国家自然基金项目申请书

国家自然基金项目申请书（一）立项依据与研究内容1.项目的立项依据结直肠癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一⑴。在我国其发病率及死亡率仅次于胃癌、食道癌和肺癌。我国卫生部2003年12月颁布了《中国癌症预防与控制规划纲要》（2004-2010年），被列为重点防治的8种恶性肿瘤中，结直肠癌排在第5位。随着近年来国人生活水平的提高，高脂肪食物摄入量增多以及纤维素摄入的不足，结直肠癌发病率呈逐年上升趋势。因此对结直肠癌的防治是我国乃至全球医学领域急待解决的重大课题之一。对结直肠癌发生和发展分子机制的深入研究，将有助于寻找更为安全有效的结直肠癌治疗新方法和新的药物靶点。结直肠癌的发生和发展是多基因、多事件积累的结果⑵。多年的研究表明，Wnt信号通路异常激活在人类结直肠癌的发病中具有重要作用［3］。90%吉直肠癌的发生和发展与Wnt信号通路的异常激活有关［4］。在结直肠癌细胞中，该通路的主要基因缺陷为-catenin降解复合体异常（APC、-catenin、Axin的突变或缺失）、E-cadherin基因突变等［4］。其结果是Wnt通路保持持续激活状态，肠粘膜上皮过度增生，从而导致正常的肠粘膜向癌转化。在没有Wnt存在时，胞内的-catenin主要分布在细胞表面行使胞间连接的作用［4］。胞浆内其余过量的-catenin则被由Axin、APC等组成的俟catenin降解复合体所募集。募集后的-catenin上的四个磷酸化位点先后被CK1和GSK3磷酸化，进而被泛素酶体识别并泛素化，从而进入由蛋白酶体主导的降解过程［5］。当有Wnt（如Wnt3a）刺激时，细胞表面的Wnt受体Fizzle将在LRP5/6的协助下与Wnt蛋白结合，启动下游Dishevelled介导的CK1和GSK3对LRP6的磷酸化。这一过程促使Axin由胞浆被募集到细胞膜内表面，从而缓解了Axin/APC复合体介导的-catenin的磷酸化及最终的泛素化降解途径。逃离了降解命运的-catenin可以进入到细胞核内并与TCF/LEF相结合，并募集CBP/P300、Pygopus等转录辅激活子，激活下游调控基因如c-myc、cyclinD1、VEGF等的表达［6］。在-catenin的降解过程中，APC具有重要的作用。研究表明，APC作为一个重要的抑癌基因，其突变将导致-catenin不被磷酸化而稳定地存在于胞浆或细胞核内，持续激活其下游调控基因的表达，从而引起肿瘤的形成［6］。另外，-catenin基因自身的突变也能使其逃离被降解的命运，进而激活其下游调控基因的表达，引起肿瘤的形成。现已知APC和-catenin基因突变广泛存在于结直肠癌病例中［4］，因此，Wnt信号通路的异常激活对结直肠癌的发生发展具有重要作用。关于动物模型的研究亦证明了前述观点：例如APC基因突变的Min小鼠可自发产生结直肠癌；氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)加右旋硫酸葡聚糖(Dextransulfatesodium,DSS)诱导的小鼠结肠炎相关性结直肠癌中常可检测到-catenin的突变。既然Wnt信号通路的异常激活对结直肠癌的发生发展起着重要的作用，任何影响Wnt信号通路的因素也都可能影响结直肠癌的发生发展。-catenin进入到细胞核内与TCF/LEF相结合后，需要募集多种转录辅激活因子才能激活靶基因的表达。类固醇激素受体辅激活子(Steroidreceptorcoactivator,SRC)是一类包括SRC-1、SRC-2、SRC-3三个成员的具有重要功能的转录辅激活因子［7］。Yang等报道SRC家族的SRC-2(GRIP1)对-catenin的转录活性具有协同作用［8］，说明类固醇激素受体辅激活子家族成员能够参与调控Wnt信号通路。Xie等报道SRC-3在35%的原发结直肠癌过表达，并且SRC-3的过表达与癌进程具有相关性：在48％的晚期结直肠癌中存在SRC-3的过表达［9］，提示SRC-3可能是在结直肠癌的发生发展中起重要作用的转录辅激活因子。SRC-3又称AIB1(Amplifiedinbreastcancer1)，全长大约为160kD，由多个功能结构域组成：N端的bHLH-PAS具有高度保守性，可与DNA结合或与其它具有相同结构域的蛋白结合；中部结构域具有多个LXXLL序列，参与了与多种核受体(NuclearReceptor)的结合；C端的转录活性结构域也具有多个LXXLL序列，参与了与辅激活子CBP/p300的结合。SRC-3的C端还具有组蛋白乙酰转移酶(HAT)的活性，能与组蛋白甲基转移酶、精氨酸甲基转移酶(CARM-1、PRMT-1)相互作用，这说明SRC-3在核受体介导的染色质重组及启动子上转录复合体的组装等方面具有重要作用［7］。最初的研究发现SRC-3在雌激素受体阳性的乳腺癌中过表达并在配体存在时与雌激素受体相互作用，促进其转录活性[10]。在SRC-3敲除小鼠中癌基因H-ras或致癌剂诱导的乳腺癌以及大T抗原诱导的前列腺癌的发生和发展比对照小鼠明显变缓[12-13]，这表明SRC-3对乳腺癌和前列腺癌的发生和发展具有促进作用；另外，乳腺特异性过表达SRC-3可诱发乳腺癌[14]，这表明SRC-3本身也是一个癌基因；进一步的研究表明SRC-3可能是通过激活IGF/AKT信号转导通路来促进乳腺癌和前列腺癌的发生发展。最近，我们在研究SRC-3在肝癌发生发展中的作用时发现SRC-3在68%的肝癌中过表达，并且SRC-3能促进肝癌细胞的增殖、侵袭、成瘤，揭示出SRC-3在肝癌发生发展中的重要作用[15]。o虽然SRC-3在多种癌的发生发展中起着重要作用，但SRC-3在结直肠癌的发生发展中是否起作用以及如何起作用目前仍不清楚。我们的前期研究发现下调SRC-3的表达能够减缓结直肠癌细胞CT-26的增殖和集落形成（参见“研究基础”图1-3），进一步研究发现SRC-3能够增强-catenin/TCF的转录活性（参见“研究基础”图4）。根据这些研究结果，在本申请中我们提出这样的假说：在结直肠癌中，过表达的SRC-3能够通过增强-catenin/TCF的转录活性以促进其调控的下游基因表达，进而促进结直肠癌的发生发展。为了验证这个假说，我们拟从如下几个方面进行研究：首先通过基因沉默技术下调或用表达载体上调结直肠癌细胞中SRC-3的表达，研究SRC-3表达变化对结直肠癌癌细胞的增殖成瘤和侵袭转移等能力的影响以及SRC-3是否通过影响-catenin/TCF的转录活性而影响其下游细胞生长相关基因的表达。其次，为进一步在遗传学（动物水平）验证细胞水平的研究结果，我们还将利用SRC-3敲除小鼠进行AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌生成模型，以及SRC-3敲除小鼠和APC基因突变的Min小鼠的杂交后代小鼠体内结直肠癌生成模型，研究SRC-3基因缺失对结直肠癌的发生发展的影响。最后，为了确定细胞和动物水平上研究的结果是否具有临床意义，我们将检测在结肠癌组织中SRC-3过表达与-catenin/TCF调控的细胞生长和侵袭相关基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用和机制。2．项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题研究内容1）SRC-3在结直肠癌细胞增殖成瘤和侵袭转移中的作用SRC-3在结直肠癌细胞增殖、集落形成和成瘤中的作用在前期研究工作中我们用TransIT-TKO转染试剂将小鼠SRC-3siRNA转染入小鼠结肠癌细胞CT-26中以下调SRC-3的表达，然后通过细胞增殖实验（MTT法）及细胞克隆形成实验发现下调SRC-3的表达能够减缓CT-26细胞的增殖和集落形成（参见“研究基础”图1-3），说明SRC-3表达变化会影响结直肠癌细胞的生长。为了检测SRC-3表达变化是否会对多种结直肠癌细胞，特别是对人的结直肠癌细胞生长有影响，我们拟用人的SRC-3siRNA下调或用SRC-3表达载体上调人结直肠癌细胞HCT-116、HT29、SW480等中的SRC-3，然后通过细胞增殖实验及细胞克隆形成实验检测SRC-3表达变化对结直肠癌细胞生长的影响。我们还将通过流式细胞技术检测细胞周期，检测下调SRC-3是否会导致细胞周期阻滞，以及上调SRC-3是否会促进细胞周期进程。另外我们还拟通过检测cyclinD1、cyclinE、c-myc等与细胞生长相关基因的表达，了解SRC-3是否是通过影响这些基因的表达来影响结直肠癌细胞的生长。SRC-3的表达变化对结直肠癌细胞生长和集落形成能力具有影响，那么SRC-3的表达变化是否会对结直肠癌细胞成瘤性和结直肠癌生长有影响？为了回答这个问题，我们将进行结直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤实验，比较SRC-3下调的结直肠癌细胞和对照结直肠癌细胞的成瘤性及相应结直肠癌生长的差异。SRC-3在结直肠癌细胞侵袭和转移中的作用癌细胞的侵袭和转移在癌的发生发展中起着重要作用，而SRC-3具有促进前列腺癌和乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，因此我们推测SRC-3可能在结直肠癌细胞的侵袭和转移中具有重要作用。为了验证这一点，我们将利用铺有Matrigel的Transwell来研究SRC-3下调或上调对结直肠癌细胞侵袭的影响。细胞中基质金属蛋白酶（MMP）的表达变化会影响细胞的侵袭能力，因此我们将用酶谱法实验检测MMP-2、MMP-9、MMP-13的活性。如在SRC-3下调的结直肠癌细胞中某种基质金属蛋白酶的活性下降，我们将用实时荧光定量PCR方法和Westernblot方法在转录水平和蛋白水平进行进一步的验证。为了研究SRC-3对结直肠癌细胞在体内转移能力的影响，我们将利用小鼠结肠癌细胞CT-26肺转移模型进行研究：将SRC-3下调的CT-26细胞和对照CT-26细胞通过尾静脉分别注射入BALB/c小鼠尾静脉中，2周后，检测SRC-3下调是否会降低CT-26细胞在肺部形成肿瘤的能力。2）SRC-3在结直肠癌中发生发展中作用的分子机理作为一种重要的转录激活因子，SRC-3可以通过协同多种转录因子来促进结直肠癌的发生发展。因为在结直肠癌的发生发展中Wnt信号通路的激活起了最重要的作用，本项目将重点研究SRC-3如何与Wnt信号通路中的-catenin/TCF相互作用以促进结直肠癌的发生发展。①SRC-3对-catenin/TCF转录活性的影响在前期研究工作中我们将SRC-3、-catenin、TCF4等表达载体分别或共同与-catenin 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载体TopFlash用脂质体转染入CT-26细胞中，再检测-catenin报告载体TopFlash的表达。我们发现将SRC-3表达载体和-catenin表达载体共同转染比将两种载体分别转染更能诱导-catenin报告基因的表达，而将三者共转时比将二者共转又更加能诱导-catenin报告基因的表达，这表明SRC-3能够增强-catenin/TCF的转录活性（参见“研究基础”图4）。我们还拟在结直肠癌细胞中以RNAi技术下调SRC-3的蛋白水平，而后将-catenin、TCF4等表达载体分别或共同与-catenin报告载体TopFlash转染入这些细胞中，再检测-catenin报告基因的表达，来检验下调SRC-3能否减弱-catenin/TCF激活靶基因表达的功能。②SRC-3与-catenin/TCF的相互作用既然SRC-3能够增强-catenin/TCF的转录活性，我们推测SRC-3可能会与-catenin/TCF直接相互作用。为了验证这一点，我们拟将SRC-3、-catenin、TCF4等表达载体共同转染入CT-26细胞中，而后通过免疫共沉淀（Co-IP）实验检测SRC-3是否能与-catenin或TCF4相互作用。如能，我们拟进行GST-pulldown实验检测SRC-3是否与-catenin或TCF4在细胞外具有直接的相互作用。我们还将构建表达SRC-3不同结构域的表达载体，通过GST-pulldown实验和免疫共沉淀实验进一步确定SRC-3与-catenin或TCF4作用的结构域。SRC-3对-catenin/TCF的靶基因表达的影响虽然通过细胞转染实验我们确定了SRC-3能够协同-catenin/TCF促进-catenin报告载体TopFlash的表达，但对于SRC-3能否协同-catenin/TCF调控其靶基因如c-myc、cyclinD1、VEGF等的表达仍不清楚。我们拟先通过实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测共同转染SRC-3、-catenin、TCF4的结直肠癌细胞中的这些靶基因的表达水平是否增加，进而将表达水平有显著变增加的基因的启动子克隆到带有萤光酶(Luciferase)报告基因的质粒的上游后进行启动子转录活性分析，验证SRC-3能否协同-catenin/TCF增强此靶基因的启动子活性。SRC-3缺失对结直肠癌发生发展的影响SRC-3在AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌的发生发展中的作用为了更好地在动物遗传学水平上研究SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用，我们还将利用AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌的模型，在SRC-3敲除的小鼠和正常对照小鼠体内诱导结肠炎相关性结肠癌，利用组织切片染色、免疫组化、荧光定量PCR和Westernblot等方法检测和分析SRC-3基因缺失对结肠癌的发生率、转移率、数目、大小、分期、增殖率、凋亡率等指标以及Wnt信号通路靶基因表达的影响。SRC-3在APC突变引起的结直肠癌发生发展中的作用我们还计划将SRC-3敲除小鼠与APC突变的Min小鼠进行杂交，从而筛选出SRC-3缺失而APC突变的杂交小鼠(APC纯合突变的小鼠会致死)，进而研究此种杂交小鼠相对于单独APC突变的小鼠的结直肠癌产生、数目、大小、增殖情况以及Wnt信号通路靶基因表达的差异。从而更好地在动物遗传学水平上验证SRC-3能否通过影响Wnt信号通路来影响结直肠癌的发生发展。4）在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性为了检验细胞分子生物学和动物遗传学水平上的研究是否具有临床意义，我们拟用病理学确诊的结直肠癌组织为研究对象，其癌旁结肠组织为对照，通过实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测其中SRC-3的表达和Wnt信号通路靶基因的表达，分析SRC-3在结直肠癌中过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中作用的分子机制。研究目标（1）确定SRC-3在结直肠癌细胞增殖成瘤和侵袭转移中的作用；（2）确定SRC-3如何协同Wnt信号通路来促进结直肠癌发生发展；（3）确定SRC-3缺失对AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌和APC突变引起的结直肠癌发生发展的作用；（4）确定SRC-3在结直肠癌组织中的表达水平与肿瘤发生发展相关基因表达的关系，揭示SRC-3在结直肠癌发生发展中作用的分子机制。拟解决的关键问题（1）SRC-3是否对结直肠癌的发生发展具有促进作用；（2）SRC-3是否主要通过协同-catenin/TCF来促进结直肠癌发生发展。3拟采用的研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及可行性分析3.1拟采用的研究方案(1)总体研究思路和技术路线：总体研究思路：本课题中，我们将结合细胞分子生物学、动物遗传生理学和临床结直肠癌样品分析等研究手段进行研究。首先通过基因沉默技术下调或用表达载体上调SRC-3在结直肠癌细胞中的表达，研究其对结直肠癌细胞的增殖成瘤和侵袭转移的影响以及探索SRC-3对于-catenin/TCF的影响的分子机理；接着在动物遗传学水平上研究体内SRC-3缺失对结直肠癌发生发展的影响；最后检测在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用及其机制。技术路线:(2)实验方法⑴Westernblot测定蛋白表达水平：按常规制备细胞裂解液，在SDS-PAGE胶上电泳，蛋白转膜后与相应抗体孵育，ECL试剂盒显示蛋白。萤光酶(Luciferase)活性测定：将带有Luciferase报告基因的质粒转染入结直肠癌细胞中，24h后收集并裂解细胞。然后将装有细胞裂解液的小管置于荧光光子测定仪中，并加入荧光素酶－荧光素反应液，即刻测定反应液加样品后10秒内释放的光子量，以此表示荧光酶活性。RNA干扰：采用TransIT-TKO转染试剂(Mirus)将SRC-3siRNA转染入细胞中，三天后检测SRC-3的蛋白水平。⑷实时荧光定量PCR测定基因转录水平：提取细胞总RNA，以此为模板，oligodT为引物，反转录出cDNA。根据特定基因用相应的引物和探针，以cDNA为模板在荧光PCR仪上进行PCR。然后对实时PCR的曲线进行分析，通过比较其与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品Ct值的差别，确定基因的转录水平。GSTPullDown实验：将吸附在GS-4Bbeads上的与GST融合的体外翻译蛋白在Bindingbuffer中孵育，离心，将beads重悬于SDS-PAGE上样缓冲液，并进行SDS-PAGE电泳，电转，与体外翻译蛋白相应的一抗、二抗(HRP)孵育之后进行曝光显影。⑹免疫共沉淀：收集细胞，加入适量裂解液于冰上裂解细胞30min，离心，取上清液测定蛋白浓度。加入proteinA/G吸附珠和相应抗体与细胞裂解液孵育4h，离心，倾去上清，沉淀部分用PBS洗三次，离心后吸净残留的PBS，加入40丄上样缓冲液悬浮，沸水浴5min，离心30s，上清用于电泳。细胞增殖实验(MTT法)：将适宜浓度的100ul细胞悬液接入96孔板中。细胞贴壁后，加入MTT。37C,5%CO2细胞培养箱孵育4小时后加入裂解液裂解过夜。第二天取样检测OD560吸光值。流式细胞仪检测细胞周期：将1X106细胞接种于60mm培养板，细胞过夜培养后，无血清饥饿24h，然后加入正常血清继续培养24h后收集细胞，PBS洗涤后加入1ml70%预冷乙醇中，4C固定12小时。PBS洗涤去乙醇，0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50冯/ml，37C温浴30min。用流式细胞仪分析各时期的细胞百分数。克隆形成实验：将2XDMEM(20%FBS)与1%NobelAgar等体积混合，加入培养板制备底层胶；将5000个细胞加入到2XDMEM(20%FBS)与0.7%NobelAgar等体积混合液中，加到底层胶上制成上层胶。在37C,5%CO2细胞培养箱培养2-3周后，用0.005%结晶紫染色，显微镜下计数。细胞侵袭实验：以24孔板为例，在商品化的Transwell小室中铺入Matrigel。对数期细胞消化重悬离心后，用含1%BSA的无血清培养基稀释到适宜体积，加入到包被好的Transwell小室中。下层培养板中加入相应体积的普通含血清培养基。24小时后取出Transwell小室，去除上层未侵袭的细胞，下层细胞用1%结晶紫染色，显微镜下计数。酶谱法(Zymography)检测基质金属蛋白酶(MMP)活性：将细胞接入12孔板中，经一定处理后收集细胞培养液，用于进行SDS-PAGE(含1mg/ml明胶)电泳，然后将胶放入BufferI(50mMTris-HCl,pH7.5,2.5%TritonX-100)清洗30min，在BufferII(150mMNaCI,5mMCaCl2,50mMTris-HCI,pH7.6,0.02%NaN3)中孵育48h，最后用0.25%考马斯亮蓝染液进行染色拍照。裸鼠皮下移植瘤实验：将细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2次，离心，留细胞沉淀，用无血清的RPMI1640培养基重悬细胞，细胞密度调至5X107/ml,BALB/c裸小鼠，雌雄不拘，4〜5周龄，左右都接种细胞，每个点接种细胞107(0.2l)。自接种之日起每天观察癌结节生长情况，隔天称裸鼠体重，游标卡尺测量癌长径a和短径b，按公式V=0.5XaXb2计算瘤结节体积，绘制生长曲线。2周后，以颈椎脱位方式处死裸鼠，连同包膜完整剥出癌组织，电子天平称重，瘤组织切片进行HE染色。CT-26细胞肺转移模型：将5X105/mlCT-26细胞悬浮于PBS后注射入BALB/c小鼠尾静脉中。2周后，以颈椎脱位方式处死小鼠，将小鼠肺完整取出，观察癌并拍照，电子天平称重，肺组织切片进行HE染色。(14)AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结肠癌小鼠模型：对小鼠进行12mg/kg体重的AOM腹腔注射；5天后喂给小鼠含2％DSS的饮用水5天，再恢复常规饮用水16天，此过程重复两次；在首次DSS处理的第67天采集血液和结肠样品进行组织学和生物化学分析。可行性分析良好的立项申请基础从2002年开始，申请者就在美国贝勒医学院的美国科学院院士O'Malley实验室进行核受体及转录协同因子的研究。发现SRC-3不仅可作为转录协同因子参与转录调节，而且可作为翻译抑制因子参与蛋白质翻译调节，揭示出SRC-3调节基因表达的双功能作用。2006年申请者回国工作，继续从事转录协同因子SRC-3的相关研究。发现SRC-3在68%的肝癌中过表达并且SRC-3能促进肝癌细胞的增殖、侵袭、成瘤，揭示出SRC-3在肝癌发生和发展中的重要作用(参见”研究基础”图6-10)，相关研究论文已被“Oncogene”接受待发表。根据SRC-3具有促进细胞生长、侵袭和SRC-3在结直肠癌癌中过表达的特点，以及与SRC-3属于同一家族的SRC-2与-catenin具有相互作用等文献调研的结果，申请者推测SRC-3在结直肠癌发生和发展中具有重要作用，并发挥自己在转录协同因子领域研究上的特长，进行了预研工作。预研实验结果表明SRC-3确实能增强-catenin/TCF的转录活性，而下调SRC-3会显著抑制结直肠癌细胞的增殖。根据这些研究结果，申请者提出SRC-3可能通过增强-catenin/TCF的转录活性而促进结直肠癌发生发展的科学假说，并进行立项申请。本申请项目从课题的选择到课题的立项均具有较为充分的依据、一定的深度和较好的创新性，这对顺利完成课题研究是至关重要的。实验材料的充分准备本课题研究所需要的SRC-3敲除小鼠及对照野生型小鼠已从美国贝勒医学院的O'Malley实验室引入本实验室，并进行了大量繁殖和实验使用。正在进行SRC-3敲除小鼠与APC基因突变Min小鼠的杂交。已收集从事结直肠癌细胞生长研究的多种质粒、细胞株等。已收集了多例结直肠癌病人的结直肠癌组织和相应的癌旁组织标本以及它们的临床数据。实验室还与国内外多个实验室进行联系和交流，并交换所需的实验材料。这些实验材料的充分准备为本课题的申请和后续研究工作的完成提供了极为关键的实验保证。实验技术的充分准备本课题申请人长期从事以小鼠为模式生物进行的细胞分子生物学特别是癌细胞分子生物学方面的一线研究工作，已熟悉和掌握了丰富的动物操作、细胞分子生物学技术等拟采用的实验技术，可顺利地开展研究工作。4）良好的研究基础和工作条件本课题具有良好的研究基础和工作条件（详见“研究基础与工作条件”部分），可保障课题的顺利进行。4.本项目的特色与创新之处Wnt/-catenin信号通路异常激活是结直肠癌发生发展的基础,发现Wnt/-catenin信号通路中新的关键成分并针对Wnt/-catenin信号通路中关键成分为靶点进行靶向治疗,已成为结直肠癌研究和治疗的新方向。当前对于-catenin如何被活化进入核中与TCF相结合的过程研究得比较清楚，但对于-catenin/TCF如何与辅助因子相互作用共同激活靶基因仍不清楚。本项目研究的创新之处在于在转录辅激活因子层次上研究结直肠癌发生发展中Wnt/-catenin信号通路的异常激活，提出了SRC-3可能通过增强-catenin/TCF的转录活性而促进结直肠癌的发生和发展的假说。预研实验结果表明SRC-3的上调会显著增强-catenin/TCF的转录活性，而下调SRC-3则会明显影响结直肠癌细胞的增殖，这表明SRC-3在结直肠癌的发生和发展上具有重要作用。本项目特色是在已有工作基础上，从细胞分子水平、动物遗传水平以及临床癌样品研究三个层次上来揭示SRC-3在结直肠癌的发生和发展中的作用和机理，将基础研究与临床研究紧密地联系起来，为结直肠癌的治疗提供新思路。5.年度研究计划及预期研究结果5.1年度研究计划本课题研究将在3年之内完成。2011.12：研究并确定SRC-3在结直肠癌细胞生长成瘤和侵袭转移中的作用和机理；开展SRC-3对-catenin/TCF调控靶基因表达影响的分子机理的研究；开展小鼠中SRC-3缺失对结直肠癌发生发展影响的研究，总结阶段性成果，撰写论文。2012.12：研究并确定SRC-3对-catenin/TCF调控靶基因表达影响的分子机理；研究并初步确定SRC-3缺失对结直肠癌发生和发展的影响；总结阶段性成果，撰写论文。2013.12：研究并确定SRC-3缺失对结直肠癌发生和发展的影响和分子机制；研究并确定在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生和发展中的作用和分子机理；总结成果，撰写论文；课题结题。预期研究成果（1）阐明SRC-3在结直肠癌细胞生长成瘤和侵袭转移中的作用和机理；阐明SRC-3对-catenin/TCF调控靶基因表达影响的分子机理；阐明SRC-3缺失对结直肠癌发生发展的影响和分子机制；确定在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用和分子机理。（2）在SCI杂志上发表论文2—3篇。（3）提高参与课题研究教师的学术水平，培养优秀博士生1名和硕士生4名。研究基础与工作条件1.研究基础申请者自2002年起长期从事核受体及转录辅激活因子功能的研究。现主要以SRC-3敲除小鼠为模型，研究SRC-3在炎症反应、肠道疾病、肝脏疾病中作用和机制，现已阐明了SRC-3在抑制炎症反应以及在肝癌发生发展中的重要作用，相关研究论文发表在MolecularCell、MolecularEndocrinology、Oncogene等杂志上。这些研究工作为本申请项目的开展奠定了坚实的基础。以下为有关SRC-3在肿瘤发生发展中作用的研究工作：1.1SRC-3在结直肠癌发生发展中作用的前期研究工作（1）下调SRC-3显著影响结直肠癌细胞生长和集落形成我们分别以未转任何siRNA（Control）、转入对照siRNA（si-Control）、以及SRC-3特异性的siRNA（si-SRC-3）的CT-26进行细胞生长和集落形成实验，结果表明SRC-3特异性的siRNA能够显著下调细胞内SRC-3的蛋白水平（图1），而SRC-3的下调能够显著抑制CT-26细胞的生长（图2）和集落形成（图3）。这表明SRC-3对结直肠癌细胞的增殖具有重要作用。图1.SRC-3siRNA能够有效下调CT-26中的SRC-3的蛋白水平DonaemdeN_am0.400.350.300.250.200.15CT-26i—ControlN0.100.05048h72h96hTimeaftersiRNAtransfectionControlsi-Control图3.(2)SRC-3可促进我们将SRC-3si-SRC-3下调SRC-3抑制CT-26细胞的集落形成「-catenin/TCF4报告基因的表达・表达载体、-catenin表达载体、TCF4表达载体分别或共图2.下调SRC-3抑制CT-26细胞的生长同与-catenin报告载体TopFlash转染入CT-26细胞中，再检测-catenin报告基因的表达。我们发现将SRC-3表达载体和-catenin表达载体共同转染比将两种载体分别转染更能诱导-catenin报告基因的表达，而将三者共转时比将二者共转又更加能诱导-catenin报告基因的表达。这表明SRC-3具有协同-catenin/TCF激活靶基因表达的功能（图4）。900-800「700-600-500400「300-200100-0-口Topflash□Fopflash图4.SRC-3协同-catenin/TCF4促进-catenin报告基因的表达（3）AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌产生的小鼠模型的建立我们已成功建立了AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌产生的小鼠模型（图5）。此模型的成功建立使我们能够很好地在动物水平上研究SRC-3图5.AOM/DSS诱导小鼠结直肠癌产生缺失对结直肠癌发生和发展的影响和作用机制。（4）结直肠癌组织和相应的癌旁组织标本的米集我们已收集了多例结直肠癌病人的结直肠癌组织和相应的癌旁组织标本以及它们的临床数据。我们计划对它们采用Westernblot方法以检测其中SRC-3以及Wnt信号通路的靶基因如CyclinD1、c-myc、VEGF等蛋白表达水平。在今后的研究中我们还将继续收集更多的结直肠癌组织和相应的癌旁组织标本进行研究，使研究结果具有更好的统计学意义。SRC-3在肝癌发生发展中作用的研究工作(1)SRC-3在肝癌组织中过表达对34份肝癌样品进行westernblot分析的结果表明SRC-3蛋白在23份肝癌中过表达，阳性率为68%(图6)。NTNTNTNTNTNTNTNTNT123_456_了8g-SRC^-^-actin1011121334Q5161748*SRC^3NTNTNTNTNTNTNTNTNT-SRCJ-p-actin4920212223242526NTNTNTNTNTNTNTNTI■2了28293031323334NTNTNTNTNTNTNTNT卜SRC乌-p-actin-p-actin图6.SRC-3在肝癌组织中过表达（3）下调SRC-3显著影抑制肝癌细胞生长我们对Huh7、SK-Hep1和HepG2等肝癌细胞进行SRC-3siRNA沉默实验,发现下调SRC-3表达可使这些细胞株生长变缓（图7）。HepG2Huh-7SK^Hep-1TirnpaftsrsiRNAtransfpclinn1+2LO□siCtrl■siSRC-3Doun曲Wpa)ZMEE」oMb0—I_■_■_■%h120hrasictnSK・H即■siSRC-30.80.G0.40243h9Gh120hTimeaflersiRNAtransfection0TimeaftersiRNAtransfection图7.下调SRC-3表达显著抑制肝癌细胞生长（3）下调SRC-3表达抑制细胞周期进程我们选用HepG2进行SRC-3siRNA沉默实验。流式细胞仪分析细胞周期的结果显示：相对于HepG2，HepG2-shSRC-3存在明显的G1/S期细胞周期阻抑，进一步的研究发现在HepG2-shSRC-3细胞中，细胞周期阻抑蛋白P21的表达显著上调，表明SRC-3通过抑制P21的表达来调控肝癌细胞周期（图8）。F卜LJL_LjLoQooooo8765432310(jLSubG1G1o^hCiil■shSRC-3JD7oou——■432G2/MP21林PCNA-WAHI1±2HoshCtrlsliSRC-3shSRC-3shCtrlsliSRC-3图8.下调SRC-3表达抑制细胞周期进程(4)下调SRC-3显著降低HepG2细胞的体内外成瘤能力软琼脂成瘤实验和裸鼠成瘤实验显示沉默SRC-3显著地降低了HepG2细胞在体内外成瘤的能力(图9)。30252015帕5-ss-auwoaoooOU3Q25ZO1S1(M5s;.2ualouBEE500shCtrlshSFtC^0000閒Dooonn651321awecoaEa-s>・QUIH」bEhCirlshSRC-3-^ShCtrlshCtiIstiSFlC^5E?001QB22?5?BTimeafterInisctionMay|100shCtrlshSRC3shCtrlshSRCq图9.下调SRC-3显著降低HepG2细胞的体内外成瘤能力SRC^(-|SRC-3(+)SRC«3(・]-SRC^-PCNA在SRC-3阳性肝癌中细胞生长指示蛋白PCNA的表达比SRC-3阴性肝癌咼我们发现在肝癌样品中,SRC-3阳性肝癌中细胞生长指示蛋白PCNA的表达比阴性肝癌高,并且SRC-3的表达与细胞生长指示蛋白PCNA的表达呈正相关性(图10)。asrc^(+)—-actin.r=5.654.P<0J10051.0t62J25354.0RdaiweSRC-3proteinLewi1.55_4..0.51.5.0占.Q.5O4.3.3fi2_艺1.1.0.PCNA050505050丄3.3:2.2J「.a 工作总结 关于社区教育工作总结关于年中工作总结关于校园安全工作总结关于校园安全工作总结关于意识形态工作总结 摘要：SRC-3作为类固醇激素受体辅激活子家族的成员，对机体的多种生物学功能具有重要作用，其中可以通过抑制脂多糖刺激的机体炎症反应来发挥免疫调控作用，但是目前还不清楚SRC-3是否在机体抵抗细菌感染过程中也具有调控作用。在本课题中，我们以SRC-3基因敲除小鼠作为模型，从动物水平、细胞水平和分子水平三个层次上研究了SRC-3在机体对大肠杆菌感染的抑制及对大肠杆菌杀灭过程中的作用。我们建立了小鼠腹膜炎模型，通过对SRC-3基因敲除小鼠的研究表明，SRC-3的缺失会导致机体在感染大肠杆菌后产生强烈的炎症反应并导致机体对细菌清除能力的降低，进一步对小鼠腹腔巨噬细胞的研究发现SRC-3与巨噬细胞的表面受体SR-A、抗氧化酶Catalase及抗凋亡蛋白Bcl-2、clAP-2及cFLIPL的表达具有相关性，从而影响巨噬细胞对细菌的吞噬活性及细胞的凋亡程度，这些都表明SRC-3不仅对细菌感染后机体的炎症反应有重要的调控作用，而且能有效地增强机体对细菌的清除能力，从而在机体发生腹膜炎的过程中起保护作用。本项目为发展新型抗炎症和抗感染的药物和方法提供新思路。相关成果 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 :