苯溴马隆片含量测定和有关物质检查方法的研究 - 中国药品标准

苯溴马隆片含量测定和有关物质检查方法的研究 - 中国药品标准 普卢利沙星片含量和有关物质检测方法的研究 孟长虹, 金卫红, 陆益红 (江苏省食品药品检验所，南京 210008) 摘要 目的:完善普卢利沙星片含量及有关物质的检测方法。方法:采用C色谱柱，以0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH值至4.0)为流18 动相A，乙腈为流动相B，含量测定采用等度洗脱流动相A-流动相B(55:45)，有关物质采用梯度洗脱，检测波长为278nm。结果:主峰 -1和杂质峰能得到良好的分离，普卢利沙星在12.9,413.8,g?mL浓度 -1范围内，杂质NM394在1.23,39.36,g?mL浓度范围内呈良好线性关系;含量测定平均回收率为101.3%，RSD为1.46%(n=9)。结论:该法专属性强，灵敏、准确，耐用性好，可作为普卢利沙星片的质量控制方法。 关键词:普卢利沙星片;有关物质;含量测定;高效液相色谱法 中图分类号:R921.2 文献标识码:A 文章编号: Study on Determination and Related Substances of Prulifloxacin Tablets Meng Changhong, Jin Weihong, Lu Yihong (Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008) Abstract Objective:To perfect the HPLC method for determination and related substances of prulifloxacin tablets. Methods:The separation was performed on a C column with a mixture of 0.1% phosphoric acid 18 solution (three triethylamine adjusted to pH 4) as mobile phase A， 1 acetonitrile as mobile phase B, isocratic elution A:B (55:45) for determination and gradient elution for related substances. The UV detection wavelength was 278nm. Results:Prulifloxacin was well separated from other impurities. The calibration curve of prulifloxacin -1was linear in the range of 12.9-413.8,g?mL . The calibration curve of -1impurity NM394 was linear in the range of 1.23-39.36,g?mL . The average recoveries (n=9) was 101.3% (RSD=1.46%). Conclusion:The method is proved to be specific, sensitive and accurately and could be used to control the quality of prulifloxacin tablets. Key words:prulifloxacin tablets; related substances;determination; HPLC 普卢利沙星(prulifloxacin)的化学名为(?)6-氟-1-甲基-7-[4-(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环 戊 烯-4-基)-甲基-1-哌啶基]-4-氧代-4H-[1,3] 硫氮杂环丁烷并[3,2-a]喹啉-3-羧酸，是由日本 [1]Nippon Shinyaku公司研发的氟喹诺酮类抗菌药，于2002年在日本首次上市，商品名Sword。 本品是噻丁啶-喹啉羧酸衍生物NM394的脂溶性前体药物，它在体内经过双氧酶水解除去 C7位1-哌嗪4位上的5-甲基-2-氧-1,3-二氧杂环戊烯，成为NM394，即(?)-6-氟-1-甲基-7- (1-哌啶基)-4-氧代-4H-[1,3]硫氮丁烷并[3,2-a]喹啉-3-羧酸，见图1,NM394通过抑制细菌回 旋酶而发挥抗菌活性。NM394 在体内对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有很好的抗菌活性, 特 别是对绿脓杆菌为主的革兰阴性菌的抗菌力强, 其不良反应少，耐受性好，作用优于环丙沙 [2]星、氧氟沙星和依诺沙星。 双氧酶水解 2 NM394 普卢利沙星(NM441) 图1 普卢利沙星降解示意图 经查询国家食品药品监督管理局药品数据库，目前普卢利沙星片生产企业执行的注册标[3-6][7-9]准 有多个，均采用高效液相色谱法测定含量和有关物质。通过对这些标准和文献中多种测量方法进行比较，发现现行标准在有些条件下主峰和杂质峰分离不理想且有的杂质未能检出。本文在优化色谱条件并综合考虑出峰时间、分离度、理论板数、流动相配制难易程度等因素，建立了新的色谱条件，使各色谱峰达到了良好的分离，增强了检测方法的稳定性和耐用性。该法专属性强，灵敏、准确，耐用性好，可作为普卢利沙星片的质量控制方法。 1 仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪，SPD-20A检测器，二元泵;Agilent 1100型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，二元泵;DIONEXU3000型高效液相色谱仪，DAD检测器，三元泵;Agilent 1100系列LC/MSD Trap 液质联用仪。 普卢利沙星对照品(含量99.4%)、NM394杂质对照品、普卢利沙星原料及辅料均由苏州东瑞制药有限公司提供;普卢利沙星片(规格100mg，由2个厂家提供，批号分别为120424，120425，120426，T111111001);甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。 2 有关物质检测方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1系统适用性试验溶液 取普卢利沙星对照品10mg，用乙腈-水(1:1)溶解制成每1ml中约含0.1mg的溶液，经水浴破坏20min后，作为系统适用性试验溶液。 2.1.2供试品溶液 临用新配，避光操作。取供试品细粉适量(约相当于普卢利沙星 25mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈适量，超声2min使溶解(注:试验表明超声后杂质含量和个数均未增加)，加乙腈-水(1:1)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。 2.1.3对照溶液 精密量取“2.1.2”项下供试品溶液1ml，加乙腈-水(1:1)稀释制成每1ml中含5μg普卢利沙星的溶液，作为对照溶液。 2.2 色谱条件 色谱柱为岛津VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5µm);以0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH值至4.0)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱条件见表1;检测波长278nm;流量 3 -11.0mL?min;柱温30?;进样量20μL。 表1 梯度洗脱条件 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 15 55 45 0,溶剂 16 40 60 30 40 60 31 55 45 2.3 系统适用性试验和杂质结构确证 取系统适用性试验溶液进样测定，记录色谱图，见图2。结果各色谱峰之间均达到基线分离。 普卢利沙星 NM394 图2系统适用性试验色谱图 -1 采用0.01mol?L乙酸铵溶液(甲酸调节pH值至3.5)为流动相，进行液相-质谱检测， -1质谱采用ESI负离子方式检测，源电压为3.5kV，Neubilizer0.2MPa，干燥气流量8l?min， -1干燥气温度350?。采用水浴加热制备系统适用性试验溶液(0.1mg?ml)，主峰前杂质出峰时间为3min，其一级、二级质谱图见下图3,4。取杂质NM394对照品，相同质谱条件进行分析，一、二级质谱见图5,6。结果表明该杂质与对照品保留时间一致，一、二级质谱碎片相同，可以确定该杂质为NM394。 4 图3 未知杂质的一级质谱 图4 未知杂质的二级质谱 图5 NM394的一级质谱 5 图6 NM394的二级质谱 2.4专属性试验 取供试品细粉适量，加入乙腈溶解后，分别经沸水浴、UV365nm(6h) 、光照(4500lx， -1-16h)、强酸沸水浴10min(1mol?L HCl)、碱(0.01mol?L NaOH)破坏和过氧化氢(30%)破坏处理，中和后，用乙腈-水(1:1)制成每1ml中约含0.1mg普卢利沙星的供试品溶液，分别吸取20,l进样，依法测定。结果显示，供试品在上述高温、紫外、光照、酸碱、氧化条 -1件下，有降解产物生成，碱破坏和氧化破坏作用较强，其中碱浓度降低到0.01mol?LNaOH并不进行沸水浴处理。由图7可见，降解产物能与主峰和主要杂质峰分开。故在上述选定的色谱系统之下，普卢利沙星与降解产物的分离度良好。 普卢利沙星 图7碱破坏样品色谱图 6 2.5 线性关系和NM394相对校正因子考察 制取普卢利沙星对照品系列浓度溶液，进样测定，记录色谱图，以峰面积对其浓度进行 -1线性回归，回归方程为 Y= 109160X-35184 (r =0.9996)，普卢利沙星在1.42,45.28,g?ml浓度范围内线性关系良好。 制取NM394杂质对照品系列浓度的溶液，进样测定，记录色谱图，以峰面积对其浓度 -1进行线性回归，回归方程为Y = 112192X-35803 ，NM394在1.23,39.36,g/?ml浓度范围内线性关系良好(r =0.9996)。 NM394与主成分的相对校正因子为1.03(上述两个方程的斜率比)，因接近1，因此在计算该杂质含量时，可按主成分不加校正因子计算。 2.6 定量限与检测限 以信噪比S/N?10与S/N?3确定普卢利沙星的定量限为2.0ng，检测限为0.3ng;NM394的定量限为2.2ng，检测限为0. 4ng。 2.7 稳定性试验 取供试品(批号 ,)溶液，在配制后0，2，4，8，12h，分别于室温条件和控制进样盘为4?下进样，依法测定，考察供试品及杂质的稳定性。结果见表2,3。 表2 4?条件下有关物质稳定性试验结果 时间/ h NM394/% 其他单个最大杂质/% 其他杂质和/% 0 0.77 0.35 1.07 2 0.77 0.35 1.07 4 0.78 0.34 1.03 8 0.77 0.33 0.99 12 0.80 0.33 0.98 表3室温条件下有关物质稳定性试验结果 时间/ h NM394/% 其他单个最大杂质/% 其他杂质和/% 0 0.77 0.35 1.07 2 0.79 0.36 1.07 7 4 0.81 0.36 1.08 8 0.85 0.35 1.03 12 0.91 0.36 1.05 由上表可见，供试品溶液在室温条件下不稳定，NM394峰面积随时间延长而逐渐增加， ?条件下测定较为稳定。 其他杂质变化不大，故供试品溶液需在4 2.8样品有关物质的检测 取4批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。依法于4?条件下测定，结果结果见表4。 表4样品有关物质的检测结果 批号 NM394/% 其他单个最大杂质/% 其他杂质和/% 120424 0.77 0.35 1.07 120425 1.15 0.52 1.28 120426 0.83 0.41 1.14 T111111001 0.40 0.25 0.80 3 含量测定方法与结果 3.1 溶液的制备 3.1.1对照品溶液 取普卢利沙星对照品适量，精密称定，用乙腈-水(1:1)溶解并制成每1ml中约含50μg的溶液，即得。 3.1.2供试品溶液 取供试品10片，研细，精密称取细粉适量(约相当于普卢利沙星 50mg)，置50ml瓶中，加乙腈适量，超声2min使溶解，加乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过;精密量取续滤液5ml，置100ml量瓶中，以乙腈-水(1:1)稀释至刻度，摇匀，即得。 3.2色谱条件 色谱柱为岛津VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5µm );流动相为0.1%磷酸溶液(三乙胺调 -1节pH值至4.0)-乙腈(55:45;检测波长278nm;流量1.0mL?min;柱温30?;进样量20μL。主峰与相邻杂质峰分离度应大于1.5。 8 3.3方法耐用性试验 按拟定色谱条件，分别在三种不同牌号C色谱柱、三台高效液相色谱仪上用系统适用18 性溶液对耐用性进行考察，结果见表5。 表5耐用性试验结果 普卢利沙星保NM394保留相对NM394 柱牌号仪器理论板数分离度 留时间/min 时间/min 保留时间 Agilent (250 mm×4.6mm) Agilent 1100HPLC 9.256 11112 7.78 2.305 0.25 VP-ODS (150×4.6mm) 岛津 mmLC-20A HPLC 6.530 7335 5.97 1.572 0.24 Agilent( 250 mm×4.6mm) 岛津LC-20A HPLC 9.061 12293 8.10 2.188 0.24 Waters (250 mm×4.6mm) DIONEXU300 6.710 12029 20.15 2.323 0.35 结果表明，采用不同仪器不同色谱柱，普卢利沙星理论板数高，分离度良好，该色谱条件耐用性良好。 3.4线性关考察 制取普卢利沙星系列浓度溶液，进样测定，记录色谱图，以峰面积对其浓度进行线性回 -1归，回归方程为Y = 49111X+418224 ((r=0.9987)，普卢利沙星在12.9,413.8,g?ml浓度范围内线性关系良好。 3.5 专属性试验 由于含量测定和有关物质流动相组成相同，主峰前流动相比例也相同，不再重复做专属性试验。称取适量空白辅料溶解过滤后进样，结果空白辅料对主峰没有干扰。故认为在选定的色谱系统之下，普卢利沙星与降解产物的分离度良好。 3.6回收率试验 取普卢利沙星原料、辅料，分别按处方比例制备含普卢利沙星 80%、100%和120%的模拟样品，按“3.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法进行测定，计算回收率，结果见表6。 表6 回收率试验结果 回收率 平均回收率 浓度 取样量实测量/mg RSD/% /% /% /mg 9 53.80 54.40 101.12 80% 53.63 54.03 100.75 53.62 53.89 100.50 66.99 67.58 100.88 100% 66.79 68.37 102.37 101.33 1.46 66.94 67.54 100.90 80.52 80.28 99.70 120% 80.32 81.06 100.92 80.33 150.19 84.21 104.83 3.7进样精密度试验 取同一供试品溶液，重得进样6次，结果其峰面积的RSD为1.13%。表明进样精密度良好。 3.8 重复性试验 分别取同一供试品(批号120426)6份，按“3.1.2”项下方法制备供试品溶液，吸取20,l注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算含量，结果平均含量为98.9%，其RSD为0.19%。表明方法重复性良好。 3.9样品含量测定 取4批样品，按“3.1.2.”项下方法制备供试品溶液，每批样品平行配制两份。依法测定，按外标法计算样品中普卢利沙星的含量，结果见表7。 表7 样品中普卢利沙星含量测定结果(n=2) 厂家 批号 平均含量/% A 120424 100.8 120425 99.7 120426 98.9 10 B T111111001 99.4 4讨论 4.1普卢利沙星是一个前药，它在体内经过双氧酶水解除去C7位上的5-甲基-2-氧-1,3-二氧杂环戊烯-4-基，成为NM394。NM394通过抑制细菌回旋酶而发挥抗菌活性。普卢利沙星结构中的C6上的氟原子和C7上的哌嗪基是其抗菌活性的官能团，普卢利沙星C7上有取代，其口服易被肠道吸收，生物利用度较NM394明显提高。文献报道，口服同等剂量NM394 [10]的血浆峰浓度仅为普卢利沙星的0.25。普卢利沙星在溶液中很容易降解成为生物利用度较低的NM394，对普卢利沙星而言，有必要对这个杂质进行控制。 4.2稳定性研究考察结果显示，光照、高温、高湿等影响因素均会使普卢利沙星有关物 [11]质增加，且随留样时间延长有关物质会有所增加。文献报道显示，普卢利沙星的有关物质包括NM394，NM9009，NM672，NM9008，NM603，NM660等，最易产生且增加最快的杂质为NM394，该杂质为普卢利沙星体内降解后主要的活性中间体NM394，相对分子质量349.38。 4.3由于NM394杂质对照品较难获得，考虑相对保留时间法进行杂质定位，在耐用性试验中，四种色谱系统中NM394的相对保留时间为0.24，0.24，0.25，0.35，无法确定较准确的相对保留时间范围，且NM394峰附近还有多个杂质峰，较难区分。因此采用对照品溶液水浴加热得到普卢利沙星与NM394混合物对NM394进行定位。 4.4在比较几个注册标准和文献报道中各色谱条件测定样品有关物质时，发现主峰保留时间2.5~4倍时有杂质峰，经确证为文献报道的NM660，为确保该杂质检出，本文采用梯 [7]度洗脱进行测定。文献报道NM660的安全性较好，故该杂质用最大杂质控制方法控制，不单独控制。其它杂质含量较低，未进行结构确证，统一作为其它杂质进行控制。 4.5稳定性试验显示供试品溶液在室温条件下不稳定，随着时间延长，NM394峰面积逐渐增加，12h后NM394含量增加16%，其他杂质变化不大。因此样品需临用新配或控制进样器温度，低温进样。另外由于喹诺酮类药物都有见光分解的特性，因此本品检测时还需避光操作。 参考文献 [1] 解飞，封宇飞. 新氟喹诺酮类抗菌药普卢利沙星[J]. 中国新药杂志，2005,14(9):1198-1201 [2] 江丽, 杭太俊，沈建平，等. 血浆普卢利沙星活性代谢物的测定及其人体药动学研究[ J] . 11 中国新药杂志, 2006, 15 ( 4) :307-310 [3] 国家食品药品监督管理局试行标准YBH06102009[S] [4] 国家食品药品监督管理局试行标准YBH02642008[S] [5] 国家食品药品监督管理局试行标准YBH08942008[S] BH11102008[S] [6] 国家食品药品监督管理局试行标准Y [7] 刘利军. 反相高效液相色谱峰测定普卢利沙星中的有关物质[J]. 中南药学，2010,8(6):423-425 [8] 叶海鸿，贺焕华. 高效液相色谱峰测定普卢利沙星的含量[J]. 中国抗生素杂志，2006,31(12):761-762 [9] 陈敏，周斌，魏大鹏，等. 高效液相色谱法测定普卢利沙星片的含量[J]. 药物分析杂志，2006,26(1):136-137 [10] 贺娟，夏培元.普卢利沙星——新一代氟喹诺酮类抗菌药[J]. 抗感染药学，2006，3(1): 5-8 [11] 掛见，和郎. 普卢利沙星的化学构造，物理化学性质及稳定性[J]. 日本医药品研究，1997，28(1):1-11 (收稿日期:2013-11-25) 12