反相柱层析制备去乙酰真菌环氧乙酯

反相柱层析制备去乙酰真菌环氧乙酯 反相柱层析制备去乙酰真菌环氧乙酯 第48卷第6期 2009年儿月 厦门大学(自然科学版) JournalofXiamcnUniversity(NaturalScience) V01.48NO.6 NOV.2009 反相柱层析制备去乙酰真菌环氧乙酯 周显凤,张伟,黄耀坚,郑忠辉,沈月毛 (厦门大学生命科学学院,福建厦门361005) 摘要:研究不同条件下反相柱层析对去乙酰真菌环氧乙酯分离纯化的影响.通过RP一18中压柱层析对从红树林内生真 菌拟茎点霉(Phomopsissp.)A-1—2-3诱变后突变株GI-1固体发酵提取物中的去乙酰真菌环氧乙酯进行了纯化精制.对 RP-18柱层析纯化去乙酰真菌环氧乙酯操作条件进行了考察,使去乙酰真菌环氧乙酯的含量从28%左右提高到81.5 左右,回收率大于90.采用RP-18直接洗脱,溶析结晶,重结晶,结晶残液RP-18分步洗脱的总工艺路线,去乙酰真菌 环氧乙酯的总回收率为87.7,产品最终纯度达到99以上. 关键词:拟茎点霉;去乙酰真菌环氧乙酯;柱层析;分离纯化 中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:0438—0479(2009)06—0871—04 由于红树林特有的生境特点,近年来红树林内生 真菌已经成为天然产物的重要研究目标.去乙酰真菌 环氧乙酯,俗称南强菌素(Deacetylmyeoepoxydiene, DAM)为红树植物内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)A-1—2—3的代谢产物之一[1],其化学结构式如图1 所示.其结构新颖且具有较好的体外抗肿瘤活性,对 Rail细胞株半数抑制浓度JC.是3.0/2g/mL. 红树林内生真菌A—i-2-3诱变后突变株GI-1发 酵粗提物经HPLC分析,发现DAM含量约为28. 目前未发现其他对该化合物制备的相关研究,本文尝 试采用反相柱层析并结合溶析结晶[2]等方法对该化合 物进行分离纯化,并对层析操作条件进行了研究. 1材料与方法 1.1材料 发酵粗提物:实验室发酵得到,纯度约为289/6. RP-18硅胶为Silicagel60RP-18,德国Merck公司生 产.中压柱层析系统和旋转蒸发器(R一200)为瑞士 BUCHI公司生产,装柱硅胶为170g,柱床体积(BV) 约300mL.高效液相色谱仪(1200series),Agilent公 司生产.甲醇含色谱纯和分析纯,丙酮和正丁醇等均为 分析纯,国药集团化学试剂有限公司生产. 1.2方法 1.2.1反相柱层析 用丙酮充分洗出残留在硅胶中的杂质后,再用 收稿日期:2009—05-26 基金项目:国家海洋863项目(2007AA091503)资助 *通讯作者:xjh@xmu.edu.cn 2 o 图1DAM化学结构式 Fig.1ChemicalstructureofDAM l 10 (甲醇):(水)一10:90的溶液将丙酮充分洗出. 上样后常温下用洗脱剂洗脱并分管接收,洗脱过程中 柱压主要受流动相组成和流速的影响,本文中流速为 30mL/min时柱压一般在1.5MPa左右.通过TLC 分析,合并含DAM的洗脱液,合并后的洗脱液在旋转 蒸发器上浓缩至于,通过HPLC定量测定纯度. 1.2.2DAM的HPLC分析 浓缩后的样品用一定量的甲醇溶解并定容,用 0.22m滤膜过滤.HPLC柱为4.6mm×250mm 的C.一硅胶柱,流动相为V(甲醇):(水)一40:60, 流速为1mL/min,紫外检测波长为220nm,用外标法 做定量分析. DAM标准曲线制作:称取纯化精制的DAM干燥 晶体(纯度为99.9)20mg,用甲醇定容至1rag/ mL,样品通过HPLC分析计算峰面积得到标准曲线: Y一486.97x一7.683,R一0.9999. 1.2.3DAM的结晶 经反相柱层析并浓缩干燥的样品用丙酮溶解,再 加入一半体积的蒸馏水,充分混匀后于室温下静置结 厦门大学(自然科学版)2009焦 晶,48h后收集棒状晶体并重结晶,晶型采用光学显 微镜观察并记录图像. 2实验结果 2.1DAM的穿透曲线 图2为一定流速(30mL/min)下RP一18柱对浓度 为10mg/mL的DAM纯品吸附时的穿透曲线,从图 中可以看出,穿透时间为洗脱至2.IBV时,即穿透点, 纵坐标c/c.指料液经过层析柱后的浓度与原料浓度 之比,由穿透曲线可以计算出DAM的动态吸附容量 为37.1mg/g介质(硅胶),表明RP一18柱对DAM的 吸附量较大,可以用于该化合物的分离和制备. 2.2流动相的确定[3] 在反相层析中,常用的溶剂是甲醇,乙腈,四氢呋 喃等,不同溶剂对组分的选择性有很大的差异.反相层 析过程中洗脱剂的组成对分离效果影响较大,温度和 压力的影响不大L4].对于用中压反相柱层析分离 DAM,鉴于甲醇价格较为便宜,本文主要用甲醇一水作 为流动相对其进行初步分离.图3为进料量为58.8 mg/g介质,流速30mL/min时不同甲醇比例对DAM 的分离效果,由图3可知,以V(甲醇):(水)一30: 7O组成的流动相对DAM的选择性最高,DAM的纯 度可达65.9,回收率为97.9.图4为流动相为 (甲醇):(水)=30:70时过柱前后样品HPLC的 分析谱图,DAM的保留时间约为6.9min. 2.3进料量对DAM分离的影响 随着进料量的增加,层析吸附平衡从等温线的线 性范围向非线性范围移动.当进料量很大时,层析柱吸 附平衡往往处在非线性范围,层析的分离度等指标将 受到影响.图5为RP,18柱层析中进料量对DAM 0.30.91.52.12.73.95.1 V/BV 图2DAM在RP一18硅胶柱上的穿透曲线 Fig.2BreakthroughcurveofDAMonRP-18一silicagel column 誉 暮 团 l0o 8O 60 4o_ 2O O 图3流动相对DAM分离的影响 a.V(甲醇):(水)一25:75; b.V(甲醇):(水)=30:70; C.(甲醇):(水)一35:65 Fig.3Theinfluenceofmobilephasecompositiononthe separationofDAM 毫 薹 510l52O25 t/rain 图4反相柱层析前后HPLC分析谱图 Fig.4TheprofileofHPLCchromatographyofcrudeex— tractandafterRPLC 分离的影响,本实验流动相均为(甲醇):(水)一 30:7O,流速为30mL/min.从图5可以看出,随着进 料量的增加,回收率变化不大,均在95左右,但 DAM的纯度随之下降,特别是当进料量超过74.1 mg/g介质时,DAM的纯度将低于7O.进料量在 46.5mg/g介质左右时,层析纯化后得到的DAM纯 度可以达到85以上. 2.4流动相流速对DAM分离的影响 选取15.0,2O.0,22.5,25.0,27.5,30.0mL/min 6组流速进行实验,流动相均为V(甲醇):V(水)一 30:70,进料量均为46.5mg/g介质,结果如图6所 示.由结果可以看出,在较低流速下,DAM在流动相 与固定相之间进行充分的吸附一解吸平衡,有足够的时 间溶解在流动相中,故回收率较高,但由于流动相在柱 \0|~o0o m642O?n 第6期周显凤等:反相柱层析制备去乙酰真菌环氧乙酯 图5进料量对DAM分离的影响 I,?,?,?的进料量分别为46.5,56.5, 67.7,74.1mg/g介质 Fig.5Theinfluenceofloadingcapacityonthesepa— rationofDAM 图6流速对DAM分离的影响 Fig.6Theinfluenceofflow—rateontheseparationof DAM 图7DAM在丙酮一水体系中的晶体形态(×40) Fig.7TheshapeofDAMcrystalinacetone-watersystem (40times) 中的停留时间较长使得其他极性相似的物质也同时部 分洗脱出来,从而影响最终的纯度.同时,流速过高会 使得DAM在两相之间达不到充分的平衡,溶质缺少 足够的时间进入流动相主体,回收率下降.由图6可 见当流速控制在20.0mL/min时,回收率和纯度 分别为93.6和75,较为理想. 2.5DAM的结晶 表1洗脱方式对DAM分离效果的影响 Tab.1EffectsofelutionmodeonseparationofDAM 2.557.5l0l2.51517.5 t/n~n 图8重结晶后DAM晶体的HPLC分析谱图 Fig.8TheprofileofHPLCchromatographyofDAMaf terrecrystaUization 表2DAM纯化总结果 Tab.2TheresultsofDAMseparationandpurification 上述反相柱层析后的DAM制备液,采用溶析结 晶的方法进行了初步的结晶和重结晶试验.发现 DAM含量达到50以上便可以在结晶体系中溶析结 晶,溶液结晶一般经历初次成核和晶核生长两个阶 段].DAM在丙酮一水体系中析出的晶体形态为透 明棒状(如图7). 2.6洗脱方式对结晶残液回收率的影响 初结晶后结晶残液中仍然含有大量未结晶的 DAM,对结晶后残液进行浓缩并重新过柱.由于残液 中杂质含量较高,HPLC分析DAM的含量约为 23%,在保留时间约3.4rain时有一主要杂质峰,含量 约为4O.因此考虑采用2种洗脱方式对结晶残液进 \扫薯Id??? \口羞?一? 加加?舳??加O 《目,《 厦门大学(自然科学版) 粗提物 RP—l8 晶体I ................._J 结晶 丙酮一水体系 L—一-]结晶.厂L——1结晶残液广L一 图9DAM的制备工艺流程 Fig.9TheflowchartofDAMpreparationprocess 行柱层析,分别是直接洗脱和分步洗脱,不同洗脱方式 对DAM分离的影响见表1.从表1中可以看出分步洗 脱优于直接洗脱,2种不同方式分步洗脱分离效果有 一 定的差别,分步洗脱1中回收率和纯度均高于分步 洗脱2,因此最终选择分步洗脱1对结晶残液所含的 DAM进行分离纯化. 2.7DAM制备的基本流程与纯化总结果 经过RP,18中压柱层析,DAM的纯度可从28 提高到81.5左右.此时物料中存在少量极性与 DAM相似的杂质,采用丙酮一水体系结晶和重结晶得 到DAM的晶体,经HPLC检测其纯度达到99.9 (图8).DAM纯化总结果如表2所示,其中总回收率 为87.7(包括残液分步洗脱后的回收率). 3讨论 综合上述研究结果,提出DAM的制备工艺流程 如图9所示.发酵粗提物通过中压反相柱层析进行分 离纯化,该步骤分别对流动相,进料量和流动相流速 进行了考察,得到最佳条件为:流动相为V(甲醇): V(水)一30:70,进料量为46.5mg/g介质左右,流速 为2OmL/min.对反相层析后DAM组分进行结晶和 重结晶,得到最终纯品,结晶体系为V(丙酮):V(水) 一2:1.结晶残液通过RP一18分步洗脱,经结晶和重 结晶并得到DAM纯品,在整个工艺条件下,DAM的 总回收率为87.7左右,产品纯度达99以上. 参考文献: [1]沈月毛,杨丽姗,黄耀坚,等.抗肿瘤化合物去乙酰真菌环 氧乙酯及其制备方法:中国,CN1093858A[P].2007-01- 31. 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PreparationofDeaeetylmyeoepoxydienewith ReversedPhaseChromatography ZHOUXian—feng,ZHANGWei,HUANGYao-jian, ZHENGZhong—hui,SHENYue—mao (SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361005.China) Abstract:Theeffectsonpurificationofdeacetylmycoepoxydiene(DAM)indifferentconditionswerestudied.PreparationofDAM fromthecrudeextractoffermentationofstrainG1— 1,amutantstrainofmangroveendophyticphomopsissp.A-1—2—3,wasconducted usingC18一 silicagelreversedphasechromatographyatmoderatepressure.Intheprocess,theoperatingconditionsofC18一silicagel chromatographywerestudiedexperimentally.thenthepurityofDAMreachedabout81.5fromabout28%inthecrudeextract, andtherecoveryofDAMwasover90%.Thewholeprocessofpreparationwasasfollow:directelutionwithRP一18.solvent-out crystallization,recrystaIlizationandsegmentelutionofresidueofcrystallizationwithRP一 18.Throughthewholeprocessflow,the generalrecoveryofDAMwas87.7,andthepurityofDAMreached99orhigher. Keywords:Phomopsissp.;deacetylmycoepoxydiene;chromatography;purification