qPCR原理与分析方法 PPT课件

―qPCR系统从RNA提取到荧光定量内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法简介相对定量分析方法简介实时定量PCR技术的概念实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的分析对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时荧光定量PCR技术涉及的概念扩增曲线荧光阈值Ct值扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件扩增曲线荧光信号的域值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值荧光域值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性Ct值定量数学原理理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数Ct值定量数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率Ct值定量数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）CyclenumberFlourescencCk104Ck102SampleCyclenumberLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系Ct值定量数学原理LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）mRNA表达的研究：如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析DNA拷贝数的定量：如易位基因的检测单核苷酸多态性（SNPs）分析基因型分析：杂合或纯合子临床检测：病毒感染的定量监测实时荧光定量PCR技术的应用内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介非特异性荧光标记：1.SYBRGreen特异性荧光标记：2.TaqMan3.MolecularBeacon常用荧光标记方法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan方法TaqMan探针工作原理标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂分子信标(MolecularBeacon)SYBRGreen法反应示意图SYBRGreenSYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光SYBRGreen法SYBRGreen结合到DNA小沟部位示意图几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 ；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物SYBRGreen法的应用Sample25定量的方法Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线—分析产物的特异性融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物融解曲线分析SYBR法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法SYBR法实验流程及注意事项样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的RNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：100－200bp反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析反应体积＞5ul，推荐20－50ulMg2＋调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90％－110％重复性：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求误差控制仪器介绍上机试剂选择RT样品制备模板准备数据分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法实验流程及注意事项数据分析仪器介绍分析方法上机RT样品制备模板准备相对定量：2－△△Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介绝对定量简介标准样品的制备绝对定量简介拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=10－1/斜率，理论的扩增效率理论值应该为2，即每一个循环的PCR产物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，优化的标准曲线斜率应该为－3.32E用每个循环扩增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循环有95％模板被扩增扩增效率概念绝对定量简介绝对定量举例：HBV病毒检测Sample:HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106copies/mlcopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10BLANKNoneNone实验数据：绝对定量简介标准曲线制作举例扩增效率（E）计算E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03E%=(2.03-1)×100%=103%标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988标准曲线制作举例如未知样本Ct为20.5标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52X=20.5-37.517-3.1726=5.36QuantityUnknown=105.36=229087copiesy=-3.17x+37.52R2=0.9988内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介分析方法：2－△Ct2－△△CtPfaffi法相对定量简介应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化2－△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化比率（处理后/处理前）＝2－Ct（处理后）－Ct（处理前）＝2－△Ct＝2－（16－18）＝42－△Ct法：假设扩增效率（E=10－1/斜率）为2（即每个循环模板量翻倍）实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)1816所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高4倍2－△△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％，且相对偏差不超过5％△Ct（处理前）＝18－17＝1△Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）＝5.3所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△CtPfaffi法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E（J）18161717.41.951.95Pfaffi法：假设目标基因和参照基因扩增效率不同，但目标基因间的扩增效率相同E（G）1.91.9比率处理后/处理前＝E（参照基因）△Ct（处理前－处理后）E（目标基因）△Ct（处理前－处理后）＝1.9（18-16）1.95（17-17.4）荧光定量常见问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 分析问题原因解决方法重复性差试剂得混合或解冻不当在应用RealMasterMix前彻底解冻和混匀20×SYBR溶液见光分解20×SYBR溶液避光保存20×SYBR聚合或解冻不当应用20×SYBR前应将其平衡至室温，彻底混匀，混匀后勿将其至于冰上非特异扩增引物浓度过高降低引物浓度UNG/UDG处理温度高于40℃UNG/UDG处理温度低于40℃引物退火温度不合适利用温度梯度PCR寻找最佳退火温度灵敏度低操作 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 和操作仪器不配套严格按照相应仪器说明书操作模板变性不彻底适当延长第一阶段的变性时间信号/噪音值低20×SYBR溶液见光分解20×SYBR溶液避光保存标准曲线上的各个点Ct间隔不均匀较低程度污染UNG/UDG处理温度低于40℃移液器操作不当准确操作移液器，精确转移