核酸适配体ppt课件

APTAMER适配体*Aptamers(fromtheLatinaptus-fit,andGreekmeros-part) 核酸适配体（NucleicAcidaptamers） 多肽适配体（Peptideaptamers）*什么是核酸适配体？ 核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合的，人工合成的核酸。它可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。 *核酸适配体概念的提出 1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。*支持RNA为生命起源假说的可能证据： 如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物； 如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的"痕迹"； 如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。*生命活动的基础是什么？--Binding! 如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那我们就向证明"RNA起源说"迈出了一步。 1990年，两个研究组几乎同时用T4DNApolymerase与几种有机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种RNA叫做aptamer。 1992年Ellington和Szostak又用相似的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 筛选出了可以和靶分子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。1TuerkC,GoldL.1990.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science249:505–10；2EllingtonAD,SzostakJW.1990.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346:818–22*自然界中Aptamer存在的证据：Riboswitches Riboswitches:theoldestmechanismfortheregulationofgeneexpression 核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家Ronald  Breaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配体结合，通过构象变化调控目的基因转录或 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 的RNA结构元件。*Aptamer巨大的应用前景 APTAMERS:ANEMERGINGCLASSOFTHERAPEUTICS（.Annu.Rev.Med.2005.56:555–83） AnalyticalApplicationsofAptamers(AndrewD.Ellington.AnnualReviewofAnalyticalChemistry(2008).Volume1,Jul2008)*核酸适配体的第一个临床应用 2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变（Age-RelatedMacularDegeneration，AMD）患者的视力缓慢丧失。 Macugen是一种选择性血管内皮生产因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）拮抗剂。*核酸适配体的化学本质与识别机理 核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stemloop)、G2四分体(G2quartet)等稳定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和力和高特异性。 经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值多在pmol/L-nmol/L之间。***图1：凝血酶ssDNA-aptamer主要由29个脱氧核糖核苷酸组成，形成了含有两个G-四分体结构的特殊三维结构图2：凝血酶aptamer与凝血酶的结合主要是通过aptamer特殊的G-四分体结构与凝血酶侧链上的Arg126、Lys236、Lys240和Arg93，这几个在生理条件下带正电荷的氨基酸之间的静电相互作用。*StructureofanRNAaptamerspecificforbiotin.Theaptamersurfaceandbackboneareshowninyellow.Biotin(spheres)fitssnuglyintoacavityoftheRNAsurface*核酸适配体的筛选策略 核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)）来完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右．将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。*SELEX筛选流程 首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法； 其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡核苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要的T7RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后，将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。 然后，通过PCR或RT-PCR等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库再与配体结合，反复多次循环，随着每一轮筛选条件的不断提高，与靶目标高度特意结合的DNA或RNA分子呈指数增长，而亲和力低的序列逐步被淘汰，直到获得合适的序列。*筛选流程图*核酸适配体筛选中的分离方法 毛细管电泳 超滤离心膜分离法 硝酸纤维素膜分离法 亲和介质分离用SELEX技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。主要分离方法有：*毛细管电泳 毛细管电泳的原理是基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同而进行分离，在电场中，待分离组分在50~75μm内径的毛细管中因荷质比差异导致不同的迁移速度而得到分离，当靶分子与其aptamer亲和作用足够强,形成的复合物足够稳定时，在合适的分离和检测条件下，可分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰。*超滤离心膜分离 超滤离心膜有两部分组成，一部分为滤膜滤芯．另一部分为套管，进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液体加在滤芯上．通过高速离心将不与靶标结合的游离寡核苷酸滤掉，将与靶标特异性结合的ssDNA留在超滤离心膜上。超滤滤离心膜在SELEX技术中的应用可以满足分离要求，而且操作简便。*亲和介质分离 一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。 如J.ColinCox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌酶适配体的自动化筛选。具体流程为：通过链酶亲和素与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到两天的时间就完成了12轮的筛选。*核酸适配体的应用 核酸适配体在分析化学中的应用 核酸适配体与疾病诊断和新药研发*核酸适配体在分析化学中的应用 靶物质的分析与检测该方面应用的基本思路是将各种 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基团，如荧光试剂，定点标记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使aptamer与靶物质发生相互作用，再通过对报告基团的信号检测实现对靶物质的定性检测或定量分析。Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)。他们将凝血酶aptamer的5´和3´端分别标记上荧光素和猝灭剂，凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生能量转移而观察不到荧光；在结合凝血酶后aptamer分子构象改变，致使MAB的荧光素与猝灭剂分开从而可以检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度的增加荧光强度增强。* 蛋白质检测Lindner等发展了一种基于aptamer芯片的蛋白质检测方法，将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体分别固定在芯片上，然后将IgE与其温育，发现aptamer对IgE的特异性和敏感性比IgE抗体更好。该方法对IgE的检测限达到10ng/ml。Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸aptamer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋白质组学研究的发展起到重要作用。* 基于适配体的生物传感器是用适配体作为识别元件来特异性地检测其相应的靶物质。 目前适配体生物传感器（Aptasensors）尚处于起步阶段。ChunyanYao等将IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传感器阵列，建立了适配体压电石英生物传感器模型，用于特异性检测 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液和人血清中的IgE。该方法最低可在标准和人血清溶液中分别检测出2.5-200ug/L的IgE，整个检测时间只需15min，而且固定在金膜表面的适配子在反复洗脱后并不影响其灵敏度。* 针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合,而带有正电荷的PDDA会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集,从而颜色由红变蓝实现比色法测定*利用核酸适配体与铅和汞分别形成G-quartet结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定* 钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的G-quadruplex二级构型并对此结构有一定的稳定作用,因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测*在不存在双酚A的情况下,核酸适配体吸附在金纳米粒子表面,使其不受金属离子的聚集作用,当溶液中存在双酚A,适配体与双酚A特异性结合,金纳米粒子失去了核酸适配体的保护在金属离子的作用下发生聚集,颜色由红变蓝,可以通过肉眼判别实现对双酚A的检测。该方法的检测限可达0.1ng/mL*基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片及原理图*核酸适配体与疾病诊断和新药研发 疾病诊断SELEX在疾病诊断与成像方面显示出巨大的应用潜力，已有荧光标记的抗人凝血素核酸配基用于体内诊断的报道。作为示踪剂．寡核苷酸适配子具备了作为导向剂所需的所有特性，其分子可结合放射性核素、毒素等。并递送到靶组织，Hicke等称之为护送适配子(escortaptaraer)．它同时具有直接抑制靶蛋白的功能。是非常有潜力的体内显像和治疗药物。* Non-modifiedaptamersareclearedrapidlyfromthebloodstream,withahalf-lifeofminutestohours,mainlyduetonucleasedegradationandclearancefromthebodybythekidneys,aresultoftheaptamer'sinherentlylowmolecularweight. Unmodifiedaptamerapplicationscurrentlyfocusontreatingtransientconditionssuchasbloodclotting,ortreatingorganssuchastheeyewherelocaldeliveryispossible. Thisrapidclearancecanbeanadvantageinapplicationssuchasinvivodiagnosticimaging.* Schematicrepresentationofthenovelstrategyforinvivocancerimagingusingactivatableaptamerprobe(AAP)basedoncellmembraneprotein-triggeredconformationalteration.TheAAPconsistsofthreefragments:acancer-targetedaptamersequence(A-strand),apoly-Tlinker(T-strand),andashortDNAsequence(C-strand)complementarytoapartoftheA-strand,withafluorophoreandaquencherattachedateitherterminus.Intheabsenceofatarget,theAAPishairpinstructured,resultinginaquenchedfluorescence.Whentheprobeisboundtomembranereceptorsofthetargetcancercell,itsconformationisaltered,thusresultinginanactivatedfluorescencesignal. 湖南大学王柯敏教授，ProcNatlAcadSciUSA.2011Mar8;108(10):3900-5* Severalmodifications,suchas2'-fluorine-substitutedpyrimidines,polyethyleneglycol(PEG)linkage,etc.(bothofwhichareusedinMacugen,anFDA-approvedaptamer)areavailabletoscientistswithwhichtoincreasetheserumhalf-lifeofaptamerseasilytothedayorevenweektimescale.* AnotherapproachtoincreasethenucleaseresistanceofaptamersistodevelopSpiegelmers,whicharecomposedentirelyofanunnaturalL-ribonucleicacidbackbone. AspiegelmerofthesamesequencehasthesamebindingpropertiesofthecorrespondingRNAaptamer,exceptitbindstothemirrorimageofitstargetmolecule.* Inadditiontothedevelopmentofaptamer-basedtherapeutics,manyresearcherssuchastheEllingtonlabandindependentlyanothercompanySomaLogic(Boulder,CO)havebeendevelopingdiagnostictechniquesforaptamerbasedplasmaproteinprofilingcalledaptamerplasmaproteomics.Thistechnologywillenablefuturemulti-biomarkerproteinmeasurementsthatcanaiddiagnosticdistinctionofdiseaseversushealthystates.* 新药研发在新药研发方面，aptamer可以鉴定药物靶标，尤其是多道自动工作站的应用更是加速药物靶标高通量筛选和功能鉴定的进程.Aptamer可以作为药物分子或先导分子．以及作为生物导弹指导靶向治疗．利用SELEX技术筛选获得的针对VEGF的RNA配基(aptamer)，经过美国Eyetech和Pfizer制药公司15年的研制，已经于2004年12月获得美国FDA批准上市，商品名为Macugen，用于老年性视网膜黄斑营养不良(AMD)的治疗。同时，根据aptamer的反义序列设计的antidote还可作为解毒剂与aptamer联合应用，及时清除体内过量aptamer分子，在心血管疾病，抗病毒药物，肿瘤治疗方面都具有广阔的前景．*核酸适配体与抗体的比较与传统抗体相比，核酸适配体具有其无法比拟的性能和优势: 寡核苷酸序列库的筛选是通过化学方法合成的，不依赖于生物体，可以大量的快速的在体外合成； 可以针对不同的目标靶进行筛选，包括生物毒性大分子以及只具有半抗原的分子，且目标范围比较广； 核酸适配体具有和抗体相当甚至更高的亲和性以及较高的热稳定性，变性的适配体也很容易再生； 核酸适配体的纯度高，批间差异比抗体要小； 适配体末端易于连接一些活性基团，容易被固定在基质上，末端指示基团的修饰比抗体容易的多。* 核酸适配体与目标物的结合是依靠四种基本核苷酸组成的结构，与由二十种基本氨基酸残基组成的抗体蛋白质相比，其可能的结合形式远不如后者丰富。这可能会限制高亲和力或特异性核酸适配体的获得。但是，需要指出的是，某些化合物与核酸适配体的亲和力比其已知的单克隆抗体的亲和力高，双酚A就是一个典型例子。* 作为只有几十个核苷酸残基组成的聚合物，核酸适配体的构象受环境条件影响较大，pH值、离子强度、干扰离子等的变化都有可能影响核酸适配体与目标物的亲和力。另外，实际样品中可能存在的核酸酶也可能影响到适配体结构的稳定性。因此，核酸适配体在实际应用中的适应性是一个急需解决的问题。 另外，小分子核酸适配体的常规筛选策略是将小分子固定在固相载体上，利用SELEX技术筛选与固定化小分子有较高亲和力的寡核苷酸。但是，这种连接可能会掩盖或破坏小分子的结构特征或电荷分布，从而使这些寡核苷酸与游离小分子的亲和力可能并不高[53]。解决这一问题的思路之一是尝试研究能够对游离化合物进行适配体筛选的方法。*核酸适配体的前景展望 核酸适体（Aptamer）是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其分子量较低(15-50碱基)，没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用。 但是目前核酸适配体的分析应用仍处于方法学的探索阶段，大部分集中于几个特定靶分子(如凝血酶、ATP等)的分析。核酸适配体的筛选是一个复杂、冗长的过程，影响因素很多，成功率不高。筛选出的核酸适配体链较长，还需进行结构优化、结合机理研究等表征后才能更好的被应用。*基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面开展核酸适体的研究工作： 首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的分析方法。 研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳定性、增加在复杂生物体系中特异性。 注重核酸适配体与其他分析技术的结合以扩展分析范围或提高分析效果，如荧光技术、毛细管电泳、亲和色谱等； 此外，也要针对应用的需要，构建更为方便、使用的核酸适配体筛选方法。*Peptideaptamers Peptideaptamersareproteinsthataredesignedtointerferewithotherproteininteractionsinsidecells. Theyconsistofavariablepeptideloopattachedatbothendstoaprotamerseinscaffold. Thisdoublestructuralconstraintgreatlyincreasesthebindingaffinityofthepeptideaptamertolevelscomparabletoanantibody's(nanomolarrange).* Thevariablelooplengthistypicallycomposedoftentotwentyaminoacids,andthescaffoldmaybeanyproteinwhichhasgoodsolubilityandcompacityproperties. Currently,thebacterialproteinThioredoxin-Aisthemostusedscaffoldprotein,thevariableloopbeinginsertedwithinthereducingactivesite,whichisa-Cys-Gly-Pro-Cys-loopinthewildprotein,thetwoCysteineslateralchainsbeingabletoformadisulfidebridge.*参考文献 [1]TuerkC，GoldL.Science，1990，249：505-5l0 [2]李晓佩，杨良嵘，黄昆等.核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展.化工学报，2013,64(1):233-242 [3]EllingtonAD，SzostakJW．InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands[J]．Nature，1990，346:818-822 [4]BurgstauerP，GirodA，BlirldM．DmgDiscoveryT0day，2002，7(24)：122l-1228 [5]王巍，贾凌云.适配体筛选方法研究进展.分析化学评述与进展，2009,37(3):454-460* [6]LiJW，FangXH，TanWH．Biochem．Biophy.Res．Commun.2002,292:3l-40 [7]谢海燕，陈薛钗，邓玉林.核酸适配体及其在化学领域的相关应用.化学进展，2007,19(6):1026-1032 [8]黄思敏，许杨.核酸适配子SELEX技术筛选研究进展.中国公共卫生，2008,24(1):112-113 [9]StadtherrK，WolfH，LindnerP.AIlal.Chem.2005,77(11)：3437-3443 [10]康燕.基于核酸适配体的生物传感器的研究.湖南：湖南大学，2008.* [11]JiangY,FangX,BaiC.Signalingaptamer/proteinbindingbyamolecularlightswitchcomplex.AnalyticalChemistry,2004,76(17):5230-5235 [12]王红梅，余若祯等.核算适配子的研究进展与应用展望.环境与健康杂志，2008,25(6):558~560 [13]徐敦明，吴敏，邹远等.核酸适体技术在食品安全分析中的应用.分析化学，2011,39(6):925-933*此 课件 超市陈列培训课件免费下载搭石ppt课件免费下载公安保密教育课件下载病媒生物防治课件 可下载高中数学必修四课件打包下载 下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！**图1：凝血酶ssDNA-aptamer主要由29个脱氧核糖核苷酸组成，形成了含有两个G-四分体结构的特殊三维结构图2：凝血酶aptamer与凝血酶的结合主要是通过aptamer特殊的G-四分体结构与凝血酶侧链上的Arg126、Lys236、Lys240和Arg93，这几个在生理条件下带正电荷的氨基酸之间的静电相互作用。*