microRNA的引物
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
以ssc-miR-222-3p为例设计引物,其成熟体序列为:AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT
反向引物:每个反向引物的都带有一段固定的序列,可以形成一个茎环,
固定的序列为:5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3,
在这个序列后加上八个碱基,这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列,就是CTGGGTCT的反向互补:AGACCCAG ,最后得到的反向引物的序列为
5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGACCCAG -3,
正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG
在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列,成熟体除掉后面六个碱基后序列为:AGCTACATCTGGCTACT
5,-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACT -3,
URP:统一反向引物,也是一段固定的序列,TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ,R-AACGCTTCACGAATTTGCGT
使用
方法
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:
1逆转的引物:所有要做的miRNA反向引物的混合,每个10微升
2PCR的引物:50微升的体系,30微升的水,10微升的正向引物,10微升的URP
2.hsa-miR-124(hsmq-0032 引物)
推荐退火温度:60℃
hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图
3.hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)
推荐退火温度:60℃
hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图
4.hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)
推荐退火温度:60℃
hsa-miR-137 扩增曲线示意图hsa-miR-137 融解曲线示意图
5.hsnRNA U6 引物测试
推荐退火温度:60℃
hsnRNA U6 扩增曲线示意图hsnRNA U6 融解曲线示意图
6. 电泳结果
取5μl PCR 产物进行电泳,胶浓度(3%),所有检测都为两个阳性,一个NTC
其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为
hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6[img]
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