RT-PCR详细步骤（包含TRIzol 法提取RNA步骤)

RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。三．试剂配制1．DEPC水：吸出1mlDEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。3．异丙醇：放入棕色瓶中。4．氯仿：放入棕色瓶中。5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA20mlpH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g六．需购置材料Taq酶(-20度保存)(配10×buffer和MgCl2)：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。dNTP(4度保存)：向生物公司购买，原装和分装均可。oligo(dT)15(-20度保存)：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货，每支10元，稀释后使用(注意稀释浓度)，也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用，稀释液4度保存。M-MLV(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。RNasin(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。DEPC(4度保存)：向生物公司购买，5克足矣。Trizol(4度保存)：有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。国外进口的有Invitrogen(Trizol)、罗氏(TriPure)、MRC(TriReagent)；国内的也行，天为时代的就不错。Marker(4度保存)：按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的Marker(物美价廉，上样2.5ul就很亮了，较3.0ul的Takara同样品种Marker为亮)，本人很喜欢它的DL2000。电泳LoadingBuffer(4度保存)：按照配方自己配制，不需要购买(购买的话价格挺贵)。七．引物合成1．内参照：GAPDH(452bp)正义：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3反义：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-32．退火温度计算：2(A+T)+4(G+C)，正反义平均数，再上下波动4-5度。3．引物2OD已足够，每管1OD分装。4．引物稀释：加DEPC水量(μl)＝Xnmol/OD(合成的引物管上有标注)×管上所标OD数(推荐每管引物为1OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！！)×100。最终引物浓度为10pmol/μl。八．PCR产物电泳取1-10μl(一般取5μl)PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，一般用稳压状态进行电泳，100V左右，电泳20-30分钟，紫外灯下观察，结果进行扫描保存。九．注意点：1逆转录后应立即冰水浴2RNA抽提前，打开离心机预冷TRIzol法抽提总RNA组织100mg/细胞1×107↓加1mlTRIzol↓组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管)细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓4℃，离心12000g，15分钟↓转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中↓加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温10分钟↓4℃，离心12000g，10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇(DEPC水配)1ml↓4℃离心7500g，5分钟↓弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)↓溶于DEPC水中注意：1.RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解。2.细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)。3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头(DEPC处理过的)吸出多余的酒精。最后用200μl中枪头(DEPC处理过的)吸11.5μl(20μl体系，如果是40μl体系则加倍)的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管(这些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以节省枪头)中。两步法RT-PCR(第一步：逆转录反应：20μl体系，如果是40μl体系则加倍)试剂浓度体积终浓度RNA11.5μlOligo(dT)150.05μg/μl2μl0.005μg/μl(0.05μg/μlOligo(dT)15为Oligo(dT)15原液稀释10倍的浓度)↓混匀，离心，70℃5min↓立即冰水浴，稍离心↓试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer5×4μl1×dNTP10mM1μl0.5mMRNasin40U/μl0.5μl20μM-MLV200U/μl1μl200U总体积20μl↓混匀，离心，42℃60min↓95℃10min(破坏M-MLV)↓4℃保存(第二步：PCR反应：总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10×2μl1×MgCl225mM1.2μl1.5mMdNTP10mM0.2μl上游引物10pmol/μl0.4μl下游引物10pmol/μl0.4μlcDNA模板1μlDEPC水14.7μlTaq酶2.5U/μl0.1μl↓混匀↓95℃5分预变性94℃30秒变性X℃30-40秒退火72℃30秒延伸72℃7分终末延伸(28-36循环，4℃保存)注意：1.Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。2.dNTP保存在4度即可，勿反复冻融。3.如果一次做很多管，可以先将共同需要的部分一起加(稍微多算一点，例如20管分装，可以加入21-22管的量，因为枪头会吸附一定的液体，可能有人认为这样会浪费试剂，其实不然，因为每管分开加的话试剂用量更多，枪头吸附的试剂的量其实也是很可观的，特别是国产的枪头，这样做同时还能降低加样误差)，然后各管分装，再加各自不同的部分。4.如果200μl的EP管在PCR过程中盖子容易炸开，解决方法有：(1)用封口膜将管口密封、(2)最后每管加入液体石蜡进行液封。