实验八卵母细胞采集
一、目的和
要求
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随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入、动物克隆等胚胎
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
技术的快速发展,对卵母细胞的需求量日益增加。仅靠超数排卵技术已不能满足这类科研的需要。因此,通过屠宰场的卵巢获取大量卵母细胞已成为当前行之有效的主要途径。
通过本实验要求掌握卵母细胞采集的基本方法。
二、材料和仪器设备
实体显微镜、恒温水浴锅、M199培养液、生理盐水、捡卵器、灭菌吸水纸、
5 mL注射器、12号针头、PBSS、切割刀、8cm的培养皿、眼科剪、离心管等。
三、操作步骤
1.卵巢(从屠宰场)采集。兔子剖腹后,立即无菌采集卵巢,除去多余脂肪组织,灭菌吸水纸擦干,置于25~29℃或30~37℃灭菌生理盐水(添加少量抗菌素)中保存,6h以内送回实验室。
2.卵巢表面卵泡(直径:2~6 mm)卵母细胞的采集:30℃左右生理盐水洗卵巢3次后,用5 mL注射器和12号针头及少量PBSS(含5%犊牛血清的磷酸盐缓冲液),先吸少量PBSS溶液,然后抽吸卵巢表面2~6 mm卵泡,抽吸液注入灭菌的10 mL 离心管中,静置2 min,弃上清液并镜检回收A、B级卵丘-卵母细胞复合体(COC)。
3.机械破碎法收集卵母细胞:将采过表面卵泡的卵巢从门部纵切为两半,去除黄体、髓质和多余的脂肪组织,置于直径为8cm无菌的培养皿中,用眼科剪在表面皿内剪碎卵巢皮质(直径<0.5mm),之后,将碎组织置于另一培养皿进行冲洗和静置。如此反复三次,得四皿冲卵液,从中检出颗粒细胞一卵母细胞复合体(简称卵母细胞)。
采集卵母细胞所用的冲卵液为5%新生犊牛血清(NCS)的杜氏磷酸缓冲液(PBS)。
(牛、羊卵巢:切割刀由4个单面切片或双面刀片平行排列安装而成,刀片间距离分别为 1.0,1.3,1.6,2.0,2.4 mm。将采过表面卵泡的卵巢从门部纵切为两半,去除黄体及多余的脂肪组织,置于直径为8cm的培养皿中,加约20 mLPBSS,用镊子固定卵巢,然后用特制刀纵横切割,去除组织块,稍置并弃上清液后检卵。)
4.卵母细胞的筛选:将两种方法所得的卵泡液分别置于无菌的捡卵杯内,
静置后在体视显微镜下捡卵。对捡出的卵丘卵母细胞复合体(COCS)在实体显微镜下按A、B、C三级
标准
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分级、记数并
记录
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采集时间。
A级为胞质均匀并充满于透明带内且卵丘细胞层完整紧密、包裹3层以上;
B级为胞质均匀且卵丘细胞完整紧密,包裹1~3层;
C级为卵丘细胞包裹不完整,卵母细胞裸露,或胞质略有退化。
A,B级卵为体外培养可用卵。
四、作业
简述实验过程和结果,根据结果进行分析。
浙公网安备 33021202002483