【doc】钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2-HA融合蛋白的构建及鉴定

【doc】钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2-HA融合蛋白的构建及鉴定 钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白 SNAT2-HA融合蛋白的构建及鉴定 第41卷第1期 2012年2月 上海师范大学(自然科学版) JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Vo1.41.No.1 Feb.,20l2 钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2一HA 融合蛋白的构建及鉴定 董晓云,王函,孟雯,李洋,张舟 (上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234) 摘要:钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2在哺乳动物组织中广泛表达,具有转运中 性氨基酸的功能,在谷氨酸一谷氨酰胺循环,肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用.为了 方便测定SNAT2在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接将HA标签蛋白 与SNAT2的C末端连接,构建了真核生物表达载体pBK—CMVA(1098—1300)一SNAT2一HA 表达载体.用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染到HEK293T细胞中,通过Westernblot法检 测到SNAT2一HA融合蛋白在细胞膜上的正确表达和定位.pBK—CMV?(1098—1300)一 SNAT2一HA表达载体的成功构建,为今后对SNAT2的结构和功能的研究提供了有效方法. 关键词:中性氨基酸转运蛋白SNAT2;融合蛋白;构建和鉴定 中图分类号:Q31文献标识码:A文章编号:1000-5137(2012)01-0083-06 0引言 钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白(Sodium—coupledNeutralAminoAcidTransporter,SNAT)属于 SLC38基因家族.根据各成员的对转运底物的偏爱性,SLC38家族又分为SystemA和SystemN两个亚 族,其中SystemA中包括SNAT1,SNAT2和SNAT4,偏爱转运丙氨酸(alanine);SystemN包括SNAT3和 SNAT5,偏爱转运含氮侧链的氨基酸,如谷氨酰胺(glutamine)?. SNAT2是SystemA中的第二个成员,在哺乳动物组织中广泛表达,主要转运丙氨酸,天冬酰胺,半 胱氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸等中性脂肪族氨基酸.SNAT2由504个氨基酸残基组成,理论分子量为 56kDa,被预测具有11个跨膜区域(TMD).SNAT2在转运氨基酸的过程中以1:1的比例共转运钠离子 进入细胞,对细胞外的钠离子浓度具有依赖性,转运过程可被低pH抑制.2.8』.同时,SNAT2还受到荷 尔蒙调节,在肝脏的糖质新生中发挥着重要的作用?J.SNAT2参与氧化代谢,是体内主要的氮转运载 体.在谷氨酸神经元中,SNAT2可能提供丙氨酸给仪一酮戊二酸,为神经递质的合成提供另一条途径J. 由于SNAT2在转运一个中性氨基酸进入细胞的同时协同转运一个钠离子,产生一个正的静电荷,因此 转运过程有电流产生.基于这个特点,可以运用膜片钳技术来研究SNAT2在生理条件下的功能.通过膜 片钳技术研究发现,SNAT2介导阴离子的渗漏J,跨膜区域TMD1中的82位天冬酰胺和TMD8中的苏 收稿日期:2011~08-29 基金项目:国家自然科学基金项目(30870560);上海市科学技术委员会项目 (10540503400);上海市教育委员会科研 创新项目(09ZZ1039);上海市重点学科建设项目($30406);上海师范大学细胞生物学重点学科建设项目(DZL808) 作者简介:董晓云(1987一),女,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;张舟(1971一),女,上海师范大 学生命与环境科学学院教授. 通信作者 上海师范大学(自然科学版) 氨酸参与了SNAT2与钠离子的结合.据报道,SNAT2在哺乳动物细胞中具有重要的生理功能,SNAT2的 功能紊乱可能导致严重的神经退行性疾病J.SNAT2结构的精确解析有助于明确作用机理,为功能的 确定和药物的筛选提供依据,但是目前还没有任何关于SNAT家族转运蛋白的晶体结构解析的报道. 生物膜上所含的蛋白称为膜蛋白,根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置,膜蛋白可分为三大类: 外在膜蛋白,内在膜蛋白和脂锚定蛋白.SNAT2含有11个跨膜区域,属于内在膜蛋白.目前对内在膜蛋白 的结构和功能的研究存在很多困难,主要原因在于:一是内在膜蛋白的表达量很低,应用基因工程的方法 来大量表达也存在着很多困难;二是内在膜蛋白的分离纯化有很大的难度;三是膜蛋白晶体的长成十分困 难J.因此,现阶段只能在酶学和细胞生物学的水平上进行其结构和功能的研究J,从而膜蛋白的专一性 抗体即成为不可或缺的工具.但是膜蛋白有效的专一性抗体制备极其困难,目前还没有特别有效的专一性 的抗SNAT2的抗体商业化.本研究采用PCR和酶切连接等方法获得含有SNAT2一HA融合蛋白的真核生 物表达载体pBK—CMVA(1098—1300)一SNAT2一HA,并将其转染人胚胎肾细 胞(humanembryonickidney cell,HEK293Tcel1)中表达鉴定,为进一步研究SNAT2的结构和功能奠定了基础. 1材料与试剂 1.1质粒,菌株和细胞株 pBK—CMVA(1098—1300)(以下简称pBK—CMVA)质粒载体和SNAT2基因为本实验室所有, E.coliDH5c~(Tiangen),HEK293T细胞株从中科院生物化学和细胞生物学研究所细胞库购买. 1.2主要试剂 2×PCRtaqmix酶购自Generay公司;DNAmarkerlkb,SpectraTMMuhicolorHighRangeProteinLadder购 自Fermentas公司;WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem购自Promega公司;GelMidiPurification t购自TIANGEN公司;Agarose胶购自BIOWEST公司;限制性内切酶XbaI,BlpI,T4DNAligase,CIP(去磷酸 化酶)购自NEB公司;DMEM(HighGlucose1X),胎牛血清,0.25%Trypsin—EDTA1×购自Gibco公司;脂质体 LipofeetamineTM2OOO购自Invitrogen公司;BCAProteinAssayKit购自Pierce公司;cocktail蛋白酶抑制剂购自 Roche公司;PBS,Tris,TEMED,甘氨酸(电泳特级),丙烯酰胺,N,N'一亚甲丙烯酰胺均购自上海朝瑞公司,为 进口分装试剂;PVDF膜,ECL化学发光试剂盒购自Millipore公司;柯达X—OMATBT医用x射线胶片购自 Kodak公司;MouseAnti—e—HATagMonoclonalAntibody购自中科英沐公司;DTF,SDS,GoatAnti—MouseIgG (H&L)一HRPConjugatedSecondaryAntibody购自Sigma公司. 2方法 2.1引物设计与合成 以pBK—CMVA—SNAT2为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 设计上下游引物,上游引物引人XbaI单酶切位点, 下游引物引入 HA—tag序列和BlpI单酶切位点.Forwardprimer:5一GCT/CTAG/A(XbaI)GATCCCTCGAC— CTCGAGATC一3Reverseprimer:5一CGCGGGC/TAA/GC(BlpI)TTAGGCATAATCGGGTACATCGTA— AGGGTA(HA)ATGTCCGCCTGCAGAGGCATCGTG一3.引物由上海生工公司合成. 2.2PCR 以pBK—CMVA—SNAT2为模板利用上下游引物进行PCR扩增.模板浓度为0.5ng/txL,上下游引 物浓度为0.4I&mo]fL.PCR条件如下:94?5min;940(230s,66.5?30S,72~C1rain×30循环;72~C 10min;4?保存.用1%琼脂糖凝胶电泳 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 .将PCR产物用胶回收试剂盒回收. 2.3pBK—CMVA—SNAT2一HA重组质粒的构建 用XbaI,BlpI限制性内切酶对PCR产物双酶切3h,1%琼脂糖凝胶分离回收得插入片段.用同样两种酶 对pBK—CMVA(1098—13~o)一SNAT2双酶切3h并去磷酸化30min,1%Agarose 胶分离出载体片段并回收 将载体片段与目的片段以1:3的摩尔比16?连接6h.将连接产物转化进感受态EcoliDI-lScx. 第1期董晓云,王函,孟雯,等:钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2一HA融合蛋白的构建及鉴定 2.4菌液PCR,双酶切和测序鉴定 菌液PCR鉴定在Kan的LB固体平板筛选,挑取单菌落接种于Kan的LB液体培养基中,PCR的 上游引物为目的片段上的F一5一c1丫rGGGG1TAccAGCGGCC1TITI,cTc一3,下游引物为载体片段上 的R一5一ATcTccA1TrcGccArIvI1cAGG一3.PCR条带大小为2603bp.PCR的反应体系为:TaqMaster Mix(2X)5txL,BstZ17I—F0.4Ixmol/L,DXY—R0.4Ixmol?L,,菌液1IxL,加ddH20至10IxL.PCR反 应条件如下:94%2min;94~C30s,65~C30s,72~C1minX30循环;72?10rain;4?保存. 双酶切鉴定对构建好的pBK—CMVA—SNAT2一HA质粒经XbaI,BlpI两种限制性内切酶进行双酶 切,双酶切鉴定体系为:(10×)NEBbuffer41L,(100X)BSA0.1IxL,XbaI(20U)0.1L,BlpI(20U) 0.1,模板400ng,加ddH20至10txL.37~C双酶切1h,随后进行琼脂糖凝胶检测. 测序鉴定对连接位点XbaI,BlpI处和完整的SNAT2一HA序列进行测序,检测酶切位点处连接正 确且整个基因序列无突变的发生. 2.5重组质粒SNAT2一HA的脂质体转染 将约1X10HEK293T细胞接种于直径为10em平皿中,于5%CO:培养箱中37?培养24h后细 胞汇聚约90%密度,按照Lipo2000的说明,重组质粒6Ixg与Lipo2000以1:3(g/)的比例先溶解于 DMEM(一)中,5min后两者混合得300L混合物,转染进HEK293T细胞中,4—6h后换液,放置在 5%CO培养箱中37?下培养36h_1,收集细胞并提取总蛋白和膜蛋白.对照组为pBK—CMVA— SNAT2转染的HEK293T细胞,实验组为pBK—CMVA—SNAT2一HA转染的HEK293T细胞. 2.6膜蛋白提取 转染36h后将对照组和实验组细胞取出,放置在冰上,用预冷的PBS(0.1mmol/LCa",1mmol/L Mg)洗1rain,共3次,然后加入1mL预冷的RIPA裂解液(50mmol/LTris—HC1pH7.4,150mmol/L NaC1,1mmol/LEDTA,1%TritonX一100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,加入cocktail蛋白酶抑制剂).将细 胞收集到eppendorf管中,冰上裂解30rain,随后于4oC,1000r/rain离心15rain后取上清,从中取出 200IxL,标记为总蛋白,并用BCA试剂盒测定蛋白浓度.将剩下的上清4?,30000r/rain离心30rain, 将沉淀溶于100txL重悬液(4Ommol/LTris—HC1pH7.4,5mmol/LMgC12,0.4mmol/LEGTA)中,标记 为膜蛋白,并用BCA试剂盒测定蛋白浓度.将总蛋白和膜蛋白样品加入1/4体积的上样缓冲液后分装, 一 20?冻存备用. 2.7WesternBlot 应用WesternB]ot技术检测SNAT2转运蛋白的表达.(1)用10%SDS—PAGE法分离总蛋白 (10g)和膜蛋白(2g).(2)将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上,4?,40V转膜2h.(3)小心取出 PVDF膜用TBST洗膜后加入5%脱脂奶粉封闭液室温振摇封闭1—2h.(4)加入用TBST(2.5%脱脂奶 粉)稀释的鼠源抗HA的一抗(1:3000),室温孵育1h.用TBST洗膜,15rainx3次.加入羊抗鼠IgG— HRP二抗(1:5000),室温孵育1h.TBST洗膜,15rain×3次.(5)放射自显影. 3结果与讨论 3.1质粒载体片段和目的片段的获得目的片段 以pBK—CMVA—SNAT2为模板利用上下游引物进行PCR扩增.取PCR扩增产物5上样,1%琼脂 糖凝胶检测,可观察到一条稍小于2000bp的条带,与目的片段1903bp相符.将PCR产物回收后,用XbaI 和BlpI单酶切位点进行双酶切,酶切后的条带为1890bp,如图1A,并作为目的片段回收. pBK—CMVA—SNAT2中)(b,LI为双酶切位点,BlpI为单酶切位点,3个酶切位点 的排序为?一XbaI— BlpI.用)(baI,BlpI限制性内切酶进行酶切,在凝胶成像系统中可观察到3条条带:XbaI—XbaI条带(2986 bp),XbaI—BlpI~(202bp),B1pI一?条带(5825bp),如图1B.其中BlpI—xbaI条带(5825bp)作为载 体片段切胶回收. 第1期董晓云,王函,孟雯,等:钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2一HA融合蛋白的构建及鉴定 4结论 SNAT2:Sodium—coupledNeutralAminoAcidTransporter2 预测SNAT2共有11个跨膜区域,N端在细胞膜内,C端在细胞膜外. 白色球表示在SLC38家族中保守性氨基酸残基,黑色球代表SNAT2独有的残基 图5细胞膜上正常表达定位的SNAT2 在SNAT2一HA质粒构建过程中,pBK—CMV是一个真核表达载体,由CMV启动子启动SNAT2基 因在HEK293T细胞中高效表达.HA序列是由9个氨基酸构成的短肽,当与其他蛋白构建在一起共同 表达时并不影响其他蛋白的功能而作为一个标签蛋白被广泛使用. 共转运钠离子的中性氨基酸转运蛋白SNAT2(Sodium—coupledNeutralAminoAcidTransporter2) 在哺乳动物组织中的广泛表达,SNAT2转运中性脂肪氨基酸的特点使得它在氧化代谢,神经传递和糖 质新生中发挥着重要的作用,IL一6还可以刺激SNAT2活性的上调,SNAT2在信号转导中可能起着 一 定的作用,因此,对SNAT2的结构和功能的解析显得日益紧迫.SNAT2作为一种定位在细胞膜上有 11个跨膜结构的膜蛋白,表达量低,分离纯化困难限制了对SNAT2结构和功能及 转运机制的深入研 究.本研究通过PCR和酶切连接,将HA连接在SNAT2的C末端,并通过菌液PCR和双酶切(图1, 2)和测序技术鉴定,成功地构建了pBK—CMVA—SNAT2一HA质粒(图3).将重组质粒用脂质体法转 染进HEK293T细胞中,通过提取总蛋白和膜蛋白进行WesternBlot检测蛋白的表达和定位,显示 SNAT2一HA蛋白为56kD左右的蛋白,能够正确定位在细胞膜上(图4). SNAT2一HA在真核生物表达载体上的成功构建,使通过抗HA抗体检测SNAT2在细胞膜上的表 达和定位提供了有效的工具,为深入研究SNAT2的结构与功能及转运机制奠定了基础. 参考文献: [1] [2] [3] MACKENZIEB,ERICKSONJD.Sodi,,m—coupledneutralaminoacid(SystemN/A)transportersoftheSLC38genefami- ly[J].PtlugemArch—EurJPhysio,2004,447(5):784—795. YAOD,MACKENZIEB,MINGH,eta1.NovelSystemAIsoformMediatingNal/NeutralA minoAcidCotransport[J]. JBC,2000,275(30):22790—22797. 张舟,章骏,孙传文.膜片钳全细胞 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 法在研究谷氨酰转运蛋白分子机制中的应用[J].上海师范大学:自然 上海师范大学(自然科学版)2012拄 [4] [5] [6] [7] [8] [9] 科学版,2009,38(4)338—341. 杨福愉.生物膜[M].1版.北京:科学出版社,2005. GUOZY,CHANGCC,LUX,eta1.Thedisulfidelinkageandthefreesulfhydrylaccessibilityofacyl—coenzymea:choles— terolacyhransferase1asstudiedbyusingmPEG— maleimide[J].Biochemistry,2005,44(17):6537—6546. ZHANGZ.GREWERC.TheSodium.CoupledNeutralAminoAcidTranspo~erSNAT2MediatesallAnionLeakConduct. ancethatIsDifferentiallyInhibitedbyTransportedSubstrates[J].BiophysicalJournal,2007,92:2621—2632. 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ConstructionandcharacterizationofSodiumcoupledNeutralAmino acidTransporterSNAT2HAfusionprotein DONGXiao-yun,WANGHan,MENGWen,LIYang,ZHANGZhou (CollegeofLifeandEnvironmentSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China) Abstract:SodiumcoupledNeutralAminoacidTransporter2(SNAT2),widespreadexpressedinthemammaliantissues,playsan importantroleinthepathwaysofglutamateglutaminecycleandgluconeogenesis.Todetermi neeasilySNAT2expressionandloca— tioninthemembrane,weconstructaneukaryoticexpressionplasmidwithHAattheCterminusofSNAT2inpBKCMVA(1098— 1300)bymolecularbiologicalmethods.AftertransientlytransfectedintohumanembryonickidneyeeHs(HEK293T),correctly expressionandlocationofSNAT2HAfusionproteinsareobservedincellmembranesbywesternblot.TheplasmidpBKCMVA (1098— 1300)SNAT2HAprovidesagoodtoolforstudyingstructureandfunctionofSNAT2inthefuture. Keywords:sodium— coupledneutralaminoacidtransporter2(SNAT2);fusionprotein;constructionandcharacterization (责任编辑:顾浩然)