用G418筛选293细胞

用G418筛选293细胞 用G418筛选293细胞，为什么不死? 我用G418筛选稳定表达CFP的HEK293细胞系，预实验用24孔板筛选用药浓度。 10天后，800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml和1100μg/ml四个浓度的细胞都死完。 我选用900μg/ml进行筛选，第一次试验细胞融和度60,时转染，24小后加G418 时，细胞融合度已达到80,，结果细胞一直不死。查看网上资料，可能是细胞融合 度太高影响了筛选。第二次实验在细胞融和度20,时转染，加G418时，细胞融合 度50,左右。加药三天后细胞未见死亡，并且几乎长满了六孔板。于是我换液，并 μg/ml，过了一天还是没死。现在细胞已长满，新长出的细将G418浓度增至1100 胞形态和转染过的也很不一样。我现在该如何做,恳请高手帮帮忙～ -------------------------------------------------------------------------------- 我做过G418筛选稳定表达HPV的293细胞株，没有碰到过这样的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。G418浓 度像你用的这么高的话如果还不死，我想会不会你的G418出现了问题，你做对照 了吗,没有转染的293细胞有没有死亡呢, -------------------------------------------------------------------------------- 多谢xuyan80219～我也怀疑G418有问题，可筛梯度时，效果还是有的啊。今天看 到培养上清中有死细胞了，可细胞已长满全皿，形态也不好了。是否要传代, -------------------------------------------------------------------------------- 转染完后，由原始的板子或瓶子以至少1:5的稀释度分板，然后再加药筛选。 例如，在24孔板中转染，转染完24小时，细胞融合度为80%，将此细胞消化下来， 一个孔转到一个25cm的瓶子中，然后加药筛选，三天换一次液，连续筛10-14天 左右就可以了。同时还要设对照，就是未转质粒进去的细胞。 应该没问题的。 -------------------------------------------------------------------------------- 好的，多谢了上面两位了～我过两天再铺细胞看看 G418筛选稳定表达细胞系[/center] 1.G418的配制: 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 一: 300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um 过滤，-20?保存。 方案二:(1)配制1M HEPES:23.8g HEPES(缓冲能力更强)粉末溶于100ml ddH2O， 10N NaOH(加量较多)调节pH至7.3，过滤除菌(较难过滤)，4?保存，终浓度 为1mol/L。 (2)5g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3)，终浓度为500mg/ml，-20?保存。 注:实验中采用方案二时效果较好。 2.制备筛选培养基:用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、 1100ug/ml、1200ug/ml 24孔板，每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基)，每个浓度4个重复，则每 次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。 200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 3ml完全培养基 998.4 997.6 996.8 996 995.2 994.4 993.6 992.8 992 991.2 990.4 G418(500mg/ml) 1.6ul 2.4ul 3.2ul 4.0ul 4.8ul 5.6ul 6.4ul 7.2ul 8.0ul 8.8ul 9.6ul 3.细胞培养:将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板(20000/孔)，12h换液，加筛选培养基培养。 4.确定G418最佳筛选浓度:将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。 注:实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。 5.铺6孔板(20万/孔)，第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。 注意:细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果(G418很难发挥作用)。 6.在换液一两次后(换液后培养过夜)，细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4?备用。 7.培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即6中所配制。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。 8.培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。 9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。 10.挑单克隆:高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。 ?套环法:用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。 ?刮除法:刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。 11.单克隆鉴定:细胞大量扩增后，?提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达 ?western检测目的基因。 注意:转染时压系时细胞不能铺的太满，不然当细胞连接紧密后，压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。 G418筛选稳定表达细胞系 1.G418的配制:取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养:取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基:在100ug/ml~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4. 6.确定最佳筛选浓度:在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug /ml、600ug/ml、 700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度～心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml，这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染:转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50%~70%汇合时; b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10~14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后; d 挑单克隆:制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测目的基因是否存在。 常见问题: 1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的, 无怪乎两种形式:整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。 2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起, 整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧 体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的: 适应性培养基的配制 a 培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液 b 离心:3000~4000rpm 10 min后，吸取上清液 c 滤过:再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。 G418筛选稳定表达细胞系 原理 分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80,的进入核内的外 源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列(neo抗性基因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有,418的选择性培养基中生长。,418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是:在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。 有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 看看。有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。关键是实验设计。 G418和筛选 筛选之前 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。 由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml,1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。 细胞系或机体 G418浓度(ug/ml) 中国仓鼠卵巢细胞 700,800 Madin-Darby犬肾细胞 500 人上皮A431细胞 400 猿CV-1细胞 500 盘基网柄菌属 10,35 植物 10 酵母 125,500 6看下面的一个试验:3×10个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%～ 加药时间 由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。 培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题:1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液:假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1:1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。 挑选单克隆的优化 为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养;或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。 鉴定之后 一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。 1.G418的配制: 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养:取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基:在100ug/ml,1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个 100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最佳筛选浓度:在筛选10,14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度～心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 :4密度传代，a 转染:转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1继续培养，待细胞密度增至50,,70,汇合时; b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10,14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后; d 挑单克隆:制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 常见问题: 1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的, 无怪乎两种形式:整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。 2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起, 整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧 体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产 物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基 来解决这一问题的: 适应性培养基的配制 a 培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24,48小时后，吸出所有培养液 b 离心:3000,4000rpm 10 min后，吸取上清液 c 虑过:再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。 eeflying 1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 ,. 我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。 ,. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。 转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。 操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了， 该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。 1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 2. 那为什么还要筛选基因,是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢,应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢,用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时 间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 4. neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。 在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了 本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。 汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。 6最近的一个实验是:3×10细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞 右汇合，今天是筛的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左 选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞～ 所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%～ 所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。 jiangql 同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考: 首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。 一般5,7天后G418就可以减半维持。 勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。 血清浓度可以高到20,，质量要好。 进行真核转染的一般程序: 克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体,将目的基因插入表达载体中,转染,筛选,鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、 试剂准备 1、 HBS(Hepes-buffered saline):876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基:含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamH?和Xho?，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建: pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。 重组质粒与pcDNA3分别用BamH?和Xho?双酶切 回收插入片段和pcDNA3线性片段 T4连接酶连接 转化DH5α 质粒制备 BamH?和Xho?双酶切鉴定。 (三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞: 1、 G418筛选浓度测定:SHG-44培养于24孔培养板?G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。 2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿(35mm)， 5每孔1-2ml培养基3×10细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。 典型贴壁细胞平板密度 生长面积培养基容积培养板大小 大约细胞数 (cm2) (ml) 5组织培养皿(φ60mm) 28 6(6×10 5-6 56孔培养板(φ35mm) 9.5 3×10 1-2 512孔培养板φ22.6mm) 4 1(3×10 0(5-1 524孔培养板(φ8mm) 0(5 0(6×10 0(25-0(5 3、 SHG-44细胞的转染: (1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。 (2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。? 溶液A:用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μ(l30μg/ml)。?溶液B:用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。?混合溶液A和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。 (3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)，边加边轻摇培养板。 (4) 37?孵育6hr。 (5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。 (6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。 4、 G418筛选:在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。 一)筛选结果鉴定: (1)基因组DNA提取?PCR鉴定外源基因 (2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解?聚丙烯酰胺凝胶电泳?免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。 (3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响 ?流式细胞仪分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?单细胞悬液?70%酒精固定?裂解细胞?核糖核酸酶消化?碘化丙啶染色?上机分析G1期和G2/M、S期比例。 ?细胞生长曲线测定:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?5×104/孔接种24孔培养板?24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞?计算细胞生长抑制百分率。 ?软琼脂克隆形成率分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?104 细胞?0.3%低熔点琼脂糖培养?1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数?计算克隆形成率抑制率。 三、注意事项 1、 优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。 2、 预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。 3、 在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37?预温。 4、 脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。 常见问题和解答: Q:我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。 A:也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少? Q:请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选,我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定,维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系, A:1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等,2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-,,,左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 ,。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失， 如果没有G418，很快会形成优势的。 ,。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。 Q:请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗, A:转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留,,,cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。 必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。现在很多代了，很稳定。 Q:1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间,如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗, 3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响, 4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响, A:1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 ,。那为什么还要筛选基因,是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓,,,个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢,应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢,用刚才的例子来说，如果我们抓着,个红球，另一次抓着,,个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 ,。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 ,。neo的产物是酶，过高的G,,,浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用 数论的，用米氏方程理解吧。 ,。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。 Another answer: 1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 ,。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。 Q:G418怎么配制, A:我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下:1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，,20度保存。HEPES缓冲液配方如下:90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。 Good answer: 推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES的简单配置:HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗,我做过G418杀伤曲线，300ug\ml就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行,会不会有什么问题, A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等,2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-,,,左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。 Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢,在这期间可以换液吗,筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418,如果要加的话什么浓度比较合适, A: 应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。 Q: 在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟 ，肉眼可以 看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性:少量是圆形，大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁～做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗, A: 看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6 孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并逐渐生长，只能叫作克隆形成。 我们一般在转染后24h将细胞消化下来(0.25%trypsin + 0.02%EDTA)，以1:10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。 你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428 培养液。 Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗,谢谢了～ A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行: 【操作方法】 (1)将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确; (2)在超净台内，弃去培养皿内的培养液; (3)用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒;(有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS) (4)将24孔培养板每孔加G418 选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基) (5)将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37?5%CO2培养箱培养，2-5天; (6)待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。 Q: 用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗,为改变这一状态，我该怎么做呢,谢谢～ A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有 的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。 1.G418的配:取1g G418溶1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养:取待测培养细胞，备细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.备筛选培养基:在100ug/ml~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4. 6.确定最佳筛选浓度:在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出这种情:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug /ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度～心得:由特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需在这么大范围内进行筛选。比如说你转染NIH3T3细胞，在我诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml，这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染:转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50%~70%汇合时; b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配好的G418筛选培养基。 c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10~14天后，可见有抗性 ，停药培养，待其逐渐增大后; 的克隆出 d 挑单克隆:备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测目的基是否存在。 常见问: 1.转进去的重组质粒以什么形式存在细胞内的, 无怪乎两种形式:整合在染色中和存在细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色的才是我们想的稳定细胞系。 2.neo基和目的基是不是一定会整合在一起, 整合是随机发生的非同源性重组，neo基表达而目的基不一定都表达，所以在筛选之后还用RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧 内的任何细胞被置外培养后，对环境都有一个适应过，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长子。这个过也是细胞同化培养基的过。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死，不换液没有死的细胞就会受到死细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利生长。我是用适应性培养基来解决这一问的: 适应性培养基的配 a 培养同源细胞至半汇合状时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液 b 离心:3000~4000rpm 10 min后，吸取上清液 c 滤过:再经直0.22um滤器过滤，再加入2倍积的新鲜培养基，低温冻存备用。 我最近半年来一直都在养MDA-MB-231细胞，细胞是从上海细胞所买的，用DMEM养。一开始还好，传代几次后发现有很多由圆形细胞组成的细胞团，间隔分布在梭形细胞中。好像两种细胞。后来向细胞所以及ATCC的技术员询问后，说是正常的。 不知有哪位同仁在培养过程是否出现类似的情况。 我觉得圆形细胞多了以后，细胞 的状态好像不是特别好。 另外，我是用慢病毒建立细胞系，以neo基因作为筛选基因。在筛选过程中，用G418筛选，浓度都达到了1200ug/ml，不明显，因此未能筛选出我想要的阳性细胞。 目前60mm的培养皿中，细胞基本长满后能有几个单克隆表达荧光蛋白，但是不表达的细胞太多，传代后容易丢失。后来我想着用枪头将单克隆刮起重新培养，但是结果也不理想，还是杂细胞太多，有时候又因为定位不是很正确。我又将细胞做有限稀释法，10个/ml，每孔加100ul，但是镜下观察基本上没有细胞。 我想neo基因不是很好的筛选标记，原因是它影响蛋白质的合成，有一定的作用时间，我做预实验发现是加G418 5天后才出现，因此在传代过程，不管是多大的密度，细胞到那个时候基本长满，我看很多研究目前都是将zeocin基因来筛选，不知谁有这样的载体, 我头都大了，不知道该怎么向老师交代。 最全的G418筛选稳定表达细胞系 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf ～(1) 分类:默认栏目 2007.4.24 12:27 作者:王老五 | 评论:2 | 阅读:4461 原理 分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80,的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列(neo抗性基因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有,418的选择性培养基中生长。,418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是:在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加 抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。 有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。关键是实验设计。 G418和筛选 筛选之前 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。 由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml,1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。 细胞系或机体 G418浓度(ug/ml) 中国仓鼠卵巢细胞 700,800 Madin-Darby犬肾细胞 500 人上皮A431细胞 400 猿CV-1细胞 500 盘基网柄菌属 10,35 植物 10 酵母 125,500 6看下面的一个试验:3×10个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%～ 加药时间 由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。 培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题:1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液:假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1:1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。 挑选单克隆的优化 为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养;或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。 鉴定之后 一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。 Protocal 1.G418的配制: 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养:取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基:在100ug/ml,1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最佳筛选浓度:在筛选10,14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度～心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染:转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50,,70,汇合时; b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10,14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后; d 挑单克隆:制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 常见问题: 1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的, 无怪乎两种形式:整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。 2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起, 整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。 培养基处理的个人技巧 体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的: 适应性培养基的配制 a 培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24,48小时后，吸出所有培养液 b 离心:3000,4000rpm 10 min后，吸取上清液 c 虑过:再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。 eeflying 1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 ,. 我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。 ,. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。 转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。 操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了， 该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。 1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 2. 那为什么还要筛选基因,是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢,应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢,用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 4. neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。 在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了 本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。 Feynman_R 汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。 6最近的一个实验是:3×10细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细 胞的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞～ 所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。 jiangql 同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考: 首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。 一般5,7天后G418就可以减半维持。 勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。 血清浓度可以高到20,，质量要好。 进行真核转染的一般程序: 克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体,将目的基因插入表达载体中,转染,筛选,鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、 试剂准备 1、 HBS(Hepes-buffered saline):876mg NaCl溶于90ml ddHO，加入1M Hepes,2 调pH到7.4,补ddHO至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基:含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的 5’-端分别引入酶切位点BamH?和Xho?，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建: pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。 重组质粒与pcDNA3分别用BamH?和Xho?双酶切 回收插入片段和pcDNA3线性片段 T4连接酶连接 转化DH5α 质粒制备 BamH?和Xho?双酶切鉴定。 (三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞: 1、 G418筛选浓度测定:SHG-44培养于24孔培养板?G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。 2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿 5(35mm)，每孔1-2ml培养基3×10细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。 典型贴壁细胞平板密度 生长面积培养基容积培养板大小 大约细胞数 2(cm) (ml) 5组织培养皿(φ60mm) 28 6(6×10 5-6 56孔培养板(φ35mm) 9.5 3×10 1-2 512孔培养板φ22.6mm) 4 1(3×10 0(5-1 524孔培养板(φ8mm) 0(5 0(6×10 0(25-0(5 3、 SHG-44细胞的转染: (1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。 (2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。? 溶液A:用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μl(30μg/ml)。?溶液B:用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。?混合溶液A和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。 (3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)，边加边轻摇培养板。 (4) 37?孵育6hr。 (5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。 (6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。 4、 G418筛选:在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。 (一)筛选结果鉴定: (1)基因组DNA提取?PCR鉴定外源基因 (2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解?聚丙烯酰胺凝胶电泳?免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。 (3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响 ?流式细胞仪分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?单细胞悬液?70%酒精固定?裂解细胞?核糖核酸酶消化?碘化丙啶染色?上机分析G期1和G/M、S期比例。 24?细胞生长曲线测定:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?5×10/孔接种24孔培养板?24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞?计算细胞生长抑制百分率。 4 ?软琼脂克隆形成率分析:SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3?10细胞?0.3%低熔点琼脂糖培养?1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数?计算克隆形成率抑制率。 三、注意事项 1、 优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。 2、 预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。 3、 在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37?预温。 4、 脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。 常见问题和解答: Q:我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。 A:也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少? Q:请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选,我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定,维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系, A:1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等,2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-,,,左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 ,。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。 ,。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。 Q:请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗, A:转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留,,,cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。 必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。现在很多代了，很稳定。 Q:1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。 2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间,如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗, 3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响, 4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响, A:1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。 ,。那为什么还要筛选基因,是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓,,,个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢,应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢,用刚才的例子来说，如果我们抓着,个红球，另一次抓着,,个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。 ,。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。 ,。neo的产物是酶，过高的G,,,浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。 ,。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。 仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。 Another answer: 1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。 ,。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。 Q:G418怎么配制, A:我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下:1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，,20度保存。HEPES缓冲液配方如下:90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。 Good answer: 推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES的简单配置:HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗,我做过G418杀伤曲线，300ug\ml就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行,会不会有什么问题, A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等,2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-,,,左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。 Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢,在这期间可以换液吗,筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418,如果要加的话什么浓度比较合适, A: 应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。 Q: 在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟 ，肉眼可以 看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性:少量是圆形，大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁～做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗, A: 看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6 孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并逐渐生长，只能叫作克隆形成。 我们一般在转染后24h将细胞消化下来(0.25%trypsin + 0.02%EDTA)，以1:10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消 化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。 你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428 培养液。 Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗,谢谢了～ A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行: 【操作方法】 (1)将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确; (2)在超净台内，弃去培养皿内的培养液; (3)用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒;(有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS) (4)将24孔培养板每孔加G418 选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基) (5)将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37?5%CO2培养箱培养，2-5天; (6)待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。 Q: 用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗,为改变这一状态，我该怎么做呢,谢谢～ A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。 G418筛选最适浓度,细胞不死的原因, 我用,,,,筛选,,,,的最适浓度，按说明书用的是,,厘米的培养皿进行的，浓度是,，,,，,,,，,,,，,,,，,,,，六个板进行的，现在已经是第,天了，我看细胞都长满了，也没见细胞死亡啊(,,,,在有效期之内啊(大家帮分析一下这是怎么回事啊,细胞死亡是什么样的啊，我的细胞本来是梭形的，我见了许多圆形的，这些是不是就是死细胞啊,第一次做这不懂，希望大家帮帮忙(谢谢了～ UID9378 帖子769 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间 2006-12-15 最后登录2011-1-3 查看详细资料 我现在也正在做转染。一般是筛选7天细胞死亡的浓度作为以后的浓度还是14天细胞死亡的浓度呢, 请教各位:我加了G418后第二天看细胞大量死亡;一个星期后发现有十几个细胞生长;两个星期后细胞开始增多，成簇生长;三、四周后细胞长满了; 这四周一直加的筛选浓度的G418，没有使用维持浓度。我想请问长出来的细胞是稳定转染株吗,谢谢大家～ 再次请教各位:我没有在显微镜下挑取细胞集落，按照上述方法长出来的是稳定转染株吗, UID11794 帖子941 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-12-26 最后登录2011-1-9 查看详细资料 TOP ssolivia 版主 发短消息 加为好友 当前离线 4# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:25 只看该作者 如果第二天细胞就死的差不多，药物浓度过大，有可能影响阳性克隆的生长。 UID16394 帖子974 精华0 积分0 阅读权限100 在线时间0 小时 注册时间2007-1-12 最后登录2011-1-8 查看详细资料 TOP cxd_781228 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 5# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:29 只看该作者 50umol/ml UID238 帖子1378 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-10-30 最后登录2011-1-10 查看详细资料 TOP lilijia 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 6# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:29 只看该作者 昨天重新铺了板，按国内的方法在,,孔板中养(每孔,,,,细胞，看看效果怎么样( UID5431 帖子1211 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-11-27 最后登录2011-1-3 查看详细资料 TOP qq3333333 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 7# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:31 只看该作者 请教各位:我加了G418后第二天看细胞大量死亡;一个星期后发现有十几个细胞生长;两个星期后细胞开始增多，成簇生长;三、四周后细胞长满了; 这四周一直加的筛选浓度的G418，没有使用维持浓度。我想请问长出来的细胞是稳定转染株吗,谢谢大家～ UID595 帖子1279 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-11-5 最后登录2011-1-10 查看详细资料 TOP z_shenghua 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 8# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:34 只看该作者 3T3, G418,稳转株，一般都是600。 UID13510 帖子485 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2007-1-1 最后登录2011-1-8 查看详细资料 TOP mywaiwai 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 9# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:36 只看该作者 100umol/ml UID457 帖子1269 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-11-3 最后登录2011-1-8 查看详细资料 TOP lupai 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 10# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:36 只看该作者 这是加,,,, 六天后的图，好像只是细胞在疯长啊 无,,,, 1.JPG (52.42k) UID16964 帖子931 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2007-1-14 最后登录2010-12-26 查看详细资料 TOP mavoboy 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 11# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:41 只看该作者 200umol/ml UID4510 帖子1286 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-11-25 最后登录2011-1-8 查看详细资料 TOP yaojiaogui 新手上路 发短消息 加为好友 当前离线 12# 大 中 小 发表于 2010-3-15 20:42 只看该作者 看来G418筛选还真是一个令人头疼的问题。 我做过PT67、NIH3T3细胞株、原代滑膜细胞、软骨细胞的G418筛选。 说说我的体会: (1) 对于不同公司、不同批次的G418其筛选浓度可能是不同的，所以即使有别人做过类似实验，其提供的浓度也只能作为参考。 (2)对于不同的细胞，有不同的G418筛选浓度。尽管整个筛选过程有些麻烦，但是为了获得稳定转染的细胞，预先分别进行各自的筛选浓度测定是十分必要的。 )其实严格的G418药敏实验包括两个部分:a、固定细胞密度下确定最佳G418(3 药物筛选浓度。以5天左右开始出现大量细胞死亡和2周内细胞全部死亡的最低浓度为最佳筛选浓度。b、确定最佳细胞平皿培养密度。正如kaige88所说，,,,,筛选关键问题是细胞密度情况，最好是细胞间没有粘连筛选效果为好。细胞密度太高，在G418筛选作用发生以前，细胞就会达到融合从而影响筛选效果。通常为了选择稳定的转染子，使用G418筛选大约5天左右，在大量细胞死亡开始以前即达到80%融合的细胞密度就是细胞最佳平皿培养密度。 (4)以最佳筛选浓度进行筛选时，要以未转染组进行对照，及时更换维持筛选浓度的培养基。 以上是一些个人体会，欢迎交流指正。 UID11219 ,,,,筛选关键问题是细胞密度情况，最好是细胞间没有粘连筛选效果为好，如果细胞间相互紧贴，细胞间的通讯原因导致,,,,筛选成问题，如果细胞密集时最好分盘后继续,,,,筛选(个人经验,,,和,,,都成功过，,,,稍高点了，一般,个星期完成～ wmhome555 者 一年前做过一次G418的筛选，我发现有部分细胞死了都会贴在瓶子上，形成所谓的“影子细胞”，其实就是死去的细胞的空壳;当时我是这样做的，没有加胰酶直接把细胞吹起来，这样只有活细胞才有机会贴壁生存，死细胞就全部浮起来了，要不你试试。 UID8043 帖子1267 精华0 积分0 阅读权限10 在线时间0 小时 注册时间2006-12-8 最后登录2011-1-10 查看详细资料 samunal 我曾做过稳转株的建立，我的细胞对G418不敏感，我用的浓度达到1mg/ml,两天后就可以看到大量细胞死亡。你的细胞由梭形变圆，也是细胞走向死亡的一个形态变化过程。 现在也在建cell line。我是用脂质体转染，转染24h后分细胞到10cm皿中G418筛选。觉得有几点很重要 1.转染效率。种细胞在转染前一天，并且转染时细胞密度达到90%左右 2.G418筛选时细胞的密度，个人感觉20-30,最好。第一次我分得太稀了，5,左右，结果3周之后细胞死光了;第二次分了50,，结果细胞太多了，不利于筛选，很多细胞存活下来。 3.细胞胰酶消化后一定要吹匀，不然细胞抱团相对于单个细胞来说，很容易在含G418的培养基中长出克隆，挑出的克隆可能表达效率不够。 至于G418浓度的问题，个人觉得与细胞种类转染的质粒和操作都有很大关系，你可以不同浓度筛选下，觉得你的400和800差别不大可能是因为细胞分得太密了。这个也可以问下实验室建过相似cell line 的师兄师姐,,