体外泛素化标准流程

体外泛素化标准流程InvitroubiquitinationassayA.Total15ulReactionsetupRxn-mix(ul)E1-mix(ul)5xBuffer2.01ATP(100mM)0.5-Ub(10mg/ml)1.0-UbcH7(~10mg/ml)0.5-E1-0.5E3Sf1(5ul)Sf2(3ul)5.0-Compounds(5-10uM)+(finalDMSOcanbeupto20%forSmurfs)dH2Oadjusttototal15ulB.Mixreaction-mixbyvortexbrief...

InvitroubiquitinationassayA.Total15ulReactionsetupRxn-mix(ul)E1-mix(ul)5xBuffer2.01ATP(100mM)0.5-Ub(10mg/ml)1.0-UbcH7(~10mg/ml)0.5-E1-0.5E3Sf1(5ul)Sf2(3ul)5.0-Compounds(5-10uM)+(finalDMSOcanbeupto20%forSmurfs)dH2Oadjusttototal15ulB.Mixreaction-mixbyvortexbriefly,spindownandaliquotappropriateamountbaseoncalculationinto1.5mleppendorftubecontainingSmurfs.Mixreactionbytapping.Addequivalentamountofcompoundsandmix.C.PipetteE1into5xBufferinaseparatelabeledtube(E1-mix),mixproperlyandspindown.AliquotE1tothelidofthe1.5mltubeandclosegently.Spinalltubesatthesametimeandincubateatroomtemperature(labbench)for1hour.Terminatereactionbyaddingsamplebuffer.Eitherstoreawayimmediatelyat–20Corboilfor4minat95C.Resolveon7.5%SDS-PAGEandincubateinAnti-Ubantibody(1:2000).1xBuffer50mMTris-ClpH7.52mMATP(supplementto5mMbeforethereactionisinitiated)10mMMgCl250uMDTTStock5Xbuffer250mMTris-ClpH7.510mMATP50mMMgCl2250MDTT

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