单克隆抗体分离纯化策略工艺开发

单克隆抗体 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 单克隆抗体分离纯化策略—工艺开发GE医疗生命科学部樊丰林简介治疗类抗体药物研发已经超过了30年；到2004年单克隆抗体的平台工艺已经有报道。由2013年7月FDA批准了JanssenBiotech公司(J&J)于抗体以及Fc融合蛋白有相似的分子结构，所以在的SimponiAria（Golimumb，是一种输液给药的研发以及设计生产工艺的时候可以使用平台工艺的策略设计、研发。平台工艺不是一个标准的 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，TNF-a，它在2009年已经批准，但此次获批是不同而是一个设计理念，或者是一个抗体以及Fc融合蛋的给药方式。这是一个全新的药物，还是不同给药白的设计思路。方式的同一产品，FDA没有给出 答案 八年级地理上册填图题岩土工程勘察试题省略号的作用及举例应急救援安全知识车间5s试题及答案 ），至此治疗类抗体药物已经到达39个。高质量、高纯度、低成本和生产规模大是治疗类抗体药物生产中的挑战，这就要求抗体药物生产必须有一个经济、稳定的生产工艺。工艺探索（processdevelopment）在生物制药中是一个非常关键的环节。美国FDA在2004年将QbD的概念引入到药物生产工艺验证中。QualitybyDesign（QbD）是ICH的Q8、Q9以及Q10指导原则中对生物产品在生产图2.GE医疗生命科学部推出的抗体纯化平台工艺中的要求。运用QbD的理念设计和开发生物制药生已经上市的抗体和FC融合蛋白药物的大规模产工艺，需要把质量建立在一个系统的，科学的和生产工艺（VLS）主要有：非亲和纯化工艺和亲和基于风险的生产工艺。ProteinＡ纯化工艺（如前文所述）。Genetech开发了通用的三步法抗体工艺：ProteinA-CEX-AEX；QbD的理念要求生物药物的生产工艺研究起始Amgen根据ProteinA洗脱后的聚体含量给出了相于对目标产品的质量性质（QTPP）以及关键的质量应纯化工艺的策略；Wyeth开发了两步法纯化工艺，特性(CQA)的确定，然后使用实验设计（DOE）的方在proteinA洗脱后只是使用了一步精细纯化步骤。法开发生产工艺，确定生产工艺的设计空间与生产GE医疗生命科学部开发了抗体纯化平台（如图2）。工艺的操作空间。通过工艺验证（processvalidation）本文根据GE公司抗体纯化产品以及抗体的纯化应得到经济、稳定的生产工艺。用文献，总结单克隆抗体工艺开发中各个步骤中需要探索的条件。在工艺开发中主要需要探索以下条件：a．动态载量实验b．中间清洗实验c．洗脱条件实验d．再生条件实验e．层析介质CIP条件图1.QbD的工艺探索要求f．层析介质寿命实验1.抗体或Fc融合蛋白的亲和工艺开发对于不同的样品：表达量高的一般在3g/L以上的样品使用MabSelectSureLX有优势。表达量低的两步法纯化工艺主要：MabSelectSure（或使用MabSelectSure。表达量较低的样品，最好在MabSelectSureLX）捕获，CaptoAdhere精纯。一上样前浓缩处理。般在样品中的聚体在10%以下时，使用此方法开发有以下的优点：在保证产品质量的同时，工艺步骤1.2中间清洗实验简单，从而减少工艺成本、减少硬件投资、减少工ProteinA亲和层析特异的结合抗体或Fc融合蛋艺时间、减少缓冲液的消耗、减少工艺认证的成本；白，但是培养中的一些杂质HCP也可能与ProteinA增加工艺效率。2013年一季度上市新层析介质吸附，所以选用适当的中间清洗方法可以尽可能的CaptoAdhereImpRes和CaptoMMCImpRes更专注减少杂质（HCP）在洗脱液中的残留。按照QBD的在抗体的精纯步骤，分辨率更高，可以将聚体以及要求，一般使用Predictor96孔板做工艺设计空间的抗体的变构体去除。探索，使用HiScreen柱做确认和操作条件的探索。MabSelectSure（或MabSelectSureLX）是修实验材料与方法：饰的ProteinA亲和层析介质，主要对抗体的Fc区实验材料：PredictorMabSelectsure20ul或Predictor域有特异吸附，对于MabSelectSure的工艺开发主MabSelectsureLX20ul缓冲液：PB或PBS，pH7.2-7.4要探索条件有：样品：澄清的CHO细胞上清液，采用DBC载量实1.1动态载量实验验的上样量（80%DBC10%）抗体的动态载量（DBC）一般与抗体在培养上检测：清液的浓度无关，只是与上样时的保留时间（RT）HCP残留：ELISA法为正相关，即保留时间越长DBC越高。对于不同收率：UV280nm吸收的层析介质，说明书会给出一般DBC时的保留时在中间清洗去除HCP的实验中，首先选择pH，间。例如：MabSelectSure一般在2.4min为DBC降低pH可以去除HCP，但是降低pH可能影响收率。为35g/L；MabSelectSureLX一般在6min为DBC其次，在清洗缓冲液中加入添加剂，常用的添加剂为60g/L。一般抗体的DBC高于Fc融合蛋白。动见下表：表1：中间清洗可选用的试剂态载量实验一般使用1mlHiTarp柱实验确定10%流添加剂浓度穿时的DBCMAX。盐类0-1MNa2SO4，Nacl0-2MCacl2，MgCl2，MgSO4实验材料与方法：尿素0-3M实验材料：HiTrapMabSelectsure1ml层析柱或去污剂0.002-0.02%Tween-20HiTrapMabSelectsureLX1ml层析柱有机溶剂10-20%异丙醇，乙二醇，缓冲液：PB或PBS，pH7.2-7.4氨基酸0-0.5MArg，Gly保留时间：Sure2,3,4min；SureLX4,5,6min样品：澄清的CHO细胞上清液使用Predictor探索不同添加剂以及pH对使用仪器：AKTAavant25（或150）HCP的清洗条件。找到对HCP较高的去除条件。检测：检测流穿液中抗体的浓度DBC=（V-V）10%10%0C0/Vc使用HiScreen柱探索操作空间：HiScreen公式中：DBC10%为10%流穿的DBC。V10%：10%流穿时MabSelectsure或HiScreenMabSelectsureLX的体积，V0：层析柱的外水体积；C0：起始的抗体浓度；上样缓冲液：PB或PBS，pH7.2-7.4Vc：柱床体积。样品：澄清的CHO细胞上清液，采用DBC载量验的上样量（）计算出不同RT的DBC10%，曲线如图80%DBC10%中间清洗试剂：以Predictor筛选的试剂使用仪器：AKTAavant25（或150）如图，Kristina使用此种方法筛选到高效的HCP的清洗方法。在此实验中重要的是探索到，在高抗体的收率下，最佳的HCP去除。图3.MabselectSureLX与MabSelectSure的DBC与保留时间的曲线添加剂Arg0-2M添加剂Gly0-0.2M，添加剂蔗糖0-0.2M添加剂尿素0-2MGE应用文献28-9277-92AA中探索了5个抗体的洗脱pH。不同的抗体间的洗脱pH以及收率是不一致的，所以不能简单的使用某一pH洗脱不同的图4中间清洗实验的条件筛选抗体或Fc融合蛋白。例如：应用文献28-9468-58AB中探索了不同的pH洗脱下的单体收率。1.3洗脱实验抗体或Fc融合蛋白的洗脱一般使用低pH，但是低pH会产生聚体，这会影响工艺的收率。MabSelectSure或LX为修饰的ProteinA。Amgen公司的文献报道在洗脱时，洗脱缓冲液的pH比较一致。图6：最佳的洗脱pH的探索图5，不同的proteinA层析介质的pH洗脱范围收集的样品：单体的纯度，HCP，聚体，ProteinA的脱落以及收率的分析。从中找到合适的设计空不同的抗体以及Fc融合蛋白的稳定性是有较间。大的差别的，在较低的pH下有些抗体容易形成聚集体，这就影响抗体或Fc融合蛋白的收率。(在实使用HiScreen柱探索操作空间。验设计时最好了解您项目分子的特性，也可使用一HiScreenMabSelectsure或HiScreenMabSelect些仪器做稳定性实验，例如：DSC)。通过Predictor探sureLX索适合的洗脱缓冲液，pH以及添加剂，可以避免聚上样缓冲液：PBS，pH7.2-7.4集的发生。样品：澄清的CHO细胞上清液，采用DBC载量实实验材料与方法：验的上样量（80%DBC10%）实验材料：PredictorMabSelectsure20ul或Predictor洗脱条件：Predictor探索的试剂MabSelectsureLX20ul使用仪器：AKTAavant25（或150）缓冲液：PB或PBS，pH7.2-7.4检测：同洗脱实验样品：澄清的CHO细胞上清液，采用DBC载量实验的上样量（80%DBC）10%1.4再生实验中间清洗采用上实验的最佳条件再生是洗脱后去除层析柱内的残留物质，以便洗脱:柠檬酸于再次上样。一般为了方便再生与CIP合并。检测：HCP残留：ELISA法收率：UV280nm吸收1.5CIP实验纯度以及聚体残留：Superdex200Increase，CIP在位清洗，主要的目的是清洗残留的杂质、ProteinA残留：ProteinAELISAKit沉淀以及微生物和内毒素。在层析工艺中一般使用NaOH做CIP，传统ProteinA层析介质的配基为为了保证抗体或Fc融合蛋白的稳定性，必要时ProteinA，天然或重组的proteinA对NaOH不耐受；添加一些试剂，可以增加稳定性的试剂见表2.MabSelectSure使用的是修饰的ProteinＡ-sure配基可以耐受0.1-0.5MNaOH的清洗。所以使用表2：可以增加抗体稳定的试剂MabSelectSure或LX可以使用0.1MNaOH接触时缓冲液醋酸钠或柠檬酸钠间15min。如果污染严重时，也可以使用0.5MNaOH浓度20-100mM或更高清洗。pH3.0-4.8对于不能确认是否耐受NaOH的ProteinA，例如：天然proteinA的层析介质可以采用应用文献18-1149-04AA中的方法，实验层析介质的稳定性。确认后使用此试剂做CIP。CIP完成后使用TOC检测CIP效果。1.6寿命实验层析介质寿命影响着生产工艺经济效益。这也是SFDA和FDA所要求的验证文件之一。实验材料与方法：图9.100循环后Sure的配基脱落实验实验材料：HiScreenMabSelectsure或HiScreenMabSelect对于层析介质的寿命，DBC只是其中一个指标，sureLX但是不能只以DBC的指标为准，要通过以上指标确上样缓冲液：PB或PBS，pH7.2-7.4定介质的寿命。样品：澄清的CHO细胞上清液，采用DBC载量实验的上样量（80%DBC10%）中间清洗：按照上文中已经优化的方法2.复合配基的工艺开发洗脱：按照上文中已经优化的方法CIP：0.1M或0.5MNaOH接触15min复合配基是指在同一层析介质上有两种或以上使用仪器：AKTAavant25（或150）不同层析原理形成的配基。GE公司的复合配基的层实验循环：平衡-上样-中间清洗-洗脱-CIP—在平衡。析介质有CaptoAdhere/CaptoAdhereImpRes,以及可以间隔5-10循环后检测，同时做Blank实验，检CaptoMMC/CaptoMMCImpRes。复合配基由于有多测CIP效果以及柱上残留。种作用力，如：离子交换，氢键，疏水作用等。所检测：DBC10%；抗体收率，HCP，ProteinA的脱落，以复合配基层析介质有特殊的选择性，pH的使用范以及工艺中比较难处理的杂质或特殊的残留物的浓围较宽以及盐的耐受性较高。度，如聚体、变异体。2.1复合配基Captoadhere/CaptoMMC的工艺详细信息请见GE应用文献：28-9872-96开发复合配基是指在同一层析介质上有两种或以上不同层析原理形成的配基。CaptoAdhere以离子交换配基为主，并有疏水的苯环组成的复合模式的层析介质，如图。图7MabselectSure以及LX在0.1MNaOH的DBC的变化。图10.CaptoAdhere复合模式层析介质复合模式配基的CaptoAdhere是为抗体纯化设计的层析介质，它既有阴离子交换配基，可以去除DNA、病毒、脱落的proteinA、以及内毒素；同时又有疏水的配基，可以去除聚体。在聚体含量较高图8.80个循环，MabSelectsure的纯化工艺的稳定性时，可以使用同样配基的高分辨率CaptoImpResAdhere层析介质高效的去除聚体同时保持高的回收率。类似CaptoAdhere，CaptoMMC为复合模式配基的弱阳离子交换层析介质。以弱阳离子交换为主，并同时又疏水和氢键的作用。如图缓冲液pH:50mM柠檬酸钠pH4-6，50mM磷酸钠pH6-7.5盐浓度：0-550mMNaCL上样量：50-150mg/ml检测：HCP残留：ELISA法收率：UV280nm吸收图11.CaptoMMC复合模式层析介质纯度以及聚体残留：Superdex200Increase，ProteinA残留：ProteinAELISAKitCaptoMMC为使用在抗体的纯化工艺中可以去DNA残留：PCR除聚体，ProteinA，HCP等杂质。同时高分辨率的CaptoMMCImpRes可以在较低聚体残留量的条件下，还保持高的收率。对于CaptoAdhere/CaptoMMC的工艺开发主要探索条件有：2.1.1初始预实验初始实验的目主要是通过此实验找到吸附模式或流穿模式起始pH值。根据此值设计DOE的范围pH的低值（出峰时的pH），pH高值一般在低值+2个pH。图13.CaptoAdhereDOE全因子设计实验材料与方法：实验材料HiScreenCaptoAdhere样品：MabSelect洗脱的收集液经过脱盐处理，上样量5mg。平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠+20mM磷酸钠pH7.8洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠+20mM磷酸钠pH4.0梯度：15cv线性梯度使用仪器：AKTAavant25（或150）图14.Predictor实验结果pH、电导、上样量的影响检测后，选择收率高，载量高，同时聚体含量低，HCP、ProteinA的残留低的条件，使用HiScreenCaptoAdhere层析柱对设计空间进行确认与优化，探索操作空间。图12.线性pH洗脱探索起始的pH应用文献29-0273-38AA中研究了CaptoAdhere和CaptoAdhereImpRes，表明Capto2.1.2流穿模式实验AdhereImpRes有较高的载量以及在高收率下的聚CaptoAdhere设计用于抗体精细纯化，去除聚体残留体、HCP、脱落的proteinA、DNA以及去除病毒。影响CaptoAdhere的主要条件是上样的pH、电导、以及上样量。按照QBD的要求，一般使用Predictor96孔板做工艺设计空间的探索，使用HiScreen柱做操作空间的探索。采用DOE做pH、电导、上样量的设计。实验材料与方法：实验材料：PredictorCaptoAdhere6ul样品：MabSelect洗脱的收集液经过脱盐处理，上样量5mg。探索条件：图15CaptoAdhere和CaptoAdhereImpres在聚体的去除和2.1.5洗脱实验收率的比较。复合模式的离子交换CaptoAdhere/MMC的洗2.1.3CaptoAdhere吸附/洗脱模式实脱一般使用pH或盐洗脱。对于CaptoAdhere使用CaptoAdhere/CaptoMMC可以去除聚体，但是pH洗脱一般是降低pH，而CaptoMMC一般是升高在聚体含量较高时考虑吸附/洗脱模式。根据初始的。使用洗脱的优点是可以降低盐浓度，但是预实验，确定样品的吸附条件，动态载量。洗脱条pHpH对于一些不稳定的抗体，pH通过PI时会有沉淀。件。这种样品请避免使用pH洗脱。2.1.4动态载量实验应用文献29-0373-49AA介绍了CaptoMMC影响CaptoMMC或CaptoMMCImpRes的主要ImpRes的吸附/洗脱。条件是上样的pH、电导、以及上样量。按照QBD的要求，一般使用Predictor96孔板做工艺设计空间检测方法同CaptoAdhere的流穿模式实验。的探索，使用HiScreen柱做操作空间的探索。采用DOE做pH、电导、上样量的设计。结合上样的条件请选择残留量最低的洗脱条件。实验材料与方法：2.1.6再生实验实验材料：PredictorCaptoMMCImpRes6ulCaptoAdhere/MMC一般采用高盐或pH做介样品：MabSelect洗脱的收集液经过脱盐处理。质再生，例如CaptoAdhere0.1M的醋酸pH3.0。探索条件：根据抗体的PI，一般在PI以下，pH:50mM柠檬酸钠pH4-6，50mM磷酸钠pH6-7.5；2.1.7CIP实验盐浓度：0-50mMNaCLCaptoAdhere/CaptoMMC一般采用NaOH做上样量：30-70mg/ml。CIP，清洗沉淀蛋白、杂质、内毒素等。可以在1MNaOH40°C储存1周没有离子载量的变化，所以在例如：在CaptoMMCImpRes应用文献1MNaOH稳定。对于不同的样品可以使用29-0373-49AA中抗体的PI=7.3，DBC与pH盐浓度0.5-1MNaOH做CIP。的关系。2.1.8寿命实验类似MabSelectSure的寿命实验，CaptoAdhere、CaptoMMC的寿命实验方法如下：样品：MabSelectSure（LX）的收集样品，脱盐后。层析条件：按照已经优化的条件再生：0.1M醋酸钠（根据条件优化方案可以省略）CIP：1MNaOH15min接触时间使用仪器：AKTAavant25（或150）检测：DBC10%；抗体收率，HCP，ProteinA的脱落，以及工艺中比较难处理的杂质或特殊的残留物的浓度。图16.CaptoMMCImpRes在R=4min时盐浓度、PH与DBC的通过以上指标确定介质的寿命。关系3.抗体或Fc融合蛋白的离子交换工艺开发3.1CaptoS阳离子交换吸附模式（BE）CaptoS是建立在新颖的高流速琼脂（HighFlowagrose）基质平台上的层析介质。这个介质结合了高机械性和高动态载量和快速传质的性质，以及快速纯化，能满足灵活工艺设计和最大限度的成本效益要求。在此Capto系列层析介质平台中还有高分辨率的CaptoSPImpRes。高分辨率是针对于HCP、图17.CaptoadhereImpRes的DBC与保留时间的实验结ProteinA以及聚体的。果3.1.1CaptoS的动态载量实验洗脱条件的选择，除了上述的产品质量指标外，还抗体的PI一般在6-9左右，不同FC-融合蛋白的PI需要考虑后续步骤的衔接，最好选用可以直接在阴不同。Capto系列介质具有高动态载量的特性。影离子交换上流穿的条件。响Capto系列层析介质的DBC的因素有：上样的电导率、pH、保留时间，以及样品浓度。按照QBD的3.1.3再生实验要求，一般使用Predictor96孔板做工艺设计空间的CaptoS的再生实验一般采用高盐再生。探索，使用HiScreen柱做操作空间的探索。采用DOE做pH、电导、保留时间、样品浓度的设3.1.4CIP实验计。CaptoS的CIP实验一般采用NaOH做CIP，清洗沉淀蛋白、杂质、内毒素等。CaptoS可以在1MNaOH实验材料与方法：40°C储存1周没有离子载量的变化，所以CaptoS实验材料：PredictorCaptoS2ul在1MNaOH稳定。对于不同的样品可以使用样品：MabSelectSure洗脱的收集液经过脱盐处理，0.5-1MNaOH做CIP。更换为平衡液pH。探索条件：3.1.5寿命实验pH:根据抗体的pI选择平衡缓冲液pH，采用BE模CaptoS的寿命实验，使用样品为MabSelectSure式时，缓冲液pH低于PI；例如：20mM柠檬酸钠洗脱后，经低pH灭活，更换缓冲液后的样品。寿pH4-6，命实验方法同MabselectSure的实验方法。保留时间：2、4、6min盐浓度：5-15ms/cm检测：UV2803.2CaptoQ阴离子交换流穿模式（FT）计算公式：CaptoQ是Capto系列层析介质的阴离子交换介Q=（Ci-CFT）XVs/VM质。在抗体和FC融合蛋白纯化工艺中CaptoQ阴离Ci:上样浓度；CFT：流穿浓度；Vs：样品体积子交换一般使用流穿模式，主要目的是去除DNA、VM：介质体积病毒以及HCP以及脱落的proteinＡ（PI4.86）。应用文献28-4078-17AA探索了CaptoS的DBC根据抗体或Fc融合蛋白的PI选择缓冲液的pH、电的影响条件,如图导以及上样量。实验材料与方法：同CaptoAdhere的实验方法。再生、CIP以及寿命实验的探索方法同CaptoAdhere。3.1.2CaptoS洗脱实验CaptoS一般上样后使用平衡缓冲液清洗未吸附的样品，然后使用线性盐梯度洗脱或提高pH洗脱样品。实验材料与方法：实验材料：HiScreenCaptoS层析柱使用仪器：AKTAavant25（或150）自动缓冲液配置和UnicornDOE功能上样条件以Predictor的筛选结果洗脱条件：0-100%Nacl盐浓度洗脱，（一般抗体的洗脱的盐浓度在0.3-0.5MNacl以下，所以为了节省时间，也可以0-50%线性梯度），或根据PI选择pH洗脱范围。检测：proteinA残留，聚体残留以及HCP的残留，单体的收率。图18.电导率、pH以及保留时间对CaptoS的DBC的影响筛选较高载量的条件以备探索洗脱条件。4.如何选择适合于抗体和Fc融合蛋白4.2工艺放大的可行性的生产工艺在纯化工艺放大时，选择可以线性放大的步骤，尽量避免线性放大时的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，这些问题包括：a.合适柱高；例如：传统的SepharoseFast4.1产品质量Flow的层析介质在实验室可以使用在从实验室工艺中选择合适抗体或Fc融合蛋40-50cm以上的柱高。但是随着层析柱的放白的生产工艺是关键的因素是产品质量。而生产工大，超过300mm直径时，柱高在30cm以艺的稳定性直接影响产品质量的高低。上时，层析介质的耐受压力会有问题。所以抗体或Fc融合蛋白的产品质量主要的指标一般为：一般实验室探索工艺时，柱高在10-20cm。纯度：单体的纯度>99%新一代Capto系列的层析介质可以耐受更杂质：多聚体：<1%，高的压力。但是实验室的使用在最好在DNA<100pg/剂，10-20cm。HCP<100ppm,b.合适流速或保留时间；在实验室探索工艺时ProteinA<10ppm以及产品相关的变构体的含量，内毒素等指标。可能使用较高的流速或较短的保留时间。在放大生产时，可能由于流速过大，造成超压。实验室工艺探索完成后，选择合适的生产工艺c.尽量选择步级洗脱方式。因为步级洗脱的样一般是一个各项指标平衡的过程。需要考虑：品浓度较高，操作方便。a.在条件较宽范围下质量最高，例如：缓冲液pH、电导、上样量、洗脱梯度等。一般4.3生产效率以及成本杂质残留控制指标在要求的50%以下。一生产工艺的经济性也是必须考虑的问题，工艺般在放大的过程中，可能有些杂质的残留的步骤：两步法的成本会比传统的三步法的成本低；会升高。耐碱层析介质的寿命，以及CIP成本就比不耐碱的b.产品收率最高等纯化条件。层析介质的成本低；缓冲液的选择，通过DOE实验c.减少纯化步骤，尽量减少纯化之间的衔接避免选择昂贵的试剂等；如果抗体样品不稳定，尽步骤，如：脱盐，缓冲液更换，浓缩等。量选择适当的方法筛选低成本的添加剂以及浓度。这些都是降低成本的方法。参考文献：请至GE医疗生命科学部全球网站：www.gelifesciences.com按编号检索文中所列应用文献更多相关信息，请访问GE医疗生命科学部官方网站：www.gelifesciences.com.cn或咨询GE医疗生命科学部热线：800-810-9118