《hpv培训》ppt课件

HPV分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能HPV基因分型检测HPV发展进程70年代德国人哈拉尔德·楚尔·豪森提出人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系1995年国际癌症学会确定：人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因。2008年10月6号哈拉尔德·楚尔·豪森获得诺贝尔奖。宫颈癌生物学病因研究的进程子宫颈癌唯一病因明确唯一可以早期发现和治疗唯一可望消灭HPV感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，CIN和宫颈癌预防HPV感染就可以预防宫颈癌没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌我国宫颈癌流行现状我国妇女患宫颈癌的比例15/10万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家目前患者约40万，每年新增15万，据女性生殖道肿瘤首位我国的宫颈癌死亡率为11.34%，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首我国已婚女性HPV感染率在10%左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，不少于1亿HPV病毒学基础知识小环状双链DNA病毒2.直径50-55nm3.癌基因E6E71466低危型HPV高危型HPVHPV16L1:主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分L2:次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏E2基因的结构）时失活HPV的主要致癌基因E6通过抑制p53而阻断凋亡E7通过抑制pRB使细胞周期失控X生殖道HPV感染高危型HPV感染通常没有症状，为一过性并可自愈。90%以上的病人两年内可痊愈。常见其他亚型继发或并发感染——多重HPV亚型感染极为常见自然免疫力差–感染后只有50%-60%的女性产生抗HPV抗体，因此对同种基因型的HPV可再度感染！E6&E7E2良性湿疣在上皮分化的终末阶段L1&L2开始表达，并组装形成病毒衣壳→最后完整的病毒颗粒从细胞内释放出来大量E4聚集→溶解细胞骨架蛋白→呈现挖空细胞的外观低水平表达，以维持病毒基因组和细胞的生长负性调节E6&E7保持细胞的分化和成熟确保能够产生完整的病毒颗粒一过性HPV感染E6&E7在细胞发生恶变时丧失分化的能力→不同程度的细胞不成熟性DNA多倍体的出现→核的非典型性持续的增生能力→分裂相增多高级别CIN蛋白表达水平增高凋亡被阻断、细胞周期失控细胞开始发生恶变在病毒整合时被破坏持续性HPV感染E2宫颈癌防治现状宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，也是严重影响妇女身心健康，威胁妇女生命的重要原因之一。流行病学的调查显示，从50年代以来，由于子宫颈细胞学的广泛应用，全球子宫颈癌的发病率明显下降，但在发展中国家仍居妇科恶性肿瘤首位调查数字显示：我国25岁以上的妇女中，有超过70％的人数从未做过宫颈防癌检查！！！筛查的重要性宫颈癌筛查不只是医师行为，更是政府的职责，是艰难的系统 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 我国目前不可能做到像美国、澳大利亚那样建立规范化的筛查 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 可以根据各地情况做区域性筛查，定点筛查，机会性筛查所有到妇产科门诊就诊者和各种体检者，都应做子宫颈细胞学检查/HPV检查，这需要妇产科医生的工作之一高危人群者更应行定期的检查和随诊筛查的目的是识别和检出子宫颈癌前病变，而不是子宫颈癌；子宫颈癌多半有症状，是及时诊断问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 子宫颈癌在癌前病变未被诊断，是没有进行检查和筛查：1/4患者从未进行细胞学检查1/4患者子宫颈癌前5年未进行细胞学检查筛查的准确性取决于：筛查方法的敏感性、特异性细胞学和HPV检查质量子宫颈癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并症。准备怀孕时仍要按照规范进行定期的细胞学检查。如孕前有高危因素，建议孕期及产后定期做宫颈细胞学检查。怀孕过程中若出现异常症状至医院就诊，由医生根据情况决定是否进行细胞学检查以及如何处理。妊娠期也应进行宫颈癌筛查筛查应从何时开始？性生活开始后3年左右不晚于21岁PracticeGuidelinesinOncology,2004,NCCN何时终止筛查？年龄>70岁，在10年内已有3次以上之满意的细胞学检查正常者，可停止筛查。但若无上述筛查历史，或有不正常者，则建议继续筛查。有宫颈癌历史、雌激素暴露、免疫功能障碍（HIV＋），应继续长期筛查。PracticeGuidelinesinOncology,2004,NCCN筛查的时间间隔传统细胞涂片检查 每年一次TCT 每2年一次30岁以后，连续3次正常者，每2-3年一次FDA批准HPVDNA检测用于30岁以上的妇女联合细胞学检查同时使用细胞学和HPVDNA检测同时为阴性，筛查间隔可以3年一次注意对HPV感染的评估PracticeGuidelinesinOncology,2004,NCCNHPV检测应用于宫颈癌筛查HPV病毒的发现—明确高危型HPV病毒持续感染为宫颈癌治病因高危型HPV感染通常为一过性感染并可自行清除但如自身免疫力较差，则会造成持续感染不同地区人群的宫颈癌患者中感染的HPV型别不同不同HPV型别致病类型及强弱不同HPV检测的临床应用细胞学结果为ASC的病例管理宫颈病变手术的术后随访与细胞学联合，应用于30岁以上女性的宫颈癌筛查指导HPV疫苗的使用（两种疫苗：4价、2价疫苗针对16/18）现有的HPV疫苗只能对HPV16、18、6、11型这四种型别的感染进行预防，且都以国外的研究数据进行研发对于中国女性的HPV感染型别的研究，有助于研发适合于中国女性的HPV疫苗美国ASCCP2006年版HPV（+）及细胞学正常HPV16/18(+)其他高危型阳性阴道镜重复细胞学和HPV检测（间隔12个月）两者均阴性细胞学阴性HPV（+）阴道镜细胞学异常HPV（±）参照ASCCP指南常规筛查（3年后）美国ASCCP：≥30岁妇女的宫颈筛查中联合筛查更为重要HPV(-)TCT(-)HPV(+)1年重复TCT和HPV检查都为(-)TCT(-)HPV(+)TCT(+)不管HPV是否正常3年常规筛查阴道镜3年常规筛查TCT结果为ASCUS及其以上病变按ASCCP指南处理TCT与HPV检测的联合应用于宫颈癌筛查TCT与HPV检测联合使用几乎可以100%防止漏诊，同时也可监测HPV感染的转归现有HPV疫苗仅针对四种型别HPV病毒的感染，更多的HPV型别感染仍需通过定期的联合筛查来防治临床处理仍需遵循TBS诊断结果和三阶梯诊治流程TCT联合HPV检测有助于宫颈病变的个体化处理美国ACOG2009年版2009年11月20日,美国妇产科大学（ACOG）发表关于宫颈癌筛查的最新指南意见对于30岁以上的妇女，最佳的筛查方式是同时进行细胞学筛查（TCT）和宫颈HPVDNA检测如果两项结果都正常，属于宫颈癌的低危人群，筛查的间隔最好在三年以上HPV分型检测分型才能区分持续或反复感染分型才能区分单一和多重感染后者危险更大不同型别不同的患病风险致病性差异不同型别不同的处理 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待不同HPV感染型别要区别对待根据ASCCP指南，细胞学阳性，HPV16、18阳性可选择阴道镜检不同型别不同的致病类不同型别转归和愈后不同*美国ASCCP2006版Pap阴性HPV阳性HPV阴性三年内复检双相检查16/18基因分型阳性阴性阴道镜检查一年内复检双相检查HPV分型检测应用（1）------筛查WHO建议HPV-DNA检测不能用于30岁以下的女性。HPVDNA检测虽然对HPV很敏感，但是并不能预测它的病程和发展，要预测高危HPV是否可致癌，需要作基因分型测试虽然复查显示同型HPV阳性，但不能预料这个女性的宫颈疾病病程。——仅增加了危险性23890(筛查人数)细胞学(-)HPV(-)21409细胞学(+)HPV(-)488细胞学(-)HPV(+)370细胞学(+)HPV(+)523阴道镜检查533无病例发现发现3例发现59例发现114例HPV分型检测应用（1）------筛查北美和欧洲的筛查研究显示，在≥35岁的女性人群中，HPV试验检测≥CIN2病变的敏感性和特异性分别为95%和93%。细胞学检查发现≥ASCUS的敏感性和特异性分别为60%和97%联合使用HPV检测和细胞学检查的敏感性比单独使用任何一种都显著提高，阴性预测值达99%-100%HPV分型检测应用（1）------筛查HPV分型检测应用（2）------阴道镜适应征≧30妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，HPV16，18建议阴道镜。2006consensusguidelinesformanagementofwomenwithabnormalcervicalcancerscreeningtestswww.AJOG.ORGPap阴性HPV阳性HPV阴性三年内复检双相检查16/18基因分型阳性阴性阴道镜检查一年内复检双相检查波特兰的一项研究表明，≥30岁细胞学阴性的女性中，HPV16或18阳性的女性在10年随访中出现CIN3的比率分别为21%和18%。与此相比，其他高危型HPV阳性的女性中，CIN3的风险性仅1.5%。HPV分型检测应用（2）——阴道镜适应征Plummeretal10058例宫颈癌，8550宫颈鳞癌，1508宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌HPV16感染与宫颈癌的相关具有普遍意义宫颈鳞癌：HPV16占46-63%；HPV18占10-14%宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌：HPV18占37-41%；HPV16占26-36%。HPV分型检测应用（2）——阴道镜适应征CIN2\3HR-HPV:94.0%常见亚型：HPV16、33、58、31和52型LogisticRegression分析：HPV16、33和31与CIN2\3相关，是主要致病型——国家十五科研攻关项目HPV分型检测应用（2）——阴道镜适应征四种HPV亚型在≥30岁妇女宫颈癌筛查中的作用HPV16亚型在≥30岁妇女宫颈癌筛查中的作用2009年（ASCCP）最新HPV检测指南HPV阳性及细胞学正常HPV16/18(+)其他高危型阳性阴道镜重复细胞学和HPV检测（间隔12个月）两者均阴性细胞学阴性HPV（+）阴道镜细胞学异常HPV（±）参照ASCCP指南常规筛查（3年后）HPV分型检测应用（3）------ASCUS分层ASC病例的管理(2006ASCCP)大于20岁人群6个月后重复细胞学检查高危型HPV检测（可以用残留的液基做）阴道镜检查（40-60%）2006consensusguidelinesformanagementofwomenwithabnormalcervicalcancerscreeningtestswww.AJOG.ORGHPV分型检测应用（3）------ASCUS分层316例ASCUS患者中,CINⅡ级以上的阳性检出率为18.99%（60／316）,宫颈细胞学诊断为ASCUS中,HR-HPV阳性率为68.99%（218／316），ASCUS组中HR-HPV阳性患者CINⅡ级以上宫颈病变的检出率高于HPV阴性者，差异有统计学意义（P<0.001）HPV分型检测应用（4）------绝经期妇女LSIL2006consensusguidelinesformanagementofwomenwithabnormalcervicalcancerscreeningtestswww.AJOG.ORG“reflex”HPV检测6和12个月时细胞学阴道镜HPV阴性或阴道镜未发现CIN12个月时细胞学是推荐的HPV阳性或细胞学≥ASC-US阴道镜是推荐的HPV阴性或连续2次细胞学“阴性”常规细胞学筛查是推荐的消融或切除治疗CIN失败的比率在1%~25%之间。系统性的综述表明，不同方法的整体失败率为5%~15%，不同方法间无显著差异。大多数失败发生在治疗2年后。一个系统性综述报道，在治疗后20年内女性浸润癌的罹患率约10万分之56，高于美国普通人群（5.6每10万人年）。HPV分型检测应用（5）------宫颈病变的随访治疗后随访中应用HPVDNA检测的系统性综述表明，其性能优于细胞学随访方法。治疗后6个月HPV检测鉴别复发/持续性CIN的敏感性达90%，而且保持这种水平到24个月。与此相比，细胞学的敏感性大约为70%。一些研究（不是所有研究）中，联合使用HPV检测和细胞学可以增加敏感性。HPV分型检测应用（5）------宫颈病变的随访对细胞学ASC-US、ASC-H或LSIL的CIN1推荐的管理方案是，12个月时HPVDNA检测或6个月、12个月时重复细胞学检测对CIN2、3女性治疗后的管理方法包括6-12个月时进行HPVDNA检测、单独6个月采用细胞学或联合使用细胞学和阴道镜HPV分型检测应用（5）------宫颈病变的随访AIS的管理方案6个月时联合使用细胞学HPV检测宫颈管采样阴道镜HPV分型检测应用（5）------宫颈病变的随访HPV分型检测应用（6）------指导疫苗的使用疫苗是模拟HPV16/18的L1蛋白衣壳（一种病毒样颗粒-病毒脂蛋白）给HPV阴性的女性接种这两种疫苗后，有90%以上的人不会产生由HPV16/18型引起的癌前病变到目前为止，这种高浓度，长效抗HPV持续感染的预防疫苗才开展了六年如果接受预防者在接种时已经HPV16/18阳性，是否有治疗作用尚未明了下生殖道HPV感染的干预治疗HPV的感染是非系统性感染，只局限于最初的感染的部位，感染部位的局部细胞因子和非特异性的效应细胞，如单核细胞、巨噬细胞和NK细胞是阻止感染的第一道防线。宣讲相关知识，调动患者免疫功能增强生殖道局部免疫力，可加速对HPV的清除用避孕套控制HPV在性伴间传播是有效和必要的HPV是人类癌瘤发病中唯一可以完全确认的致癌病毒。现今的研究甚至可以证实：预防HPV感染就可以预防宫颈癌，没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌。HPVDNA检测常用技术　HPVDNA检测技术常用方法：其他方法：普通PCR，原位杂交，SPR，DNA测序等基因芯片技术二代杂交捕获荧光定量PCR(一)基因芯片技术玻璃芯片膜芯片流式荧光杂交法（液态芯片）固相芯片玻璃芯片与膜芯片（固相芯片）玻璃芯片应用领域：主要用于科研领域，如基因表达谱分析、基因多态性分析、大规模序列分析、药物筛选、基因诊断的研究等目前仅极少数用于临床检验等领域局限：制作工艺相对复杂信号检测需专门的仪器设备（激光扫描仪）阅读设备的成本局限（费用高昂）应用领域：高密度芯片目前仍主要用于科研领域低密度芯片已经用于临床检验领域低密度芯片的特点：工艺相对简便信号检测简便投入费用较低现状：目前临床检测中，往往还不需要使用到大规模探针阵列，从实用性、使用成本、方便性等角度考虑，低密度芯片（十几个至几十个探针）更易于被接受膜芯片亚能HPV基因芯片检测系统PCR扩增结合DNA反向点杂交技术灵敏度更高实验室设置及操作流程应当符和规范PCR的检测结果是可靠的检测通量大，可同时检测15种HPV亚型，包括13种高危型探针设计，特异性强膜条显示检测结果，读取更方便采用dUTP-UNG防污染体系，有效避免假阳性结果检测数量随需而变，单人份、多人份检测任选有力的临床试验数据证明WHO国际癌症研究所在中国的研究项目显示，亚能对于高度病变的检测灵敏度达100%、阴性预测值达99.7%，特异性、准确性和阳性预测值和都很高。对约3000人份的临床数据显示，普通人群的HPV高危型感染率为11%左右，医院高危人群的HPV高危型感染率为20%左右，这与文献报道相当。亚能HPV基因分型技术原理（PCR-反向点杂交法）一次杂交反应可以检测多种靶序列PCR技术KaryB.Mullis（穆利斯）聚合酶链式反应（PCR）：利用DNA碱基互补配对原则及半保留复制的特性，将目的DNA在体外进行大量复制美国PECetus公司的KaryMullis于1983年创建1989年美国《Science》杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首1993年度诺贝尔化学奖PolymeraseChainReactionPCR技术原理高温变性低温退火中温延伸PCR三步曲：PCR产物的生成量以指数方式增加PCR技术特点-高度的灵敏性PCR产物的生成量是以指数方式增加的35轮循环，扩增量理论上达235个拷贝（680亿！）核酸分子杂交核酸分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则退火形成双链的过程。分子杂交具有高度的特异性。探针杂交体亚能HPV基因分型检测流程结果判读HPV16HPV6,52阴性样本单一感染多重感染亚能HPV产品卖点详见F:\英硕力\（三）亚能HPV产品卖点.pptHPV检测耗材列表及示意图详见F:\英硕力\HPV基因分型检测常用耗材图示.doc实验室仪器设备清单详见F:\英硕力\实验室仪器设备清单-20101227.xlsHPV主要竞争产品介绍PCR-反向点杂交法特点高灵敏度-PCR高特异性-核酸分子杂交高通量-膜上固定多种探针安全无毒-生物素标记流式荧光杂交法-液态芯片首先PCR扩增待测样品，得到的PCR产物和微球上交联的探针杂交，加入荧光标记反应，最后在流式荧光检测仪上检测荧光信号。如果PCR产物和探针配对，则微球上相应探针捕获到标有Biotin的PCR产物，加入荧光标记StrepAvidin-PE后，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物。在检测仪上即可检测到对应微球的荧光信号。如果PCR产物与探针不配对，则对应微球的荧光信号为背景信号。流式荧光杂交法操作流程PCR扩增DNA提取编码微球与探针混合向检测板中加入微球-探针杂交液，加入PCR产物PCR产物变性杂交，48℃，30min加入链霉亲和素标记的藻红蛋白，15minLuminex100多功能流式分析仪检测代表厂家：上海透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒检测的基因型：19种高危型：16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,83，26,55,61,66７种低危型：6,11,40,42,44,53,54认证：国食药监械(准)字2009第3400020号进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）流式荧光杂交法HPV61型为低危型！参照：NEnglJMed2003;348:518-27Luminex100TM多功能流式点阵仪流式荧光杂交法-不定量流式荧光杂交法总结结合普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高无洗涤步骤，无法去除非特异性杂交，且有背景荧光信号干扰技术难点为探针与微球的交联，产品性能上存在不稳定性只分型，不定量需价格昂贵的流式荧光检测仪（二）二代杂交捕获——HybridCapture2,HC2基本原理：利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测检测通量：13种高危HPV基因型,不能提示具体的基因型计算机判读15min杂交60min抗体捕获60min第二抗体结合，化学发光30minDNA变性45minHC2实验步骤图示吸取变性剂于对照和样本管中旋涡振荡10秒65℃孵育45分钟，采用MicroplateheaterIHC2操作步骤-DNA变性将已变性的样本混匀，吸取75ul于“杂交微孔板”中20-25℃孵育10分钟加入25ul高危HPV探针于微孔板中65℃孵育60分钟置于RotaryShakerI中，1100rpm，3±2分钟准备HPV探针混合物HC2操作步骤-杂交将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中20-25℃孵育30-45分钟20-25℃孵育60分钟，1100rpm加入75ulDetectionReagent1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中HC2操作步骤-抗体捕获及酶标洗涤微孔板：采用AutomatedPlateWasherI或进行手动洗板，重复洗6次加入75ulDetectionReagent2（化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中20-25℃孵育15-30分钟采用Digenemicroplateluminometer(DML2000)读数HC2操作步骤-洗板及化学显色HC2如何进行结果判读?1、阴性对照每次实验必须同时做3份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250RLU（相对光单位）。变异系数（%CV）应该≤25%，如果＞25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。%CV必须≤25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告2.标准品每次实验必须同时做3份高危HPV标准品。%CV应该≤15%，如果＞15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。%CV必须≤15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告3.用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/MNC比值.2.0≤MHRC/MNC≤15。如果＜2.0或＞15，本次实验结果无效，必须重做。4.如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRCCutoff值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性阳性结果的判定阴性对照（NC）高危HPV标准品(HRC)9731210133591307平均值96318%CV4.94.7HRC/NC3.31质控对照HPV基因型预期的结果（RLU/Cutoff值）最小值最大值QC1-LRHPV60.0010.999QC2-HRHPV1628HC2技术总结技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色不分型不能检测HPV多重感染不定量有交叉杂交反应每次需要消耗8个参考品，试剂成本高手动操作很多，步骤繁琐需价格昂贵的基因杂交信号放大系统(三)荧光定量PCR技术原理：在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程,最后通过标准曲线对起始模板量进行定量分析.定量，不分型荧光基团的分类化学原理荧光定量PCR-基于Taqman探针化学原理荧光定量PCR技术总结能定量检测HPV拷贝数灵敏度高不分型不能检测HPV多重感染检测通量有限，目前最多检测13种高危型需价格昂贵的荧光定量PCR仪（四）原位杂交采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，显微镜下观察结果原位杂交试剂盒代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司原位杂交实验步骤以地高辛标记HPVDNA探针为例4-6mm切片，用处理过的玻片捞片。56-60℃烤片，2-16小时。新鲜二甲苯脱蜡，10分钟×2次。100%乙醇5分钟×2次，空气干燥。加入50ml胃酶工作液，37℃消化30分钟。弃去胃酶工作液，逐级酒精脱水1分钟×3次，空气干燥。加10-20ml探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号ZLI-9601）。变性95℃5-7分钟。杂交37℃2-16小时。揭去橡胶水泥，将切片插入PBS/TBS缓冲液中以便去掉盖玻片，约5-10分钟。每张切片加入2-3滴杂交后洗液，37℃孵育15分钟。PBS/TBS缓冲液洗，1分钟×3次。每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，37℃孵育30分钟。PBS/TBS缓冲液洗，1分钟×3次。滴加适量DAB工作液，镜下观察显色结果，约3-10分钟。弃去显色液，蒸馏水或自来水冲洗。选择：每张切片加入1滴复染剂，5-10秒钟。蒸馏水或自来水冲洗。·脱水、透明、封片。原位杂交技术总结灵敏度低（无PCR扩增）特异性高检测通量低不能分型不能定量操作步骤繁琐非常费时，需要两天HPV检测产品无注册证，仅仅用于科研（五）表面等离子体谐振——（SPR）技术表面等离子谐振现象SurfacePlasmonResonance，SPR入射光(单波长偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激发金膜中的自由电子产生表面等离子体。当光波激发频率与表面等离子体的振动频率相等时，二者发生谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作SPR角（谐振角）。分析SPR曲线谐振角变化芯片表面质量改变(折射率变化)分子相互作用SPR检测核酸原理示意图反应曲线Time(s)SPR角(m°)传感芯片寡核苷酸探针PCR产物变性dsDNAssDNA杂交1）核酸提取试剂2）PCR反应试剂3）SPR检测试剂和芯片北京金菩嘉-HPV分型检测试剂盒组成HPV基因检测芯片，共26个通道，一个阴性，一个IC，24个hpv探针通道2~17：高危HPV;通道18~25：低危HPVSPR检测芯片探针点阵SPRHPV检测芯片通道14151617181920212223242526类型51816835611427044435440阴性通道12345678910111213类型IC161831335258565966455339SPR技术检测HPV流程图样品制备DNAPCR扩增产物线上检测输出报告成品芯片包被分型探针固定包被芯片芯片基片SPR设备简介W2600型生物传感芯片阅读仪W2600 工作流程 财务工作流程表财务工作流程怎么写财务工作流程图财务工作流程及制度公司财务工作流程 开始检测后系统自动进行以下动作：清空机器内部样品匣更换样品匣更换芯片匣清洗采样针、buffer针扫描芯片注入系统buffer注入系统buffer扫描芯片采样等待30min（杂交）扫描芯片输出检测结果SPR技术检测HPV总结同样需要DNA提取采用普通PCR扩增，核酸分子杂交采用SPR技术（物理手段）检测杂交信号无临床应用文献无注册证（六）HPVDNA序列测定经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)与PCR反应类似反应体系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物反应过程：变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧链终止法Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦掺入DNA中，其后延伸反应就不能继续。*少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较双脱氧链终止法测序原理反应体系中含有ddNTPs,因此，在复制的延伸过程中，在DNA任何碱基位置都可能出现终止反应，从而形成不同长度的寡核苷酸混合物。所以，每条寡核苷酸都有固定的起点，但有不同的终点，长度由ddNTPs掺入的位置决定。在高分辨率的电泳条件下（如毛细管电泳），能够将长度相差一个碱基的寡核苷酸分离开。ddNTPs包含4中双脱氧核苷酸，分别带有不同的荧光标记，当带有不同荧光标记的寡核苷酸依据长度大小先后通过荧光检测仪时，检测仪可以自动读取DNA上的核苷酸顺序凝胶电泳DNA在电泳中的迁移率与其片段长度有关，片段小的跑得快，片段大的跑得慢，因而彼此分离开。双脱氧链终止法测序原理示意图DNA全自动分析仪ABI3100遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统377型遗传分析仪DNA提取PCR扩增PCR产物纯化（电泳或专用试剂盒）读取序列及分析测序仪检测产物纯化测序反应HPVDNA测序流程测序法检测HPV的局限性首先必须对待测样本进行PCR扩增，由于事先不知道是哪一种HPV基因型的感染，所以必须采用通用引物进行PCR扩增单一感染（如HPV16）多重感染（如HPV16，18，52，58）鉴定无法鉴定基因型！DNA测序技术总结测序之前必须做对待测样本进行PCR扩增或DNA克隆测序技术的准确性依赖于引物的特异性难以对HPV多重感染进行测序鉴定操作复杂，耗时测序仪价格昂贵国内开展基因测序的机构或企业非常少无注册证，仅仅用于科研各种HPVDNA检测技术总结膜芯片流式荧光杂交法杂交捕获二代荧光定量PCR原位杂交SPR测序原理PCR+反向点杂交+化学显色PCR+杂交+荧光标记杂交+抗体捕获+化学显色PCR+荧光标记杂交+化学显色PCR+杂交+光学检测PCR+双脱氧链终止法探针固定方式固定于膜芯片上固定于微球上不固定无不固定金膜无能否分型分型分型不分型不分型不分型分型分型能否鉴定多重感染能能不能不能不能能难信号检测手段化学显色荧光扫描化学显色荧光扫描化学显色SPR角荧光扫描灵敏度高低低高低无文献高特异度高低交叉反应高高无文献高检测通量高高低低极低高低仪器设备要求低很高很高高低高很高有无注册证有有有有无无无基因芯片技术特点高灵敏度-PCR高特异性-核酸分子杂交高通量-膜上固定多种探针安全无毒-生物素标记二、HPV主要竞争产品基因芯片技术代表厂家：亚能、凯普、达安二代杂交捕获代表厂家：Qiagen（凯杰）荧光定量PCR代表厂家：港龙，达安，凯普，复星，匹基流式荧光杂交法代表厂家：上海透景三、亚能HPV与竞争产品的对比1、亚能和凯普HPV基因分型产品对比2、亚能基因芯片技术与二代杂交捕获对比3、亚能基因芯片技术与荧光定量PCR对比4、亚能基因芯片技术与流式荧光杂交法对比（一）亚能和凯普HPV基因分型产品对比亚能凯普技术原理PCR+反向点杂交PCR+导流杂交（实质也是反向点杂交）经典杂交方法导流杂交是通过外力抽吸加压，人为缩短杂交时间杂交操作时间1份标本　　70min15份75min25份80min48份90min96份100min样本量越多，时间优势越明显！1份标本40min15份60min16~30份60min×231~45份60min×346~60份60min×461~75份60min×576~90份60min×696份60min×7基本设备离心机、PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）离心机、PCR仪、专用杂交仪（价格较贵）样本来源宫颈脱落细胞，疣体组织，病理石蜡切片，液基细胞学样本宫颈脱落细胞、疣体组织亚能凯普DNA提取提取试剂通过国家认证提取试剂只含裂解液一种成分提取试剂盒未通过国家认证提取试剂分溶液Ⅰ,Ⅱ,ⅢPCRPCR反应液已分装扩增体系未分装，人工配制反应液杂交杂交前准备工作简单常规杂交，常态性碰撞接触，多次接触，反应充分杂交仪中空气传导加热，温度均匀、准确，更高特异性独立杂交管内杂交，无交叉污染仪器运转中操作者可休息杂交前准备工作复杂，要通过一系列步骤人工分隔反应室导流杂交，人为外力作用，一过性接触，反应不充分杂交反应室之间温度有差异，特异性较差反应室分隔不严，交叉污染仪器运转中操作者不可休息凯普导流杂交仪亚能凯普洗膜洗膜充分，无杂交背景或浅背景洗膜不充分，且容易造成很深的杂交背景孵育在孵育前无封阻步骤排出封阻液过程缓慢，且封阻效果对显色背景影响很大结果判读显色斑点大判读结果受背景颜色影响小膜条小，显色斑点小判读结果受背景颜色影响大,易造成错误判读检测通量23型无CP8304（81型），低危型21型无HPV73，83，MM4（82）而73、82型为IARC认定的15种常见高危型之一导流杂交法杂交效率和灵敏度膜条基因型特异性探针固定在膜条的特定位置探针只占据膜条面积的极小部分目的DNA在膜条上均匀分布，定向流动，一过性接触！杂交上的DNA只占目的DNA的极小部分杂交效率低，灵敏度低！！目的DNA亚能和凯普膜条显色对比亚能凯普膜条尺寸：12mm×78mm膜条尺寸：22mm×22mm亚能产品与凯普的比较优势使用普通杂交仪可检测更多来源的标本样本越多，时间优势越明显检测23型灵敏度、特异性、准确度高；重复性好交叉污染风险极低，假阳性率低提取试剂，芯片阅读仪均有证PCR扩增体系预分装仪器运转中操作者可休息显色斑点大，易于判读（二）亚能与杂交捕获二代对比项目基因芯片（亚能）杂交捕获技术原理PCR+反向点杂交+化学显色分子杂交＋化学显色，无需基因扩增理论耗时6小时4.5小时标本来源宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学样本等宫颈脱落细胞，液基细胞学样本等基本设备离心机、普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）基因杂交信号放大系统（价格昂贵）试剂盒规格25或50人份/盒96人份/盒项目基因芯片（亚能）杂交捕获杂交时间1－1.5小时1小时检测通量检测23种HPV基因型，18种高危，5种低危检测13种高危型，是否分型分型，确定具体的基因型不能分型，仅提示是否有HPV感染多重感染检测能检测多重感染不能检测多重感染灵敏度≥1000copies/mL≥100000copies/mL交叉杂交无有分批使用可单人份使用,一次可检测标本量96个或更多每次需做8个参考品，分批使用不宜超过4次2003年，美国FDA公布了HC2的四个批次的产品召回通告召回原因：可能产生假阳性结果http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfres/res.cfm?start_search=1&event_id=25678亚能HPV产品与HC2的比较优势检测23种HPV基因型能分型能检测HPV多重感染可检测更多来源的标本对实验室仪器设备要求很低无交叉杂交现象可分批使用，单人份、多人份任选(三)亚能与荧光定量PCR对比项目基因芯片（亚能生物）荧光定量PCR技术原理PCR+反向点杂交+生化显色PCR+荧光标记+发光、读数理论耗时6小时3小时可检测物宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本等宫颈脱落细胞，液基细胞学标本等基本设备普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）荧光定量PCR仪（价格昂贵）检测通量23型2/8/10/13型项目基因芯片（亚能生物）荧光定量PCR是否分型分型，确定具体的基因型不分型，仅提示是否有HPV感染多重感染检测能检测多重感染检测不能检测多重感染检测对照情况有质控对照有阴、阳性对照　分批使用可单人份使用,一次可检测标本量96个或更多　可单人份使用，每次需设置阳性、阴性对照并制作标准曲线(至少4个标准品)亚能产品与荧光定量PCR的比较优势检测23种HPV基因型能分型能检测HPV多重感染可检测更多来源的标本使用普通PCR仪特异性更高可分批使用，单人份、多人份任选代表厂家：上海透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒检测的基因型：19种高危型（16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,83，26,55,61,66），７种低危型（6,11,40,42,44,53,54）认证：国食药监械(准)字2009第3400020号进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）流式荧光杂交法HPV61型为低危型！参照：NEnglJMed2003;348:518-27(四)亚能与流式荧光杂交法对比项目亚　能透　景技术原理基因芯片法流式荧光杂交法操作步骤DNA提取—PCR—DNA杂交—生化显色—判读结果DNA提取-PCR－带生物素标记的DNA与微球上探针杂交－荧光标记－激光判读理论耗时6小时4小时样本来源宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片、液基细胞学标本宫颈脱落细胞标本保存时间室温下放置时间长（8小时）室温下放置时间短（1小时）基本设备离心机、PCR仪、普通杂交仪离心机、PCR仪、Luminex多功能流式点阵分析仪项目亚　能透　景杂交耗时1小时，反应充分30分钟dUTP-UNG酶有无是否洗涤洗涤，去除非特异性杂交不洗涤，有非特异性杂交检测通量检测23种HPV基因型（18种高危型和5种低危型)检测26种HPV基因型（19种高危型和7种低危型，注册证只批检19高危）试剂盒规格　25人份/盒48人份/盒亚能产品与流式荧光杂交法的比较优势对实验室仪器设备要求低可检测更多来源的标本、标本保存时间更长有dUTP-UNG酶防污染体系宫颈脱落细胞采集器有注册证DNA提取试剂通过国家认证