鱼类生理学实验内容

鱼类生理学实验内容 实验一 坐骨神经—腓肠肌标本制备 ........................................................................................... 1 实验3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响（选修） ......................................................................... 3 实验二 骨骼肌单收缩复合收缩和强直收缩 .............................................................................. 4 实验三 蛙心起搏点 ..................................................................................................................... 6 实验四 蛙心灌流 ....................................................................................................................... 7 实验五 脊髓反射 ....................................................................................................................... 9 实验六 红细胞与白细胞的计数 ............................................................................................... 11 实验七 血涂片制作和白细胞分类计数 ................................................................................... 13 实验八 红细胞渗透脆性的测定——浓度梯度法 ....................................................................... 16 实验八 鱼类血液指标的综合分析与差异比较 ..................................................................... 17 （必修） 掌握机能学实验的基本组织分离技术；掌握蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备的基本操作 方法。 蟾蜍等两栖类动物的某些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，其离体组织的实 验条件较简单且易于控制，在机能实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本观察神经、肌 肉兴奋性、刺激与反应的关系及肌肉收缩等某些基本特性或活动规律。 蟾蜍或蛙。 任氏液、蛙板、玻璃板、粗剪刀、手术剪、镊子、金属探针、玻璃钩针、蛙钉、滴管、 培养皿、锌铜弓、烧杯。 1、破坏脑脊髓： （1）取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握住蟾蜍，用食指按其头部使之略向前屈， 拇指按住其背部，其余三指则握住蟾蜍的四肢和腹部，其手法如图1-7-1A。 （2）用右手持金属探针，在头颅后缘，自枕骨大孔与脊椎管之间刺入椎管，先左右摆 动，离断脊髓；再向前插入颅腔，向左右摆动数次，捣毁全部脑组织，如探针确已插入颅腔， 则向各方向摆动时，即有触及颅骨的感觉。 （3）将探针撤回至枕骨大孔，但不拔出皮肤，直接向后插入脊椎管，直达骶部，轻轻 转动探针，以破坏脊髓。如探针确已在脊椎管中，则不能左右摆动，探针不得穿透脊椎管， 以免损伤内脏。最后拔出探针，用小棉球堵塞创口以止血。 脑脊髓破坏完全后，蟾蜍将失去一切反射活动，全身肌肉软瘫。如动物仍有反射动作， 表示破坏不彻底，必须重新破坏。 2、去皮和制作下肢标本： 图1-7-1破坏蟾蜍脑脊髓及剥去皮肤 （1）左手握住蟾蜍的脊柱，用粗剪刀在前肢腋窝处，将脊柱横断，并沿脊柱两侧避开 坐骨神经剪开腹壁，此时头、躯干上部及内脏全部下垂，剪除头、全部躯干及内脏组织，剪 去肛周皮肤，留下脊柱和后肢（图1-7-1B、C）。 （2）用圆头镊子夹住脊柱边缘，注意不要碰到坐骨神经，捏住皮肤边缘，逐步向下牵 拉剥离皮肤。（图1-7-1D）将全部皮肤剥除后，标本放于盛有任氏液的小烧杯中。随即洗净 蛙板、剪刀和双手上的污物及毒汁。 （3）用粗剪刀沿脊柱和骨盆的中线，将标本纵剖为两半，注意勿损伤坐骨神经。一半 置于蛙板上，以制备标本；另一半置于盛有任氏液的玻璃平皿中备用。 3、制备神经－腓肠肌标本： （1）把下肢的背面朝上，参照图1-7-2A所示，辨认蟾蜍大腿的三头肌、二头肌和半膜 肌，以及小腿的腓肠肌。 （2）用玻璃钩针和镊子仔细把二头肌和半膜肌分开，便可看到一条粗大的神经，此即 坐骨神经。用玻璃钩针把神经挑起，剪去通往大腿肌肉的神经分支，顺着神经走行方向，转 向腹腔面沿脊柱逐渐把神经主干全部分出，直到所连的椎骨为止。用粗剪刀剪除多余的肌肉 和脊椎骨，仅留下与坐骨神经相连的一小块脊椎骨，用镊子夹住这块脊椎骨，轻轻提起坐骨 神经，用手术剪剪去残余的分支，并将坐骨神经一直分离到膝关节附近。 （3）分离腓肠肌的跟腱，用线结扎跟腱，在结扎处以下将跟腱剪断。持线提起腓肠肌， 用粗剪刀剪去小腿骨和其上的肌肉，再将大腿肌肉剪去，只留长约1～2cm的股骨，并将其上肌肉刮干净，以便在肌动器上固定此标本（如图1-7-2B）。 4、检验标本：用锌铜弓的两端轻轻接触神经，若肌肉产生收缩，则表示此标本的机能 状态良好。 此为机能学基础理论验证性实验 操作技术中的最简单的手术之一。只 要仔细操作均能成功 为检验骨骼肌生理特性的基础手 术。在完成此手术的基础上再进行其 它神经肌肉特性的实验。 1、避免蟾蜍毒液及其它污物等污染坐骨神经标本。 2、不得用镊子等金属器械接触神经或用力拉扯神经。 3、剪除神经分支时不得损伤其主 干。 图1-7-2 蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备法 1.骨二头肌;2.半膜肌；3.坐骨神经；4.腓肠肌 4、移动制备好的标本时，应用镊子分别夹持脊椎骨片和股骨断端。 5、制作过程中应经常用任氏液湿润标本，以防干燥，标本必须放在任式液中浸泡数分 钟后再开始实验。 为什么在标本的制作过程中不能用清水冲洗标本只能用任氏液湿润或浸泡标本？ 掌握刺激、记录肌肉收缩的方法和测量组织兴奋性的方法；观察刺激强度与肌肉收缩反 应的关系；理解阈刺激、阈上刺激、阈下刺激、最大刺激等基本概念。 神经、肌肉组织具有兴奋性，能接受刺激而发生反应。但刺激要引起组织兴奋，其强度 和作用时间必须达到一定的阈值（称强度阈值及时间阈值）。兴奋性不同的组织其阈值大小 亦不相同，兴奋性高的阈值小，因此，阈值常作为衡量组织兴奋性高低的客观指标。 不同种类的组织兴奋性高低不同，同一组织的不同单位其兴奋性也不同，例如腓肠肌是 由许多肌纤维组成的，个个肌纤维的兴奋性高低并不相同。当用刺激时间一定的单个刺激直 接（或通过神经间接）刺激腓肠肌时，如刺激强度太弱，不能引起肌肉收缩（强度未达到阈 值的刺激为阈下刺激）；只有当刺激增强到一定强度时，才能引起肌肉发生最微弱的收缩， 这种刚能引起最小反应的最小刺激强度称阈强度（或强度阈值），强度达到阈值的刺激即称 阈刺激，此时只是少数兴奋性较高的肌纤维产生了收缩。以后随着刺激强度的增加，越来越 多的肌纤维被兴奋，肌肉的收缩也相应地逐步增大（强度超过阈值的刺激称为阈上刺激）； 当刺激强度增大到某一个强度时，整块骨胳肌中所有的肌纤维均产生了兴奋，肌肉出现最大 的收缩反应，此时如再继续增大刺激强度，肌肉的收缩却不再增大。这种能使肌肉发生最大 收缩反应的最低刺激强度称为顶强度（或最适强度）。具有顶强度的刺激称为最大刺激，最 大刺激引起的肌肉收缩称最大收缩。可见，在一定范围内，骨胳肌收缩的大小取决于刺激的 强度，这是刺激与组织反应之间的一个普遍规律。 蟾蜍或蛙。 任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪、电子刺激器）、张力换 能器、肌动器、铁支台、双凹夹、蛙类手术器械等。 1、按实验72的方法制备坐骨神经-腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min （本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。 2、熟悉计算机实验教学系统的结构、功能及其基本操作方法。 3、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在其刺激电极上，把刺激的输 出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接上两根细漆包线（其两端漆皮要去 掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。 4、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入 插口。 5、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连，不能拉得太紧。 6、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后 进入主界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验，再选择 “刺激强度与反应的关系”项单击，出现对话框填入合适的数据后点“OK”进入实验的监视。实验方式可选程控。 7、观察生物信号的显示：窗口可见弱刺激开始时肌肉无收缩反应，随着刺激强度的加 大刚能记录出收缩反应时为阈强度，以后收缩高度逐渐加高直到连续三、四个收缩的高度不 再随着刺激强度的加大而加高为止，收缩高度不发生改变的最小刺激强度为顶强度（最适强 度），此刺激就是最大刺激。可根据结果调节填入对话框的数据（主要是起始刺激强度、刺 激强度增量的设置），以描绘出满意的图形，见图1-7-3。 图1-7-3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响 此方法比较简单为检测骨骼肌兴奋收缩特性与刺激强度的关系的常用方法。 此为骨骼肌生理特性的验证性实验之一，主要应用于观察刺激强度对骨骼肌收缩的影响 以及测量骨骼肌兴奋性的高低。 1、每次连续刺激时间不宜太长，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。 2、随时用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。 3、标本固定的松紧要适度，并防止肌肉产生持续的强直收缩，才能保证做出良好的肌 肉收缩曲线图。 1、引起组织兴奋的刺激必须具备哪些条件？ 2、什么是阈刺激、阈上刺激、阈下刺激及最大刺激？ 3、为什么在一定范围内腓肠肌收缩曲线的幅度会随着刺激强度（在一定范围内）的增 加而不断增大？ （必修） 观察肌肉收缩的形式及刺激频率与肌肉收缩之间的关系，了解与掌握单收缩、复合收缩、 强直收缩的特征及其形成的基本原理。 当给肌肉一个阈上刺激时，肌肉即发生一次收缩反应，这是肌肉收缩的最简单形式，称 为单收缩，其总时程为0.11s，包括潜伏期、收缩期共0.05s，舒张期0.06s。如相继给予肌肉两个以上强度相同的阈上刺激时，若刺激之间的间隔时间超过一次单收缩的持续时间， 则肌肉将出现一连串各个分开的单收缩；若间隔时间比一次单收缩的持续时间短，则前一个 收缩波还未结束就开始后一个收缩，这样两次收缩就会重叠起来，这种现象称为复合收缩。 如果后一个收缩是在前一个收缩的舒张期内发生的，各次收缩复合的结果，会出现持续的锯 齿状的收缩曲线，称为不完全强直收缩。若刺激的间隔时间比单收缩的收缩期短，后一收缩 就在前一收缩的收缩期内发生，结果会出现一持续的平滑收缩曲线，称为完全强直收缩，刺 激强度一定时，强直收缩的高度要比单收缩高，而且在一定范围内，收缩高度随刺激频率的 增加而增高。（图1-7-4） 蟾蜍或蛙。 任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪，电子刺激器）、张力换 能器、肌动器、铁架台，双凹夹、蛙类手术器械等。 1、按实验72的方法制备坐骨神给腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min（本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。 2、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在肌动器刺激电极上，把刺激 的输出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接两根细漆包线（其两端漆皮要 去掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。 3、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入 插口。 4、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连。注意：不能拉得太紧。 5、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后 进入主页界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验”，再 选择“刺激频率与反应的关系”项单击，出现对话框后选择现代或经典实验进入实验的监视。 6、调节对话框的数据，如刺激强度（一般为5—7.5V）、刺激频率增量（一般为1、6、10、15、20、30Hz）的设置，直至做出满意的肌肉收缩曲线图形，即记录出几个单收缩曲线 和一段不完全强直收缩及完全强直收缩曲线，见图1-7-4。 图1-7-4 骨骼肌的单收缩和强直收缩 上：收缩曲线 下：刺激标记 1.单收缩 2.不完全强直收缩 3.完全强直收缩 为检验骨骼肌兴奋收缩特性与刺激频率关系的常用方法，操作简单易于掌握。 为骨骼肌生理特性验证性实验之一，主要应用于观察刺激频率对骨骼肌收缩的影响。 1、连续刺激时间不宜太长，每次刺激持续时间要保持一致，不得超过3—4s，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。 2、经常用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。 3、标本固定的松紧要适度，才能保证做出良好的肌肉收缩曲线图。 1、何谓单收缩？单收缩的潜伏期包括哪些时间因素？有神经和无神经的标本有何差 异？ 2、为什么刺激频率增高，骨骼肌收缩幅度也增高？ 3、何谓不完全强直收缩、完全强直收缩？它们是如何形成的？ 4、如果能用单根的腓肠肌纤维重复以上实验，预期的实验结果将会怎样？为什么？ （必修） [] 利用改变局部温度和结扎方法来观察蛙心起搏点和蛙心脏不同部位的自律性高低。 动物心脏的特殊传导系统具有自动节律性，但心脏各部分自律性高低不同，哺乳动物以 窦房结的自律性最高。正常心脏搏动每次都是自窦房结传出，传到心房，心室引起收缩，所 以窦房结被称为哺乳动物的心搏起点。两栖类动物心搏起点是静脉窦，鱼类的心脏则具有 2～3个这样的自动节律性中枢。 [] 蟾蜍或蛙 [] 蛙类手术器械、蛙心夹、滴管、线、任氏液、小试管、35～40?热水。 [] 1、取蟾蜍一只，用探针破坏脑和脊髓后将蟾蜍仰卧固定在蛙板上，用剪刀剪开胸骨表 面皮肤并沿中线剪开胸骨，可见心脏在心包内，仔细剪开心包暴露心脏。 2、参照图l-7-7、图1-7-8识别静脉窦，心房和心室。观察它们的跳动程序并计算它们 在单位时间内的跳动次数。 3、用盛有35～40?热水的小试管分别靠近心室与心房，静脉窦，改变其局部温度观察 它们的跳动次数有何改变。 4、用镊子在主动脉：下穿一线备用，用玻璃针穿过主动脉干下面，将心尖翻向头端， 暴露心脏背面，在静脉窦和心房交界的半月形(窦房沟)处将线作一结扎以阻断静脉窦与心房 之间的传导，观察心房的跳动是否停止?静脉窦是否仍在跳动? 5、待心房、心室恢复跳动后，分别计数单位时间内静脉窦和心房、心室跳动频率，两 者是否一致? 6、记录上述实验观察结果，并根据其结果作出分析和讨论。 图1-7-7 蟾蜍心脏腹面观 图1-7-8 蟾蜍心脏背面观 [] 验证心肌自律性的基本方法，操作简单易于掌握。 [] 为心肌生理特性验证性实验，应用于检测心脏起搏点及其心脏各部位自律性高低。 [] 在沿窦房沟用丝线结扎时，结扎线应尽量靠近心房端，以免伤及静脉窦。同时可确保心 房侧无静脉窦组织残留；结扎要紧以完全阻断静脉窦与心房间的传导。结扎后，应注意观察 心脏各部分节律性活动先是出现什么变化?而后又将如何? [] 1、在正常情况下，静脉窦、心房和心室三者的节律性舒缩活动有何不同?为什么? 2、分别用盛有40?左右热水的小试管接触心室、心房和静脉窦，将引起什么变化?为什么? 3、在静脉窦与心房交界部的窦房沟处作一结扎，观察心脏各部分的节律性活动立即有 何变化?为什么? 4、稍待片刻，再观察心脏各部分的节律性活动又将如何?为什么？ （选修） 掌握离体蛙心的灌流方法；了解内环境理化因素的相对恒定对维持心脏正常节律性活动 ++2+的重要作用；并观察Na、K、Ca、肾上腺素、乙酰胆碱等对心脏活动的影响。 蛙心起搏点静脉窦能按一定节律自动产生兴奋，因此将离体蛙心保持在适宜的环境中， 在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动；心脏正常的节律性活动有赖于内环境理化因 素的相对稳定，所以改变灌流液的成分，则可以引起心脏活动的改变。 蛙或蟾蜍。 任氏液、0．65%NaC1、2%CaC1、1%KC1、1：10000肾上腺素、1：10000乙酰胆碱、计2 算机、生物信息采集处理系统（或二道仪、刺激器）、蛙类手术器械、蛙心夹、蛙心插管、 机械换能器、铁架台、双凹夹、试管夹、小烧杯、滴管、丝线、玻璃分针。 1、离体蛙心的制备： （1）取蟾蜍一只破坏其脑和脊髓后，仰卧位固定于蛙板上，剪开胸壁，暴露心脏，在两 个主动脉干下穿两根细线将其中一根打活结备用（用以结扎和固定插管）。将连有细线的蛙 心夹在心舒期夹住心尖部。 （2）用玻璃分针将心脏轻轻向上翻转，将主动脉干下的另一根细线向下拉，在静脉窦的 远端做一结扎（切勿扎在静脉窦上），以阻止血液回流心脏。 （3）将心脏翻回原位置，用眼科剪在主动脉球上端向下剪一斜向的切口，将盛有少量任 氏液的蛙心插管由切口插入动脉球，再将蛙心插管尖端转向背侧及左下方，于心缩期插入心 室内（插管不可插得太深）。插管如已进入心室，则见管中液面随着心搏而升降，此时即可 将预置线的活结扎紧，并固定于插管壁的小钩上，以免插管滑出心室。 （4）将心脏连同静脉窦一起剪下，必须注意不得损伤静脉窦。吸去管内的血液，并用任 氏液反复冲洗心室内的余血，以防止血液凝固而影响实验的进行。 2、实验装置：将蛙心插管用试管夹固定于铁架台上，蛙心夹的细线连接在机械换能器 的簧片上。换能器的输出线与计算机的输入接口相连接。 3、打开计算机，进入Biolap98菜单条 ?实验项目（单击）?循环实验?蛙心灌流（单 击），并根据蛙心的灌流液做好标记。（图1-7-10） 4、观察项目： （l）记录心脏收缩曲线，观察心率及收缩 幅度，作为正常对照。 （2）吸去插管内的任氏液，换以等量的 0．65%NaC1，观察并记录心脏的活动变化。 （3）吸出管内溶液并用任氏液冲洗数次后 换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入 2%CaC1 1～2滴，观察并记录心脏的活动变化。 2 （4）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心 脏 恢复正常后，加入1%KCI 1～2滴，观察并记录 心脏的活动变化。 图1-7-10蛙心灌流仪器连接方法 （5）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000肾上腺素2～ 3滴，观察并记录心脏的活动变化。 （6）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000乙酰胆碱1～ 2滴，观察并记录心脏的活动变化。 检验心肌生理特性的基本方法之二，手术及操作亦较简单易于掌握。 为心肌生理特性验证性实验，主要用于验证或检测内环境因子对心脏活动的影响。 1、蛙心夹应一次夹住心尖，不宜反复多次以致损伤心脏，导致漏液。蛙心夹与换能器 簧片的连线呈一定的倾斜度，以防止溶液滴入换能器。 2、当各项实验效果明显后，应及时将插管内溶液吸出，用任氏液反复冲洗数次，待心 跳恢复正常后，再进行下一项实验。 3、各种溶液的吸管必须分开，不要混用。 4、在实验过程中，蛙心插管内灌流液的液面高度应适宜，一般为1～2cm，在各项观察 项目中，液面高度应保持一致。仪器各项参数一经调好也不可变动。 5、加药后效果不明显可适量滴加并密切注意计量增加后的实验结果，出现变化应立即 更换任氏液，加药过量会导致不可挽回的后果或难以恢复的心脏停跳。 6、每进行观察项目时，先记录一段正常对照曲线，然后再加入待试液，并记录其效应。 +2++高Ca高Na对心脏活动有什么影响，其机理如何？ 2、从心肌生理特性分析以上实验结果。 1、高K [] 通过对某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性与反射活动的关 系 掌握反射时的测定方法，通过用不同浓度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射，了解刺激 强度与反射时的关系。 以脊蛙的屈肌反射为指标，观察反射中枢活动的某些基本特征，并分析它们产生的机制。 在中枢神经系统的参与下，机体对刺激所产生的具有适应意义的规性律性反应过程称 为反射。将动物的高位中枢切除仅保留脊髓的动物成为脊髓动物（如脊蛙），它们产生的反 射活动为单纯的脊髓反射，由于失去高位中枢的控制反射活动较为简单，便与观察与分析反 射过程的某些特征。 反射活动的结构基础是反射弧。典型的反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出 神经和效应器五个部分组成。反射弧必须保持完整性，才能引起反射，其中任何一个环节受 到破坏，反射活动就无法实现。 在反射活动中，由于神经元特别是中间神经元联系方式的不同，使反射活动表现出种种 特征。如：反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历的时间）的长短、反射活 动空间范围的大小、反射活动持续时间的久暂以及引起反射活动的刺激条件等等。 [] 蟾蜍。 [] 硫酸溶液（0．1%、0．3%、0．5%、1%）、纱布。蛙类手术器械、铁架台、血管钳一 把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约1cm×1cm）、刺激电极两个、双输出电刺激器一台、烧杯。 [] 1、实验准备 取蟾蜍一只，用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅，制成脊蟾蜍。将动物俯卧位固定在蛙 板上，于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤，在股二头肌和半膜肌之间的沟内找到坐骨神经干，在 神经干下穿一条细线备用。手术完后，用肌夹夹住动物下颌，悬挂在铁架台上。 2、实验项目 （l）反射中枢活动的某些基本特征 ?反射时的测定：在平皿内盛适量0.1%硫酸溶液，将蟾蜍一侧后肢的一个脚趾尖浸入 硫酸溶液中，同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要的时间，并立即将该足趾 浸入搪瓷杯水中浸洗数次，然后用纱布拭干。用上述方法重复三次，注意每次浸入趾尖的深 度要一致。三次所测时间的平均值，即为此反射的反射时（两次实验间隔至少2～3min）。 然后平皿中分别换以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重复上述测定，比较四种浓度硫酸所测 之反射时是否相同。 ?反射的空间范围（扩散）：将一个电极放在蟾蜍后肢的足面皮肤上，先给予弱的连续 电刺激，观察发生的反应，然后依次增加刺激强度，观察每次增加强度所引起反射的空间范 围有何变化。 ?反射的持续时间（后放）：在观察反射的空间范围中，还要注意观察随刺激强度的增 加，所引起反射持续的时间有何变化，并以秒表计算至刺激停止起到反射活动结束之间共持 续多少时间（后放）。 ?阈下刺激引起反射的条件：将两个刺激电极各连接刺激器的输出端，然后分别与蟾蜍 同一后肢相同的皮肤区域接触，用单个电刺激找出引起屈肌反射的阈值，再用略低于此阈值 的阈下刺激分别给以单个电刺激，如均不引起反应，然后把两个电极放在皮肤的同一区域， 距离不超过0.5cm，当同时给予阈下刺激时，观察可否引起反射。 另外，只放一个电极在后肢皮肤上，在给一次阈下刺激不能引起反射的情况下，换以连 续刺激并依次增加刺激频率，记录哪一频率最早引起反射，并计算该频率刺激的时间间隔（即 刺激频率的倒数）。 ?反射的抑制：用0．5%硫酸溶液测定反射时，然后用止血钳夹住一侧前肢，给一个 较强的刺激，待动物安静后再测反射时，观察其有无延长？ （2）反射弧的分析 ?用浸有1%硫酸溶液的小滤纸片贴在下腹部。观察双后肢有何反应？待反应出现后， 将动物浸于搪瓷杯的清水内洗掉滤纸片和硫酸，用纱布擦干皮肤。提起穿在右侧坐骨神经下 的细线，剪断坐骨神经，再重复上述实验，比较两次结果有何不同？ ?分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿内（两侧浸没的范围相等且仅限于趾 尖），双侧后肢是否都发生反应？ ?沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口，将切口以下的皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要 剥干净），再用1%硫酸溶液浸泡该趾尖（切不可将其他趾尖浸入），观察该侧后肢的反应。 ?将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤，观察引起的反应，用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫 酸，擦干皮肤后，将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓，再重复刚才的实验。结果如何？ [] 操作简单、易于掌握，为常规实验方法。 [] 为了解中枢神经系统某些特征及活动规律的验证性实验，主要用于观察分析中枢神经系 统内反射中枢的活动规律及反射弧的完整与反射活动的关系。 [] 1、离断颅脑部位要适当，太高可能保留部分脑组织而出现自主活动，太低也会影响反 射的引出。 2、每次用硫酸溶液或纸片处理后，应迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮肤上残存的硫酸， 并用纱布擦干，以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液。测定反射时的硫酸浓度应由低到高。 3、施加电刺激时，要区别是通过皮肤刺激了传出神经或肌肉引起的局部反应，还是引 起的反射性反应。 4、浸入硫酸溶液的趾尖应仅限于一个，而且每次浸泡的范围也应恒定，切勿浸入太多。 [] 1、何谓反射时，反射时与刺激强度之间有何关系？ 2、反射弧包括哪几部分？剥去趾关节以下的皮肤后不再出现原有的反射活动，为什么？ 3、何谓时间总和和空间总合？ （必修） [ 掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞 含量及其差异。 采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数 很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在 显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白 细胞个数。 [] 鲤、鲫或草鱼。 [] 显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒 棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.85 —0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 [] 1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大 小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数 室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大 方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以 计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方 格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四 角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因 此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。 2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9% 的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。 鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布 包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据 解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。 图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区 尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每 尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。 将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复 吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。 3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸 管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但 必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多 次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。 4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距 准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细 胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依 照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。 计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10 个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相 差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净， 重新摇匀稀释血液，再充液计数。 5．计算 红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以 10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。 图1-5-3 血细胞计数方式 （实心圈表示计数的红细胞， 空心圈表示不应计数的红细胞） 3计算公式为：红细胞数/= 5个中格红细胞数×稀释 mm 倍数/计数的5个中格容积 （1） 稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。 3（2） 计数室5 个中格容积为0.2×0.2×0.1×5 = 0.02 mm。 白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。 3计算公式为：白细胞数/ = 4个大方格白细胞数×稀释倍数/ 计数的4 个大格容积 mm 3。 （1） 稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。 采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种（2） 计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4= 0.4 mm自动化分析方法，但该方法由于经典、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。 [] 红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的1／2，故使血液 3呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100—300万个/mm， 3 3 高者可达400万个/mm低者数十万/ mm。 鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞 数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等） 而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。 鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而 变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白 细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。 [] 1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）? 95%酒精（两次）? 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。 2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。 3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。 [] 1、综合实验所得结果，与红、白细胞的正常值相对照，有何变异？为什么？ 2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定的数量水平？ 3、试讨论鱼类红细胞的正常值及其应用意义？ 4、白细胞数量的变化有何生理意义？ 5、血细胞计数室中央的大方各中每一种方格的容积是多少？ 1、白细胞稀释液 冰醋酸（破坏红细胞） 1.5毫升 1%龙胆紫（染白细胞核便于计数） 1毫升 蒸馏水 加至100毫升 2、红细胞稀释液 NaCl (维持渗透压) 0.5克 Na SO(使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉) 2.5克 24 HgCl （固定红细胞形状） 0.25克 蒸馏水 加至100毫升 （必修） [ 了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不 同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。 白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类 方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依 据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗 粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物 消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物 酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺 等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺 和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物， 各种细菌和病毒。淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。 各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）染色法和 姬姆萨(Giemsa)染色法。 [] 鱼（淡水鱼和海水鱼均可）。 [] 试剂： 染色液的配制： 1、姬姆萨（Giemsa）染液的配制 （1）原液配制 Giemsa 粉剂 0.8 g 甘油（医用） 50 ml 甲醇 50 ml 将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于 37～40?温箱内8～12h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。 （2）稀释液 临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）50 ml，即为Giemsa稀释 液。 （3）pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整 pH至6.4~6.8，加水至1000ml。 2、 瑞氏（Wright′s）染液的配制 （1）原液配制 瑞氏染料粉剂 0.1g 纯甲醇 60 ml (2) 配制步骤： ? 将瑞氏染料粉放人乳钵内，加少量甲醇研磨。 ? 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研 磨，如此反复操作，直至全部染料溶解为止。 ? 装入玻璃瓶内密封，在室温下保存一周即可使用。 ? 新鲜配制的染料偏碱性，放置后呈酸性，染液储存时间越久，染色愈好。 器材： 显微镜，香柏油，载玻片，盖玻片，玻片水平支架，采血针或注射器，计数器，小滴管， 蜡笔，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液，姬姆萨染液，蒸馏水。 [] 1、血涂片的制作：取一滴血（采血方法见实验49），滴于洁净无油脂的玻片一端。左 手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉， 当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端（图1-5-4）。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不 可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。 2、血涂片的染色步骤： （1）用蜡笔在血膜两端各划一道线，以免染料外溢，置涂片于水平的支架上。 （2）用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上，并盖满划出的涂片部分固定约半分钟。 （3）用小滴管再加1.5倍缓冲液或姬姆萨（Glemsa）染液，轻轻摇动，并轻吹液体使 染色液与缓冲液混合均匀，静置5—10分钟。 （4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左右时亦可代用）。冲洗血膜时应将 玻璃片持平，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。 3、白细胞分类计数：先用低倍镜检查涂片及染色是否均匀。然后加一滴香柏油于血膜 厚薄均匀处（一般在体尾交界处），在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数，计数 移动时避免重复。根据所见到的100个白细胞，记录各种白细胞所占的百分数。 例如：嗜中性白细胞分数（%）=计数嗜中性白细胞个数/计数总白细胞个数×100%。 图1-5-4 血涂片制备示意图 红细胞呈桔红色；中性粒细胞核为蓝紫色，颗粒呈蓝紫至紫红色；嗜酸性粒细胞颗粒呈 鲜红至桔红色；嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色；淋巴细胞核呈深蓝紫色，胞质呈天蓝色；单 核细胞核呈浅紫色，胞质呈灰蓝色。 显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法，目前还无任何仪器可以完全取代。 它能够准确地根据细胞形态特征进行分类计数，并可及时发现异常细胞。血液分析仪进行细 胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测，检测速度快， 分析细胞多，适宜于大批量标本的分析。对其检测出来的异常标本，要准确识别细胞类别及 确认病理改变还必须以显微镜检查为准。 [] 在不同的生理状态下，不同种类白细胞数目波动较大。如运动、寒冷、消化期、繁殖期 等，此外，在机体失血、剧痛、急性炎症、慢性炎症等病理状态下，白细胞也增多。例如， 急性感染、急性中毒、严重组织损伤、恶性肿瘤等中性粒细胞增多；某些病毒、细菌感染、 某些慢性感染时，淋巴细胞数量增多。 [] 1、所用玻片必须干净，无油污。 2、如染色太浅，可按照原来步骤重染；染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染。 3、如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。如红细胞呈紫红色，表示染色时间过长。 4、染色时切勿使染液干涸，否则发生不易去掉的沉淀。 5、冲洗时不可先倾倒染色，应先轻轻摇动玻片，缓慢加水使沉渣泛起，然后再用水冲 洗。 6、水冲洗时间不宜过长，否则会脱色。 [ 1、试述瑞氏（Wright’s）染色法区分各种白细胞的依据？ 2、怎样才能制备一个形态清晰的血涂片？ 3、实验所得结果与正常值相对照，有何变异？为什么？ （必修） [ 掌握测定红细胞渗透脆性的方法，测定不同鱼类红细胞渗透脆性并理解细胞外液渗透压 对维持细胞正常形态与功能的重要性。 正常情况下，动物红细胞内的渗透压与血浆的渗透压相等，哺乳动物约相当于0.9％NaC1溶液的渗透压，鱼类的等渗溶液为0.85％～1.0％NaC1溶液。将红细胞置于等渗溶液 中， 其形态和容积可保持不变。若将红细胞悬浮于低渗的NaC1溶液中，则水分进入红细 胞使之膨胀甚至破裂溶解，但红细胞对低渗溶液具有一定的抵抗力，其抵抗力大小与红细胞 膜脆性有关。通常用不同浓度的NaC1溶液来测定红细胞膜的渗透脆性，红细胞膜渗透脆性 大的，则对低渗NaC1溶液的抵抗力小，NaC1溶液的渗透压稍有降低，此类红细胞便发生 破裂而溶血。反之，脆性小的则对NaC1溶液的抵抗力大，Nac1溶液的渗透压降到很低时 才使这些红细胞破裂溶血。刚能引起一部分红细胞溶解的低渗NaCl的浓度可以代表最小抵抗值；使全部红细胞溶解的NaCl浓度为最大抵抗值。通常就以抵抗值表示红细胞的渗透脆 性。在刚成熟的红细胞，其膜的渗透脆性较小，而衰老的红细胞膜的渗透脆性较大。 [] 鲤、鲫或草鱼。 [] 5毫升无菌注射器，消毒棉球，中试管，小试管，试管架，滴管，1%NaCl， 蒸馏水，75%酒精，碘酒，凹瓷盘，1%肝素钠或10%草酸钾溶液，3.8% 枸橼酸钠。 [] 1、 取小试管10支，编号后，按下表制成不同浓度的NaCl 溶液。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1%NaCl (ml) 0.90 0.65 0.60 0.55 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 蒸馏水（ml） 0.1 0.35 0.40 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.70 0.75 NaCl溶液浓度0.9 0.65 0.60 0.55 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 （%） 2、 用润湿过抗凝剂的注射器从鱼尾静脉采1毫升血，立即向每一试管中各加一滴血， 将试管夹在两掌心中迅速搓动，使血液与管内NaCl溶液混匀（切勿用力震荡），室 温下放置2小时后观察结果。多余血液注入盛有0.1毫升3.8% 枸橼酸钠的试管内。 加以混合，以备重复实验使用。 3、观察结果：记录开始溶血和完全溶血的两管NaCl溶液浓度。 按下列标准判断有无溶血、不完全溶血或完全溶血。 （1）上清液无色，管底为混浊红色或有沉淀的红细胞，表示没有溶血。 （2）上清液呈淡红色，管底为混浊红色表示只有部分红细胞破裂溶解，为不完全溶 血。开始出现部分溶血的NaCl溶液浓度，即为红细胞的最小抵抗值，也是红细胞的最大脆 性。 （3）管内液体完全变成透明的红色，管底无细胞沉积，为完全溶血。引起红细胞完 全溶解的最低NaCl溶液浓度，即为红细胞的最大抵抗值，即红细胞的最小脆性。 该方法筒单实用，但应严格控制血量（血液和NaCl溶液之比约为1:25）和防止血标本在体外溶血，否则易影响试验的准确度。本试验敏感性较差，需结合其他实验室检查结果进 行分析。 [] 渗透脆性指标对于掌握细胞膜的特性、形态和生理功能具有一定意义，如膜的特性、流 动性、结构、组成成分等的改变，均使膜的脆性发生改变。 [] 1、配制1.0%NaCl溶液，称量必须准确。 2、取血时一定要避免溶血。 3、滴加血液时要靠近液面，使血滴轻轻滴入溶液以免血滴冲击力太大，使红细胞破损 而造成溶血的假象。． 4、加入血滴后，轻轻摇匀溶液，切勿剧烈振荡。 5、应在光线明亮处观察结果。如对完全溶血管有疑问，可用离心机离心后，取试管底 部液体一滴，在显微镜下观察是否有红细胞存在。 [ 1、为什么同一个体的红细胞渗透脆性可以不一样？ 影响红细胞渗透脆性的因素有哪些？ 2、何谓红细胞的最小抵抗值和最大抵抗值？ 3、输液时为何要采用等渗溶液？ ［目的］检测饱食与饥饿状态鱼体内的生理指标变化，掌握常规测定项目的操作方法 和生理意义，能够对不同营养状况的鱼体代谢水平进行解释。主要检验项目有血液红细胞数、 红细胞渗透脆性、红细胞比容、血浆甘油三酯和肌酐。 ［原理］鱼类的生长是与其在最适环境条件下的营养水平有直接关系的，当饲喂水平发 生变化后，其体内的基本代谢活动会受到一定的影响，从而影响到某些生理指标的改变。 ［实验材料］ 动物 鲫鱼 实验器材 手术器械、玻璃试管、离心机、移液枪、分光光度计、水浴锅、显微镜等。 药品 草酸钾、草酸铵、氯化钠、甘油三酯与肌酐试剂合 ［方法与步骤］ 1． 采血 实验用血为经鲫鱼尾动脉采取的血液，经抗凝后备用。 2. 红细胞计数 采用红细胞计数板进行镜下计数，要求对每尾鱼的血细胞取四个样本 数，经平均后作为试验最终数值。 3. 渗透脆性测定 实验测定的渗透液浓度值11个，分别设定为0.54，0.52，0.48，0.46， 0.44，0.42，0.40，0.38，0.36，0.34，0.32。将一滴抗凝血滴入溶液后，混匀。静置1～1.5h 后，观察结果。 4. 比容测定 将至少3mL血液放入离心管（不得有气泡），经3000转／min离心30min后, 取出离心管，记录红细胞／血液体积数值的比值，在离心5min后，如2次离心结果相同，则上述比值即为红细胞比容。 5. 血浆处理 比容测定结束后，将血浆移入血浆管待用。 6. 甘油三酯与肌酐测定 甘油三酯与肌酐测定是采用酶解法进行测定，以微量血浆加入 酶解液后，经水浴呈现除有色物质，经分光光度计测定后，计算出浓度值。 甘油三脂测定方法： 操作 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 标准（ST） 样本（S） 空白（B） 标准液 20μL － － 样本 － 20μL － 工作液 1.5mL 1.5mL 1.5mL 混匀，37?水浴10min。在波长500 nm处，以试剂空白（B）调零，读取标准管（ST）及样品管（S）的吸光度值（A）。 计算 甘油三酯（mg／dL）＝样品A／标准A ×200 7. 数据处理 本实验的所有实验内容要求按照具体项目分类，对饥饿与饱食的每项指标 经统计处理后，分析讨论。 ［注意事项］1. 采血过程中要求减少组织液和体表水的混入量，保证血液纯度。 2. 比容测定时，离心机温度不能过高造成血液中测定物质消耗。 3. 分光光度计使用前，要对比色杯进行调零。