排污口每5-6分钟排一次冷空气及冷 凝水，在发酵罐温度在100?以前，发酵罐内的冷空气要不断分次排出，这时发酵罐内的压力接 近零状态为好，每看到发酵罐内有压力上升，就从底部排污口排冷凝水，使其压力为零。当发 酵罐温度达到118?后，将接种阀，取样阀，排气阀门打开一点让蒸气慢慢排出一些，保持1h 后关闭发酵罐进料阀门，接种阀，取样阀，排气阀门。 b. 对过料管道灭菌(半小时) 首先检查热交换器及冷却器的水是否排完。打开灭菌补料罐进入过料管道的蒸气阀门及过 料管道排气阀门，对过料管道进行灭菌，当排气阀门有大量蒸气排出而无水排出后，调整小一 点有少量蒸气排出即可。这时打开发酵罐进料口阀门，关闭发酵罐进气阀门及灭菌补料罐进入 过滤器的蒸气阀门。打开空气总阀门及二级过滤器上部的空气阀门，将每个过滤下部排冷凝水 的阀门打开一点，把灭好菌的滤芯吹干(30-60分钟)。30分钟后，关闭过料管道排气阀门及 发酵罐出菌种口阀门。 c. 对接种管道灭菌(半小时) 打开灭菌补料罐进入接种管道的蒸气阀门。蒸气进入接种管道后，把接种枪开关打开，排 出接种管道内的冷凝水，当有大量蒸气排出后，将其固定在稳定状态，让蒸气一直排出;打开 发酵罐出种口阀门，关闭灭菌补料罐进入过料管道的蒸气阀门，将发酵罐出种口处的排气阀门 打开一点，用蒸气对其灭菌，将发酵罐底部的取样阀门打开一点，有少量蒸气连续排出(对取 样管道进行灭菌)，保持30分钟，关闭取样管道阀门，迅速将取样管口插入甲醛瓶内，关闭菌 种出口处的排气阀门及接种枪开关，关闭出种口阀门，把接种枪头放入无菌袋内封好。打开灭 菌补料罐出料口阀门，将内罐的高温高压水经过料管道打入发酵罐内，(主要是对出过料口到 蒸汽出口之间管道的死角位，所以要进行20分钟以上)，(同时关闭灭菌补料罐上进入接种管 道的蒸气阀门)，打完后开启发酵罐进气阀门，关闭过滤器下部的排冷凝水阀门，让无菌空气 进入发酵罐，将发酵罐内的高温高压水从底部的排污口放出。 2、空吹 调整发酵罐的进气与排气量，使保持在0.03-0.04MPa，连续工作10-24小时。 3、再空消 用同(1)一样的方法对整个系统再空消一次，结束后用75%的医用酒精棉球把发酵罐顶部中心 的接种阀门口封好，同时把尾气过滤消毒后装上。(注:让整个系统保持正压，在补料罐加压时 要等内压下降时通入，停止加压时发酵罐温度不能高于室内温度，防止冷却后变负压。) 4，空消过程中对下取样阀门灭菌时，要注意安全，阀门要慢慢开，一定要捉紧取样管，以免被蒸气灼伤。 五、 发酵罐培养基的制作与灭菌 1、配方: A、淀粉0.2% 黄豆0.5% 蔗糖2% 葡萄糖1% 蛋白胨0.2% 酵母粉0.3% KH2 PO4 0.1% MgSO4 0.05% 植物油0.15% B、玉米淀粉(0.5-0.8)% 黄豆(0.8-1.2)% 蔗糖2% 葡萄糖1% 酵母粉0.5% KH2 PO4 0.1% MgSO4 0.05% 植物油0.15% C、土豆2%，麸皮1%，蔗糖2%，蛋白胨0.2%，酵母膏1.6% KH2 PO4 0.1% ，MgSO4 0.05%，植物油0.15% 加水升温 1， 检查灭菌补料罐夹层水是否达到视境的1/2;如达到无需加水，如低于水位处要加纯化水。加 水顺序:先将灭菌补料罐的夹层排气口打开，将夹层压力降至0。然后打开夹层进水口阀门， 在进水口的软管连上专用的漏斗，最后往漏斗里加水，直达到视境的一半。关闭底部进水口。 2， 往灭菌补料罐内层加水，加水量视补料量而定(补50升料则加40升水;补60升水则加50升 水)。往内层加水的方法有两种(空消结束后，用自来水往加料口直接加水;如果是补料结束后 加水，则用水泵把热交换器里的水往内罐打水，顺序是先把内层进水口里的两个阀门打开，再 打开水泵开关。加完水后先关闭水泵，再把进水口处两个阀门关闭。) 3， 将灭菌控温仪上的温度设定到125度，接通电源。当夹层排气口有大量蒸气排出后关闭此阀门。 加料 1当灭菌补料罐上的温度超过90度后，打开出料口阀门(目的:在空气的搅拌下加料，防止加料过程中出现结块，让料均匀分布)进行加料。加料顺序:先加植物油，再将其它配好的母液加进，加完料后清洗加料口。 2:将计时器上的时间设到2400秒，并打开计时开关。 3:当加料口、排气口大量蒸气排出后并闭这两个阀门。 灭菌计时 1:当灭菌补料罐上的温度达到121度，压力达到0.1MPa后，灭菌计时器起动，操作人员必须在场，保证设备安全和控制温度、压力在安全范围内运行。 2:开始计时后，先将灭菌补料罐的加料口、排气口和进水口处的两个阀门打开一点，让其有小量蒸气排出(对这些阀门的死角进行灭菌)。 3:往热交换器内注水，直至溢流口有水出后停止加水(注意:当溢流口有水出后要及时停止加水，防止水从热交换器上流出来) 过料 1:当灭菌时间达到后，报警声响起，灭菌结束，关闭灭菌开关和计时开关。 2:接通循环水，关闭发酵罐进气阀门，打开尾气(目的:降低发酵罐压力)当压力降至约为0后关闭。 3确定所要补料的罐后，关闭此罐到另一罐之间的过料管道阀门，防止培养液流到另一端。 4并闭灭菌补料罐出料口旁边的加压阀门(防止培养液从此阀门流到其它管道)，再打开出料口阀门。最后打开发酵罐进料口，过料开始。 5:从视境检查是否有料过入发酵罐，如无则重新检查各管道和压力是否正确。 6:大约30分钟后，灭菌补料罐内的压力降到0.5MPa以下，说明过料基本结束。这时要打开补料罐的蒸气总阀门(由于压力过低，补料罐里的尾料无法压出，打开蒸气总阀门是对补料罐进行加压，提高压力把它打到发酵罐内) 7:尾料过完后，关闭蒸气总阀门、出料口、发酵罐进料口和关闭循环水，打开发酵罐进气阀门、出料口旁边的加压阀门，打开补完料的的发本地罐到另一发酵罐之间过料管道的阀门，调整尾气量。 8:做完这些工作后，打开灭菌补料罐的加料口和排气口，放尽其压力，打开进水口处的两个阀门，再打开水泵，往补料罐加入水，加水量视下次补料量而定。 9:补料结束，离开发酵房前要检查各个环节是否正常，水电开关是否处于正常状态。当一切正常后方才离开。 注:1、灭菌结束后要立刻取样，检测培养料灭菌系统是否达标。 2、接种前给灭好菌的培养基通入12-24h的无菌空气后取样，检测过滤系统是否达到无菌状态。 具体操作看(液体菌种的检测) 3、在过料过程中，会发生塞管的情况～发生这种情况时要把循环水降温器上的过料管折开，用气吹通后装上。再用夹层蒸气对过料管道灭菌。 六、 接种 取刚培养好的摇瓶种子，若是保藏菌种要先解冻，放在室温下用75%医用酒精将摇瓶出种口浸 泡20分钟以上。检查发酵罐顶部的接种口是否处理好。准备好火环及镊子(钳子)，先关闭进 气阀门，待罐内压力归零后，二人配合接种，甲，将浸湿酒精的火环套在接种口上，点燃火环， 用镊子拿掉接种阀门口的酒精棉球，打开接种阀门;乙，手持摇瓶，将金属管出料口放入火焰 内。甲，用镊子拔掉管头内的棉塞，乙，将管子插入接种阀门内，斜提摇瓶接入菌种，接完后 拔出管子，关闭阀门，去掉火环，用75%医用酒精封好接种口，打开进气阀门通入无菌空气， 发酵培养。 七、 液体菌种的培养 1、将温度设定到该菌菌丝的最佳生产范围下限点高2-3?，最适温度为28-30?，低于27?菌 丝生长明显减慢，高于30?菌丝容易衰老并逐渐自溶，培养液颜色变深，至死温度40?。 2、罐内压力保持在0.03-0.04MPa，前期通气量1:0.3-0.5,后期1:(0.5-0.8)，通气量的大小 对菌形态和产量影响很大，通气充足时菌球大小均匀，通气不足时菌丝呈扩散性，形态不一， 有片状、絮状、球状等。 3、液体菌种培养基的PH最适5.0—6.0,发酵初期4.0-5.4时菌体生长最好,PH下降到3.0时 菌丝停止生长。 4、培养过程中，要保持气压和温度的稳定，留意天气的变化，天冷时进行加热。加热过程中， 要留意发酵罐中的导热油足不足够，不够要加上～ 八、 液体菌种的质量检测 1、取样 用250ml的三角烧瓶数个装入固体培养料，封好瓶口;取数个同样的空瓶子，用棉塞封好 瓶口，一起放入高压锅内，在0.15MPa压力下灭菌1.5-2小时,结束后,当瓶温低于30?,取六个 固体,六个液体,用75%医用酒精浸湿棉塞,然后用10%以上H2O2或0.25%新洁尔溶液再浸一次,20 分钟后二人配合取样,第一人手持火环点燃,第二人在火焰内从甲醛瓶内拔出取样管,在火焰保 护下放掉管内的残留菌液,第一人将火环套在待取样的瓶口上,用钳子拔掉棉塞;第二人将取样 管插入瓶内打开取样阀放入适量液体菌种(动作要快,要准),第一人迅速用棉塞封住瓶口,火环 移入下一瓶。用同样方法取完各瓶(整个取样过程，取样管口不能离开火焰中心)，把取样管插 入甲醛瓶内，放回原处。 2、检测 a. 菌种活力及纯度检测 固体瓶放在该菌最佳生长温度范围上限点，培养10小时后表面菌丝开始萌发，24小时 后菌丝开始吃料，48小时后吃料0.1cm以上,表面菌丝洁白,生长有力。 把样液瓶放在常温或冰箱内，12-24H，观察上清液，一般要求在5%以下，如果多于10%表示 菌种老化或培养基营养不足。如果长时间放置上清液都无大变化，就表示菌种健壮及培养基 配方适合。 b. 细菌检测 把空瓶内取的样液瓶及平面培养皿一起放入接种箱(或无菌室)内，在无菌条件下将样 液接入培养皿，放在30-33?温度下培养24小时后没有任何疑常现象即可。 c. 菌种数量及大小检测 把空瓶内取的样液瓶用吸管取1ml菌液，用无菌水稀释10倍或100倍，用细吸管吸取 稀释后的菌液，数1ml菌液里有多少个菌球再乘以稀释倍数。再用尺贴在后面量几个菌球 的直径再平均。 液体菌种培养过程为初始期—成熟期—衰老期(结束期)。一般接种时应要菌种的成熟 期内，菌种要求每ml菌液1000-3000个，菌球直径0.5-2mm(1 mm最好)，如菌球太大可 能是氮源不足可加大淀粉及黄豆量。如接种期有变动，可以控制接种量，培养温度，通气 量，令接种时保持在菌种的成熟期内。 九、 扩大培养 经过上述检测没有任何杂菌即可扩大培养(补料)，方法同(五)，将培养料补到发酵罐体上视 镜2/3处即可;经第一次检测确认没有任何杂菌，以后每次补料都是在密封的管道内进行，只 要正确操作一般不会污染杂菌，但也不能掉以轻心，每罐每天都要检测两次为好。 十、液体菌种应用及注意事项 液体菌种具有菌龄一至，渗透性强，萌发早，吃料快等优点，但它不能长期存放，不适宜异地运输，现作现用效果最好。 液体菌种是悬浮在发酵罐内液体中的单个菌丝球组成，接入料袋后菌丝与固体料直接接触，适宜的环境能加快菌丝生长吃料速度，提高成品率;反之影响菌丝生长;一般PH值偏高或偏低，培养料含水量过大都影响菌丝生长。所以接液菌种的培养料含水量比常规要低5%-10%，PH值要在最适范围内，接种后要在最佳温度下培养。 接种后每个菌丝球都暴露在固体培养料表面，没有任何缓冲保护，所以移动时要轻拿轻放，不要损伤菌丝，否则影响萌发。 液体菌种的发酵温度在正常培菌的温度下降2?。接好种后，前两天培养房的的温度在30-31?，两天后下降2?，等菌丝吃料5mm时再降到正常温度 发酵罐内的老菌皮要定期清理，清理方法:从上视窗观察到罐内的菌皮太厚时，把培养基的浓度增加，培养好后在接种前3-4小时把灭好菌的水打入，水位高于菌皮水位，再开大空气将其翻滚至破碎，接完种后把多余的菌种排走。 十一、连续发酵 培养好的液体菌种，接种结束后，在罐内留15L(5-15%)左右作为下一罐的母种，接种量太多易老化。用同(五)一样的方法补入新的培养基。 每次连续发酵补料灭菌过程中同时，要对该罐的空气过滤系统、过料管道、接种管道进行灭菌20-30分钟。具体操作: 每次当发酵罐内菌种使用结束，再次补料灭菌过程中，罐内培养料温度达121?、压力稳定时，首先关闭所需补料发酵罐的排气阀门，进气阀门及进入二级过滤器的空气阀门，然后打开灭菌补料罐加热层的蒸气出口阀门，让灭菌补料罐加热层的蒸气依次进入二级、三级、四级过滤器，从过滤器下部的排冷凝水阀门排出，对其灭菌30分钟;关闭蒸气，通入空气吹干滤芯，灭好的培养基打入发酵罐后，关闭过滤器下部的排冷凝水阀门，让无菌空气通入发酵罐，调整好温度、压力与通气量，发酵培养。 同时可用内层的蒸汽对过料管道和接种管道分别进行灭菌，把管道到发酵罐阀关闭，排完冷空气后留少量蒸汽冒出，每条管道灭菌保持20-30分钟。如果内层压力够可以同时灭菌。 十二、品种的更换 在发酵生产的过程中，若需换品种，用同空消一样的方法，对发酵罐进行灭菌即可。 十三、设备保养 1、保持设备的清洁 2、压缩机的储气罐放水阀每日打开一次排除油水。 3、压缩机的润滑油每天检查一次。每300小时换新油一次。 4、压缩机的空气滤清器15天清理或变换一次。 5、总过滤器(一级过滤器)每年更换滤芯一次。 6、二级过滤器滤芯，不堵塞就不用换。 7、三、四级过滤器每灭菌150-200次更换一次。 8、尾气过滤器不进泡就不用换。 9、导热油溢流口溢出的不是油而是水时要更换。 十四、菌种培养过程中会出现的问题。 1 菌种下沉。(原因可能是培养时间不够、培养基营养不足。正常情况下，菌种的培养时间为4天，如果经过四天的培养，菌种还是出现下沉，就 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 是培养基的问题，要及时对培养基进行调整，看氮碳比是否不不行。) 2 菌种上浮的原因是老公(可能是培养时间过长或母种出现老化。如果是菌种老化就要及时进行分离或采购新的菌种。) 3 菌种的均匀度不好。(出现这种情况的主要原因是温度和尾气量调控不好。培养时温度过高菌球会较大、表面比较光滑。尾气量过低，菌球较大但表面有鞭毛。) 4 菌种要培养得好，一定要注意培养基、温度、尾气量、培养时间、母种质量等各个方面全面调控，将这些因素控制在正常范围内。