溶血性链球菌的检验

溶血性链球菌的检验 溶血性链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、尘埃、牛奶、粪便及人的咽喉和病灶中，按其在血平板上溶血能力分类，可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型溶血性链球菌和亚甲型溶血性链球菌。 与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，其血清型90%属于A族链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及呼吸道感染，还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发性流行。因此，检查食品是否有溶血性链球菌具有现实意义。（一）形态与染色：1、呈球形或卵圆形，直径0.5µm-1µm链状排列（长短不一）2、革兰氏染色阳性，衰老培养物常成阴性3、无芽孢、无鞭毛、多数无荚膜。1、多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需氧或专性厌氧2、对营养要求高，普通培养基不能良好生长，（需加血清液、腹水等）3、最适温度37℃，pH7.4-7.64、幼龄菌大多可见到透明质酸形成的荚膜，如延长培养时间，荚膜可被细菌自身产生的透明质酸酶分解而消失。5、无芽胞，无鞭毛，有菌毛样结构，含M蛋白，革兰氏染色阳性。（二）培养特性6、在液体培养基中，溶血菌株，呈絮状或颗粒状沉淀生长（上清下浊）；不溶血菌球，均匀浑浊生长，如粪链菌。7、在血平板上，形成灰白色，半透明、表面光滑、有乳光圆形突起的细小菌落，直径0.5-0.75mm，针尖大小，菌落周围出现溶血环。8、链激酶：αβγδ四种溶血。(三)生化特性1、均分解葡萄糖产酸，产酸不产气。2、对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。3、能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶4、A群菌对杆菌肽敏感5、一般不分解菊糖，不被胆汁或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性用来鉴定甲型溶血型链球菌和肺炎球菌。6、链球菌与葡萄球菌不同，不产生过氧化氢酶。（四）致病性链球菌可产生的毒素和酶1、溶血素2、致热外毒素3、透明质酸酶4、链激酶5、脂磷壁酸6、链道酶7、杀白细胞素1、链球菌溶血素：有溶解红细胞，杀死白细胞及毒害心脏的作用，主要有“O”和“S”两种。 对氧敏感链球菌溶血素O，为含-SH基的蛋白质，对氧敏感，遇氧时一SH基即被氧化为-SS-基，暂时失去溶血能力。若加入0.5%亚硫酶钠和半胱氨酸等还原剂，又可恢复溶血能力。 溶血素O能破坏白细胞和血小板。动物试验又证实对心脏有急性毒害作用，使心脏骤停。抗原性强，感染后2～3周，85%以上病上产生抗“O”抗体，病愈后可持续数月甚至数年，可作为新近链球菌感染，或可能风湿活动的辅助诊断。 对氧稳定链球菌溶血素“S”，是一种小分子的糖肽，无抗原性。对氧稳定，对热和酸敏感。血平板所见透明溶血是由“S”所引起，能破坏白细胞和血小板，给动物静注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起肾小管坏死。2、致热外毒素 曾称红疹毒素或猩红热毒素，是人类猩红热的主要毒性物质，会引起局部或全身红疹、发热、疼痛、恶心、呕吐、周身不适。 该毒素是蛋白质，对热稳定，具有抗原性，则产生的毒素能中和该毒素的活性。但可分为A、B、C三种不同抗原性的毒素。无交叉保护作用。该毒素还有内毒素样的致热作用，对细胞或组织有损害作用。3、透明质酸酶：又称扩散因子，能分解细胞间质的透明质酸，故能增加细菌的侵袭力，使病菌易在组织中扩散。4、链激酶：又称链球菌纤维蛋白溶酶，能使血液中纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，具有增强细菌在组织中的扩散作用，该酶耐热，100℃50分钟仍可保持活性。5、脂磷壁酸（LTA）：与细菌粘附于宿主细胞表面有关，大多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有LAT的结合位点。6、链道酶：又称链球菌DNA酶，能使脓液稀薄，促进病菌扩散。主要由A、C、G族链球菌产生。此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，使脓汁稀薄易于扩散。产生的相应抗体有中和该酶的活性。用链激酶、链道酶制剂进行皮肤试验作为测定机体细胞免疫的一种方法。7、杀白细胞素（M蛋白）是链球菌细胞壁中的蛋白质组份，具有抗吞噬和抗吞噬细胞内的杀菌作用。纯化的M蛋白能使纤维蛋白原沉淀，凝集血小板，白细胞，溶解多形核细胞，并抑制毛细血管中的细胞的移动。M蛋白有抗原性，刺激机体产生型特异性抗体，并与变态反应疾病有关。（五）抗原结构链球菌的抗原构造较复杂，主要有三种：　　（1）核蛋白抗原或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同，与葡萄球菌有交叉。　　（2）多糖抗原或称C抗原，系群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。　　（3）蛋白质抗原或称表面抗原，具有型特异性，位于C抗原外层，其中可分为M、T、R、S四种不同性质的抗原成分，与致病性有关的是M抗原。（六）链球菌分类1、按溶血能力分类：（1）甲型（α）溶血性链球菌 菌落周围有1～2mm宽的草绿溶血环； 此类链球菌为条件致病菌。（2）乙型（β）溶血性链球菌 菌落周围形成一个2～4mm宽，界限分明、完全透明的溶血环，完全溶血； 这类细菌又称溶血性链球菌(Streptoccushemolyticus)，致病力强，引起多种疾病。（3）丙型（γ）链球菌 不产生溶血素，菌落周围无溶血环； 一般不致病。2．根据抗原结构分类 C抗原不同可分类A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V等20个群。 对人致病的大多属于A群。A群又称为化脓性链球菌（Pyogenicstreptococcus）。3.对氧的需要分类 按照是否需要氧，可分为需氧链球菌、厌氧链球菌、微嗜氧链球菌。 其中厌氧链球菌常寄生于口腔、肠道和阴道中，可致病的有消化链球菌属。（七）抵抗力 抵抗力不强，60℃3分钟可杀死大部分链球菌，对一般消毒剂敏感，在干燥尘埃中可存活数日； 乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。(八)流行病学与致病性 溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。 上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。化脓性链球菌一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：　　1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；　　2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；　　3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。(九)检验原理1、增菌 溶血性链球菌对营养要求比较高，增菌一般用匹克氏肉汤或葡萄糖肉浸液肉汤。 匹克氏肉汤含有胰蛋白胨的心肌浸液和脱纤维血，营养丰富，而且含有三氮化钠抑制革兰氏阴性菌生长，一般用于污染严重的标本，37℃培养24小时。2、分离培养 利用溶血性链球菌在血平板上所形成的特殊菌落分离、纯化。灰白色、半透明、表面光滑，直径为0.5-0.75mm的圆形突起细小菌落；具有溶血环。3、验证试验分类： 链激酶实验 短杆菌肽敏感实验 观察血平板溶血情况 革兰氏染色（十）检验程序 GB/T4789.11-2003操作步骤1.样品处理 按无菌操作称取食品检样25g（ml），加入225ml灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。2.培养 将上述混悬液吸取5ml，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板。 如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克肉汤，经36度培养24h，接种血平板，置36度培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。3.培养特性 该菌营养要求高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基上生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5mm-0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2mm-4mm界限分明、物色透明的溶血圈。4.链激酶试验 致病性乙型溶血性链球菌能产生激酶素（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。 吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18h-24h，36度培养的链球菌培养物0.5ml及0.25%氯化钙0.25ml，振荡摇匀，置于36度水浴中10min，血浆混合物自行凝固，然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h不溶解即为阴性。5.杆菌肽敏感试验 挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36度培养18-24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。