卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112773891A(43)申请公布日2021.05.11(21)申请号202110137557.X(22)申请日2021.02.01(71)申请人北部湾大学地址535011广西壮族自治区钦州市钦南区滨海新城滨海大道12号(72)发明人蔡小辉　彭银辉　杨绍宇　陈泓霖　龙群能　王龙文　胥鹏　(74)专利代理机构桂林市持衡专利商标事务所有限公司45107代理人唐智芳(51)Int.Cl.A61K39/09(2006.01)A61P31/04(2006.01)C12N15/31(2006.01)C12N15/79(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表6页附图4页(54)发明名称卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用。所述的疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其制备方法为：根据internalin基因序列设计引物并进行PCR扩增，所得产物与pMD‑18T连接，转化DH5α后选出阳性克隆菌并扩大培养，提取质粒经验证得到pMD‑internalin重组质粒；再将该所得质粒和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切，酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化DH5α，选出阳性克隆菌提取质粒经验证即得卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗。本发明所述疫苗免疫保护率较高，周期较长。CN112773891ACN112773891A权　利　要　求　书1/1页1.一种卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗，其特征是，该疫苗为以pcDNA3.1(+)为载体，含有无乳链球菌internalin基因片段的重组真核质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)根据internalin基因的核苷酸序列设计引物，并进行PCR扩增，得到PCR产物；2)所得PCR产物与pMD‑18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测筛选出阳性克隆菌；将所得阳性克隆菌扩大培养，提取质粒做双酶切及DNA测序验证，得到pMD‑internalin重组质粒；3)将pcDNA3.1(+)质粒和pMD‑internalin重组质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切，酶切产物用T4 DNA连接酶连接，之后转化大肠杆菌DH5α，PCR检测筛选出阳性克隆菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，构建得到pcDNA‑internalin重组真核质粒，即为卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤1)中，所述internalin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，步骤1)中，根据internalin基因的核苷酸序列设计的引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。5.权利要求1所述卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗在制备鱼类抗无乳链球菌药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述的鱼类为卵形鲳鲹。2CN112773891A说　明　书1/4页卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及鱼类抵抗细菌感染的DNA疫苗，具体涉及卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用，属于分子生物学领域。背景技术[0002]卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，俗称金鲳，是一种暖水性中上层鱼类，基于其生长速率较快，且出口加工市场前景诱人等特点，网箱养殖规模逐年增加，已逐渐成为南方海水养殖主要品种之一。但是，因养殖规模扩张迅猛、种质下降、养殖管理水平差、近岸海区环境恶化、药物使用不当等诸多因素，卵形鲳鲹细菌病的发生越来越频繁，链球菌病害频发，给行业带来巨大损失。[0003]无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是卵形鲳鲹养殖过程中普遍易发的致病菌，高发季节为水温较高的夏秋季节，主要症状有眼球突出、内鳃盖骨血管充血、游泳打转不正常、肠发炎等。对于无乳链球菌所致卵形鲳鲹疾病防治，大多采取化学消毒预防和抗生素等传统治疗方法，虽然也有一定的效果，但总体效果不佳，造成环境污染、抗药病原出现、水产品的药物残留、水体正常微生物种群失调、耐药性微生物增加、养殖动物内脏机能损伤等一系列不良后果。因此，迫切需要寻求一种安全、有效的疾病的防治手段，研发针对性的疫苗免疫产品，在养殖生产中具有重要意义。如公布号为CN107082804A的发明专利，公开一种卵形鲳鲹β‑胸腺素，其中指出该卵形鲳鲹β‑胸腺素能够显著抑制致病菌(爱德华氏菌、哈维氏弧菌和无乳链球菌)的生长，并且注射鱼类之后能够提高鱼类的抗病能力。[0004]内化素(internalin)是一种定位在无乳链球菌表面，通过N端半胱氨酸连接在细菌表面的脂蛋白，是细菌侵入上皮细胞、肝细胞等非吞噬细胞并被宿主细胞内化的重要因子。目前，尚未见有以pcDNA3.1(+)为载体，构建pcDNA‑internalin重组真核质粒以用于卵形鲳鲹抗无乳链球菌药物的相关报道。发明 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 [0005]本发明要解决的技术问题是提供一种对鱼类无乳链球菌的攻毒起到良好保护效果的卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用。[0006]本发明所述的卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗，是以pcDNA3.1(+)为载体，含有无乳链球菌internalin基因片段的重组真核质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。[0007]上述卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：[0008]1)根据internalin基因的核苷酸序列设计引物，并进行PCR扩增，得到PCR产物；[0009]2)所得PCR产物与pMD‑18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测筛选出阳性克隆菌；将所得阳性克隆菌扩大培养，提取质粒做双酶切及DNA测序验证，得到pMD‑internalin重组质粒；[0010]3)将pcDNA3.1(+)质粒和pMD‑internalin重组质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切，酶切产物用T4 DNA连接酶连接，之后转化大肠杆菌DH5α，PCR检测正确后筛选出3CN112773891A说　明　书2/4页阳性克隆菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，构建得到pcDNA‑internalin重组真核质粒，即为卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗。[0011]上述制备方法的步骤1)中，所述internalin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。针对internalin基因的核苷酸序列设计的引物包括正向引物和反向引物，分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。[0012]本发明还提供上述卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗在制备鱼类抗无乳链球菌药物中的应用。具体的，所述的鱼类优选为卵形鲳鲹。[0013]与现有技术相比，本发明所述的卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗能显著引起鱼体内相关的特异性和非特异性免疫反应，对无乳链球菌的攻毒起到良好的保护效果，注射疫苗后第3周的免疫保护率达70％以上，免疫保护率较高，周期较长，可为后期DNA疫苗在生产应用及产业化生产中提供理论基础和科学依据。附图说明[0014]图1为本发明实施例1中internalin基因扩增PCR产物的电泳检测图，其中M：10000蛋白marker；1：internalin扩增PCR产物。[0015]图2为本发明实施例1中构建的pMD‑internalin重组质粒菌落鉴定的电泳检测图，其中M：10000DNA marker；1：阳性菌落PCR产物；2‑5：阴性菌落PCR产物。[0016]图3为本发明实施例1中构建的pcDNA‑internalin重组真核质粒的构建模拟图。[0017]图4为本发明实施例1中构建的pcDNA‑internalin重组真核质菌落鉴定的电泳检测图，其中M：10000DNA marker；1：阳性菌落PCR产物；2‑5：阴性菌落PCR产物。[0018]图5为发明实施例3中卵形鲳鲹接种pcDNA‑Internalin 28d时pcDNA‑internalin重组真核质粒在各组织中DNA水平和RNA水平的分布图，其中A图为DNA水平分布图，B图为RNA水平分布图，在A图和B图中，M：DL10000标记；1：鳃；2：肝脏；3：肾脏；4：头肾；5：肌肉；6：小肠。[0019]图6为发明实施例3中不同免疫时间免疫组和对照组卵形鲳鲹血清中抗体效价比较柱状图。具体实施方式[0020]为了更好的解释本发明的技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。[0021]实施例1：卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗(以下也称为DNA疫苗pcDNA‑internalin)的制备[0022]1)internalin基因序列克隆[0023]根据NCBI上internalin基因的核苷酸序列(GenBank登录号：MW321594，SEQ ID NO：2)，设计并合成特异性引物对，其中正向引物为：InF：5’‑CGGAATTCATGAAAGGTCAAAAAATTATTGCT‑3’(下划线为EcoR I酶切位点，SEQ ID NO：3)，反向引物为InR:5’‑CCGCTCGAGTTAATGGTGATGATGACCTACATGTG‑3’(下划线为Xho I酶切位点，SEQ ID NO：4)。PCR扩增的反应体系为：无乳链球菌基因组DNA模板0.5μL，引物(InF和InR)各0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μ4CN112773891A说　明　书3/4页L，DNA聚合酶Mix 25μL，ddH2O补足至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸2min，共34个循环；72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖检测后，切胶回收，切胶回收的PCR产物电泳检测图如图1所示。[0024]2)构建pMD‑internalin重组质粒[0025]将切胶回收的PCR产物与pMD18‑T(TaKaRa公司)进行连接，按说明书操作进行。在离心管中分别加入以下体系溶液：切胶回收的PCR产物5μL，pMD18‑T Vector 1μL，Solution I 4μL，16℃水浴锅中连接过夜。[0026]将连接产物转化至感受态DH5a中，涂布培养，挑取白色菌落，37℃摇床培养3‑6h。用M13通用引物(M13F：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，SEQ ID NO：5；M13R：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA，SEQ ID NO：6)和internalin基因的引物(InF/InR)同时进行菌落PCR鉴定。通过核酸电泳仪和普通凝胶成像仪对PCR产物进行检测，PCR检测筛选出阳性克隆菌。将上述所得阳性克隆菌扩大培养20mL，按照TIANGEN质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，进行EcoR I/Xho I双酶切和测序验证，构建得到pMD‑internalin重组质粒。所得internalin基因扩增PCR产物的电泳检测图如图2所示。[0027]3)构建pcDNA‑internalin重组真核质粒[0028]将pcDNA3.1(+)质粒(也称pcDNA空质粒或pcDNA质粒或原始质粒)和步骤2)提取的pMD‑internalin重组质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切，20μL体系含：EcoR I 1μL，Xho I 1μL，10×H buffer 2μL，质粒产物4μL，ddH2O 12μL。酶切产物纯化后，使用T4 DNA连接酶进行连接，10μL体系如下：目的基因重组质粒酶切产物6μL，pcDNA空质粒酶切产物2μL，10×ligation buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1μL。16℃连接过夜，连接后转化入感受态细胞DH5a中，使用pcDNA通用引物(pcDNA3.1‑F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC，SEQ ID NO：7；pcDNA3.1‑R：TAGAAGGCACAGTCGAGG，SEQ ID NO：8)进行菌落鉴定(如图4所示)，挑选出阳性克隆菌，使用天根生化科技(北京)有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，进行EcoR I/Xho I双酶切和测序验证，构建得到pcDNA‑internalin重组真核质粒(pcDNA‑internalin重组真核质粒的构建模拟图如图3所示)，即为卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗(DNA疫苗pcDNA‑internalin)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。[0029]利用此发明方法，目的基因扩增后先与pMD18‑T连接，对含目的基因的载体pMD18‑T和pcDNA质粒载体上的酶切位点模拟建立克隆，证实酶切产物符合连接要求，然后进行酶切、连接，大大提高构建了DNA疫苗的成功率。[0030]实施例2：DNA疫苗pcDNA‑internalin免疫卵形鲳鲹[0031]DNA疫苗制备液和原始质粒制备液(也称空载制备液)：将DNA疫苗pcDNA‑internalin在无菌生理盐水中稀释到终浓度100μg/mL，即为疫苗制备液。将pcDNA质粒在无菌生理盐水中稀释到终浓度100μg/mL，即为空载制备液。[0032]将360尾健康的卵形鲳鲹(每尾体重约120g)随机分成3组，每组40尾，每组设置3个重复。分别为DNA疫苗组、空载组和对照组(生理盐水组)。采用背部肌肉注射法对大卵形鲳鲹进行免疫，DNA疫苗组：每尾鱼注射100μL浓度为100μg/mL pcDNA‑internalin重组真核质粒；空载组：每尾鱼均注射100μL浓度为100μg/mL空载质粒；参照组：每尾鱼注射100μL无菌生理盐水。[0033]实施例3：DNA疫苗pcDNA‑internalin在卵形鲳鲹组织表达及其抗血清效价检测5CN112773891A说　明　书4/4页[0034]在免疫后的第28天取卵形鲳鲹肌肉、头肾、鳃、脑、肝脏和脾脏组织，在DNA水平和RNA水平检测目的基因表达状况。以上述各组织的基因组DNA和提取RNA反转录的cDNA为模板，采用internalin的特异性引物InF和InR进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示免疫28d时，DNA和RNA水平上internalin均可在上述组织中表达(如图5所示)。[0035]在免疫后第7d、第14d和第21d每组随机取3尾卵形鲳鲹，尾静脉采血，室温静置1h，4℃静置12h，4000r/min离心10min取上层血清，用于抗体效价的测定。血清中和抗体效价鉴定结果如图6所示，免疫组在第一周就检测到了抗体，在第三周时达到高峰，抗体效价为1：128，DNA疫苗组的血清中和抗体效价极显著高于对照组，引起了显著的抗体反应。[0036]实施例4：DNA疫苗pcDNA‑internalin对卵形鲳鲹的免疫保护率[0037]免疫28d后，从免疫组的3组鱼中各随机取出20尾，共取出60尾实验鱼，每尾腹腔注射0.1mL 5.0×107cfu/mL的无乳链球菌活菌悬液，随机将60尾鱼平均分养在3个养殖桶内；另外从对照生理盐水组中取出60尾鱼，再随机将60尾鱼平均分养在3个养殖桶内，每尾腹腔注射0.1ml的灭菌生理盐水作为对照组。实验期间正常投喂，统计各组鱼死亡情况。第3周：实验组5尾，空载组14尾，对照组20尾；第7周：实验组10尾，空载组18尾，对照组20尾。[0038]利用下列公式计算免疫保护率(RPS)[0039]RPS＝(1‑免疫组死亡率/对照组死亡率)×照组死亡。[0040]由此得出DNA疫苗pcDNA‑internalin第3周和第7周的免疫保护率分别为75％和50％，显著高于对照组。空载组免疫保护率分别为30％和10％，揭示pcDNA‑internalin重组真核质粒可能作为免疫佐剂起到一定程度的免疫增强作用。可见，本发明所述的DNA疫苗pcDNA‑internalin是一种有效的DNA疫苗，其免疫保护率较高，周期较长。6CN112773891A序　列　表1/6页序列表<110> 北部湾大学<120> 卵形鲳鲹源无乳链球菌DNA疫苗及其制备方法和应用<130> 2021<160> 8<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 8035<212> DNA<213> 人工序列()<400> 1gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt 60gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct 120tgaccgacaa ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgatg 180tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 240cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 300gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 360ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 420ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 480atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 540cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 600acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 660acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 720actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 780gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc 840actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacttaag cttggtaccg agctcggatc 900cactagtcca gtgtggtgga attcatgaaa ggtcaaaaaa ttattgctct agctggtctt 960gtcctgtcat gccattttgc tcttacggca tgtcatactc aagaacacaa aaattcttat 1020catattaaaa caaagcaggt tgctaagaaa aaagctaata aaaagaaagt ctctgttaag 1080gaaagtcata aaaaacgcaa gggtgttgca ggggttgact ttccaactga tgatggcttt 1140ttactgacta aagattcgaa gattttatct catacagatt ctggaatcgt tgtagcacat 1200ggaaatcatt ctcattttat tttttactct gatttaaaag gttcaaaatt tagctattta 1260atccctaatg ctaatgcaaa aactaataaa aatcaagcgg taagaaactt taaagcaggg 1320gcggtagctg ttaatacatt aaatgatggc tatgttttta atcccgcaga tattgtttca 1380gaagatgcta atggctacgt ggtcagacat ggtgaccatt tccactatat tccaaaagca 1440a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