【word】 小麦全蚀病拮抗木霉ZBS6的分离、筛选及鉴定

【word】 小麦全蚀病拮抗木霉ZBS6的分离、筛选及鉴定 小麦全蚀病拮抗木霉ZBS6的分离、筛选及 鉴定 河南农业科学 小麦全蚀病拮抗木霉ZBS6的分离,筛选及鉴定 孙虎,薛保国,杨丽荣,全鑫,组艳青 (1.河南省农业科学院植物保护研究所,河南郑州450002;2.河南农业大学植物保护学院,河南郑州450002) 摘要:从河南省农科院试验地小麦田土中分离获得12株木霉,通过室内对峙试验,筛选出1株对 小麦全蚀病菌拮抗作用较强的木霉菌株ZBS6,室内测定其抑茵率和寄生率分别达到82.5和 8o.并对该拮抗木霉进行了抑菌谱测定,研究了不同培养条件对该木霉菌株茵丝生长及产孢量 的影响,同时利用形态学及分子鉴定相结合方法对木霉菌株ZBS6进行了鉴定.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:ZBS6 具有广谱的抑茵活性.其最适培养条件:以葡萄糖为碳源,基质酸碱度(pH)5.0,温度为25?,光 暗交替培养;光照处理对菌丝生长影响不明显,但显着促进产孢量.结合形态学特征及rDNAITS 序列聚类分析结果,ZBS6鉴定为绿色木霉(Trichodermaviride). 关键词:小麦全蚀病;木霉;鉴定;拮抗作用 中图分类号:$435.121文献标识码:A文章编 号:1004—3268(2010)06—0079—06 Isolation,ScreeningandIdentificationofAntagonistic TrichodermaZBS6toWheatTake—al1 SUNHu,XUEBao—guo,YANGLi—tong,QUANXin,ZUYan—qing (1.InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China; 2.CollegeofPlantProtection,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China) Abstract:TwelveTrichodermaisolateswereisolatedfromwheatfieldsinHenanAcademyofAg— riculturalSciences.ThroughindooropposingtestweisolatedoneTrichodermastrainZBS6, whichshowedstrongantagonism.Itsantifungalandparasiteratecanreach82.5and80,re— spectively.Furthermore,weassayeditsantifungalrangeaswellashyphagrowthandsporifica— tionimpactunderdifferentculturecondition.MeanwhileweidentifiedtheTrichodermastrain ZBS6usingmorphologicalandmolecularmethods.Theresultsareasfollows:ZBS6haswide rangeantifungalactivityandtheoptimumcultureconditionisglucoseascarbo nsource,pH5.0, 25?,lightanddarkalteration.Nodistincteffectwasseenbylighttreatment,b utsporification wasincreasedapparently.Combinedwithmorphologica1characteristicandcDNAITSsequencea— lignmentanalysis,ZBS6isidentifiedasTrichodermaviride. Keywords:Wheattake—all;Trichodermaspp.;Identification;Antagonism 小麦全蚀病(wheattake—al1)是一种典型的根部 土传病害,由子囊菌亚门的禾顶囊壳菌小麦变种 (Gaeumannomycesgramims伽r.tritici)侵染所致. 自1868年首次报道以来,目前已广泛分布于世界各 地.我国小麦全蚀病于上世纪50年代在河北首先 发现,9O年代初传播至河南,并且扩展迅速,局部地 区造成严重危害].由于缺乏抗病品种和有效的化 学防治药剂,所以利用微生物之间的拮抗作用来控制 收稿日期:2009—12—09 基金项目:农业部948国际合作项目(2008一Z22) 作者简介:孙虎(1980一),男,河南驻马店人,助理研究员,博士,主要从 事微生物农药的开发研究.E—mail:clearshu167@163.corn *通讯作者:薛保国(1957一),男,河南汝阳人,研究员,博士,博士生导师, 主要从事微生物学研究. E—mail:xuebbb@gmail.corn 2010年第6期 小麦全蚀病危害具有广阔的应用前景. 目前,国内外有不少关于小麦全蚀病生物防治的 研究报告,报道较多的拮抗微生物是荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens)_4J.木霉菌(Trichoderma spp.)用于防治植物病害国内外已有较多研究,如立 枯病,枯萎病,猝倒病,白绢病的防治等],但是对于 小麦全蚀病的防治报道较少.鉴此,拟从小麦根际土 壤中分离获得木霉菌株,通过室内平板对峙试验初步 筛选出对小麦全蚀病菌具有显着抑制作用的拮抗木 霉,研究其生物学特性并进行鉴定,为进一步应用木 霉防治小麦全蚀病奠 定理 三点共线定理勾股定理的证明证明勾股定理共线定理面面垂直的性质定理 论基础,并为新型微生物农 药的开发与生产提供新的资源. 1材料和方法 1.1材料 土样采自河南省农业科学院试验地小麦田;小 麦全蚀病菌由河南省农科院植保所麦病组提供,经 鉴定为禾顶囊壳菌小麦变种;其他供试菌株为河南 省农科院植保所生防室分离保存;基础培养基为 PDA培养基. 1.2方法 1.2.1木霉的分离纯化参考方中达_6]及贾振华 等E方法并进行改进,在PDA中加入丙酸钠及硫酸 链霉素,以稀释分离法分离木霉菌.将分离得到的 木霉菌以无菌操作方式用接种环挑取菌丝转接于 PDA培养基中,25?条件下,明暗交替倒置培养 4d,保存于PDA斜面上,并加入灭菌石蜡油进行封 存备用. 1.2.2小麦全蚀病菌拮抗木霉的筛选采用平板 对峙法.在9emPDA平板上对峙接种活化3d的 全蚀病菌及木霉菌饼(d一0.8cm),两者各距培养皿 边缘1cm,25?明暗交替培养,以单独接种病原菌 的平板作为对照,每处理重复3次,培养4d,定时观 察,记录菌落半径及其他,并计算生长速率及平板培 养4d时木霉对病原茵的抑制率. 抑制率一鲢X100. 1.2.3小麦全蚀病菌拮抗木霉抑菌谱测定选择 黄瓜疫病病菌,黄瓜灰霉病菌,辣椒枯萎病菌,棉红腐 病菌,棉花黄萎病菌,苹果腐烂病菌,苹果褐斑病菌, 山药炭疽病菌,西瓜枯萎病菌,小麦赤霉病菌,小麦纹 枯病菌及芝麻枯萎病菌作为供试病原菌,以平板对峙 法测定木霉菌对其他植物病原菌的抑菌能力. 1.2.4小麦全蚀病菌拮抗木霉生物学特性测定 ?80? 1.2.4.1温度与菌丝生长和产孢的关系取相同 菌龄的菌片接种在PDA培养基,分别在10?, 15?,25?,3O?的培养箱中光暗交替培养. 1.2.4.2碳源与菌丝生长及产孢的关系分别用 等量的蔗糖,淀粉,果糖替换PDA培养基中的葡萄 糖,25?,光暗交替培养. 1.2.4.3光照与菌丝生长和产孢的关系将接种 木霉菌株的PDA平板分别放置在光照,黑暗以及 光照/黑暗12h交替条件下的培养箱中,25?培养. 1.2.4.4生长基质酸碱度与菌丝生长和产孢的关 系PDA培养基,用1mol/L的HCl和1mol/L的 NaOH调节pH值为4,11.制平板后接种相同菌 龄的菌饼,25?,光暗培养. 上述试验均在接种36h开始测量菌落直径,每 隔12h继续进行测量,连续测量5次,计算每小时 生长速率(ram/h),作为其生长速度的指标,4d后 用血球计数器测每皿孢子数量. 1.2.5小麦全蚀病菌拮抗木霉鉴定 1.2.5.1形态学分类鉴定采用菌落形态观察及 显微观测法鉴定木霉,并检索文献确定其种类. 1.2.5.2rDNAITS序列分子鉴定拮抗木霉基 因组DNA提取:参考吴发红等_8真菌DNA提取方 法进行提取,用ddH0溶解DNA至500ng/~L. ITS序列的PCR扩增与克隆:用于扩增木霉 ITS序列的上下游引物由上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术服 务有限公司合成,分别为ITS4:5GGAAGTA— AAAGTCGTAACAAGG一3和ITS6:5一TCCTC— CGCTTATTGATATGC一3.以拮抗木霉的基因 组DNA为模板,利用引物ITS4及ITS6进行PCR 扩增.PCR反应体系为25L:10×PCRBuffer2.5 L,模板1L,dNTP(10mmol/Leach)0.5L,弓I 物ITS4(10mmol/L)1L,ITS6(10mmol/L) 1L,DNA聚合酶(5U/uL)0.25L,加入去离子水 至25”L.PCR扩增条件:94?5min;94?1rain, 55?30S,72?1rain,33个循环;72?10rain.PCR 反应产物采用1琼脂糖凝胶电泳进行检测. 600bp大小目的条带采用DNA回收试剂盒(AXY— GEN公司)回收纯化后,与T一载体(Takara PMD一19T)连接,转化感受态细胞,然后在含有 Amp,IPTG,X—Gal的平板上进行蓝白斑筛选,并 进行菌落PCR筛选出重组质粒. ITS全序列测定及系统发育树构建:经验证为 目的片段的阳性克隆送至上海生工生物工程技术有 限公司进行测序.测序结果采用BLAST进行序列 河南农业科学 一 致性比较.同时,下载木霉属其他种及其他属真 菌的模式菌株rDNAITS序列,并运用CLUSTAI X(Version1.8)软件进行对位排列,辅以人工校对, 得到的序列使用MEGA3.1分子进化遗传分析软 件分析.在Kimura2一parameter法计算遗传距离 的基础上,采用邻接法构建NJ系统发生树,系统树 各分支的置信度用自举检验法(bootstrap)检验,共 进行1000次循环_9. 2结果与分析 2.1木霉的分离纯化结果 从小麦田土壤中共分离获得12株木霉,分别编 号为ZBS1一ZBS12.图1为分离纯化得到的部分 木霉菌株.木霉菌株在PDA培养基上生长菌落呈 近圆形,初期为白色绒状,后期呈现绿色至深绿色, 部分木霉呈现同心轮纹状密实的产孢区.生长速度 快,4d左右即可长满全皿并大量产孢. 图1部分木霉菌株菌落形态 2.2小麦全蚀病拮抗木霉的筛选结果 对峙培养统计结果显示,12株木霉菌株对小麦 全蚀病菌在室内均表现出一定的抑制效果,抑菌率 均在30以上,但以ZBS6抑制作用最强.在PDA 培养基上,ZBS6的生长速率最快,日平均生长速率 在26.7mm以上,对峙培养中,其日平均生长速度 也在24.8mm左右,较全蚀病菌具有明显的生长优 势,表现出强烈的竞争效果;同时,对峙培养中的全 蚀病菌菌丝生长速率(5.1mm/d)明显低于单独接 种的病原菌菌丝生长速率(11.4mm/d),表明拮抗 木霉在生长过程中分泌出次生代谢产物等抑制了病 原菌的正常生长.对峙培养3d后,木霉菌株ZBS6 开始寄生病菌菌落,小麦全蚀病菌的生长受到明显 的抑制,至第4天,其抑菌率达到82.5%,寄生率也 达到8O%,此后抑制率一直保持这一水平(图2). 木霉菌株ZBS6在室内对小麦全蚀病菌表现出较强 的拮抗效果,是非常好的生防因子,因此,又对其进 行了抑菌谱测定. 1.对照(小麦全蚀病菌);2.对峙培养 图2木霉菌株ZBS6对小麦全蚀病的抑制效果 2.3拮抗木霉ZBS6抑菌谱测定结果 对果树,蔬菜,大田及中药材作物上的常见病原 菌的平板对峙测定结果表明,木霉菌株ZBS6具有 较为广谱的抑菌效果,表现出竞争,抗生及寄生作 用,测定的抑菌谱如表1所示. 表1ZBS6菌株抑菌谱 ? 病原菌蓁病原菌藁 辣椒枯萎病菌++棉花红腐病菌++ FusaHumoxysporumFusaHummanili如,7, 黄瓜疫病菌+++小麦赤霉病菌++ PhytophthoramelonisFusariumgraminearum 苹果褐斑病菌++芝麻枯萎病菌++ MarssoninacoronariaFusaHumowysporum 西瓜枯萎++苹果腐烂病菌++ FusaHumo~ysporumValsmaliMiyabeetYamada 山药炭疽病菌+小麦纹枯病菌+ ColletotridumgloeosporiodesRhizoctoniacerealis 黄瓜灰霉++棉花黄萎病菌+++ BotrytiscinereaVerticilliumdahliae 注:+++:抑菌率8O以上;++:抑菌率50%,8O%;+:抑菌 率20,50 2.4拮抗木霉ZBS6生物学特性研究 由图3可以看出,温度条件,光照条件,碳源利 用及培养基质pH值对木霉菌株ZBS6的菌落生长 及产孢量均存在明显的影响.ZBS6菌株在5, 32?条件下均能生长,但在一定的温度范围内, ZBS6的菌落生长速率及产孢量是逐渐增加的,其 中,25?条件下,菌落生长速率最高,产孢量最大,分 别达到1.61mm/h和2.9×10个/皿,为ZBS6的 最适生长温度(图3A).碳源利用方面,在选择的4 种碳源中,葡萄糖为最佳碳源,菌落生长速率达到 1.68mm/h,产孢量为3.3×10个/皿,总的碳源利 ?81. 2010年第6期 用情况为葡萄糖>蔗糖>果糖>淀粉(图3B).光 照对ZBS6的生长及产孢能力影响试验结果表明 (图3C),其并不是木霉菌株ZBS6生长的必要条 件,光照与否对于菌落生长并无显着差异,但是在持 续光照的条件下,其产孢量就显着高于光暗及黑暗 条件,达到6×1O.个/皿左右,而在黑暗条件下进行 培养ZBS6,其产孢量仅为0.1×10个/皿,光照有 利于木霉产孢的报道已有很多l1?],本试验的结果 也恰恰证实了前人的观点.木霉菌株ZBS6的生长 : \ E \ 龉 “ . 1l’l+产孢量l t一’ 10152O25:{0 温度/? 光照光暗黑暗 培养条件 2 \ 目 \ 静 刿 0 pH范围是非常广泛的,在pH4.0,11.0均能生 长,且无显着差异,但以偏酸性条件为宜,其中以 pH5.0时生长速度最快,达到1.98mm/h,但是不 同pH条件下,其产孢能力存在明显的差异,pH5.0 时,产孢能力最强,达到3.1×1O.个/皿左右,高于 pH4.0及pH6.0,在pH5.0以后,随着PH的升 高,产孢能力呈减弱趋势(图3D).因此,以葡萄糖 为碳源,基质pH为5.0,25?,光暗交替为木霉菌 株ZBS6的最适培养条件.’ 葡萄糖蔗糖果糖淀粉 cN 45678910l1 PH值 &5 3 皂 <_ H X 一 目倒 翘 目 \ <_ × 一 删 鼎 A.温度对菌丝生长及产孢影响;B.碳源对菌丝生长及产孢影响;C.光 照对菌丝生长及产孢影响;D.基质酸碱度对菌丝生长及产孢影响 图3木霉菌株ZBS6生物学特性 2.5拮抗木霉ZBS6鉴定结果 形态学观察结果表明,分离纯化后的木霉菌株 ZBS6菌落在PDA培养平板上为圆形或近圆形,菌 丝生长初期为白色绒状,后期呈现同心轮纹状的浓 绿产孢区.显微镜下观察,菌丝纤细无色,具分隔, 多分枝;分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出,呈环状排 列,具几次重复分枝,着生分生孢子的小梗瓶形或 锥形;分生孢子多为球形,绿色或蓝绿色,经检索文 献[14,15],初步判断木霉菌株ZBS6为绿色木霉(Tri— chodermaviride). 为进一步确定拮抗木霉ZBS6菌株分类地位, 以该菌株基因组DNA为模板,用ITS序列通用引 物扩增出1条长度为600bp左右的预期片段(图 4A),符合ITS在所有真菌中都高度保守且长度恒 ?82? 定的报道.PCR产物经回收,连接,转化及鉴定 后,提交到上海生工生物工程技术有限公司进行 DNA测序,测得ZBS6的ITS基因全序列,包括 ITS1区,5.8S区及ITS2区,可读序列长度全长为 526bp. 将可读的526bp序列提交GenBank,应用 BLAST同源性搜索,与数据库中各菌株序列进行 相似性分析,与Trichodermavirens的菌株一致性 达100.由菌株,ZBS6及其他模式菌株rDNA ITS序列构建的系统进化树分析可以看出(图4B), 菌株ZBS6的序列与Trichodermaviride聚成一 类,单独构成一个分支,遗传距离最短,树枝可靠性 达到81,结合其生物学特性及形态学特征,鉴定 该菌株为绿色木霉(T.viride). 52一l50 2O 一?\踌瑙 一富\._【×)\删, 765432lO 河南农业科学 3结论与讨论 TrichodermaYire~-AF0990oZl ZBS6.ITS Trich~uJermaharzid}mAY222351i Trichodermacras~mAF414315l TrichodermapolysI~runiAT24084Z, TrichodermakoningiopsisDQ379015.1 FusariumlatetitiumGu0622321 ColletotrichumgloeosporioidesEU822804 VerticilliumdahliaeGU060637, RhizoctomiasolaniGQ8851471 Ph)tophthoramelonisFJ8018541 AB A.ZBS6拮抗木霉ITS—DNA基因PCR扩增图谱;M.DL2000Marker;1,2.ZBS6一ITS; B.ITS—DNA全序列系统发育树 图4ZBS6拮抗木霉ITS—DNA基因PCR扩增图谱及ITS—DNA全序列系统发育树 利用土壤拮抗微生物对小麦全蚀病进行生物防 治国内外已经有较多的研究],但利用木霉防治小 麦全蚀病的研究报道相对较少.本试验从小麦病田 土壤中共分离获得12株木霉,通过离体试验筛选得 到的1株对小麦全蚀病菌具有显着抑制作用的木霉 菌株ZBS6,对峙试验结果显示其作用方式包括竞 争,拮抗及寄生机制,与李梅云等口及朱廷恒等?】] 报道一致,理论上是非常有效的生防真菌.但是,生 防菌防治植物病害对生态环境依赖性非常强,只有 充分了解其生物学特性,防治对象范围及与环境微 生物间关系,才能合理的利用木霉菌防治植物病害 并取得理想效果.本研究结果表明,拮抗木霉ZBS6 对温度,光照,基质pH及碳源利用等方面具有广泛 适应和耐受能力,同时抑菌谱测定结果也表明拮抗 木霉ZBS6对果树,蔬菜,大田及中药材作物上的一 些常见病原菌具有较强的抑菌效果,表现出较强竞 争力,与李作森等?1研究报道的结果一致,这有利 于进一步在田间进行生物防治试验及应用. 木霉属真菌是个庞大的家族,迄今已鉴定的超过 i00种_1,由于每种木霉在生防功能与代谢产物上都 不尽相同,因此,对木霉进行准确鉴定,分类对其在农 业生产中的应用至关重要.目前的真菌分类已经逐 渐形成了传统形态学分类,分子生物学分类组成的技 术体系,被众多的学者采纳_2船].本研究通过对木霉 分生孢子及菌落形态等观察,并参考真菌分类相关资 料,初步判断该拮抗菌株为绿色木霉;同时,分子鉴定 结果也显示该菌株与绿色木霉聚为一类,且同源性达 到100,两者在本研究中显示相同结论,最终鉴定 ZBS6菌株为绿色木霉(viride). 绿色木霉是一种资源丰富的拮抗微生物,在植物 生物防治中具有重要的作用和应用前景.目前,我们 已将拈抗菌株ZBS6提交中国普通微生物菌种保藏管 理中心,正在申请专利.该菌株对于小麦,玉米等作 物上几种病害的田间防治试验及剂型加工方面的研 究也正在进行,一系列研究旨在开发出成功的微生物 农药制剂. 参考文献: [1]孙炳剑,袁虹霞,邢小萍,等.不同种子处理剂对小麦全蚀 病的防治效果I-J].麦类作物,2008,28(4):709—712. 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I-J].NucleicAcidsRes,1997,24:4876— (下转第86页) ? 83? 2010年第6期 时,随机病株的相互交叠使之逐渐表现出均匀化的 趋势. 对于玉米瘤黑粉病不同发病程度下的理论抽样数 而言,病株率越小,为保证调查的精度,需要调查的植 株越多.在一般生产实践中,病株率达到1左右时, 大约需要调查285个样本;病株率达到5左右时,大 约需要调查135个样本;病株率达到1O以上时,大约 需要调查115个样本即可确保调查的可信度. 参考文献 [1] [2] [3] [4] ShurtleffMC.Compendiumofcorndiseases[M].Min— nesota:APSPress,1980. 李春民,徐雅洁,于俊香,等.2000年巴林左旗玉米瘤 黑粉病大发生的原因及防治对策CJ].内蒙古农业科 技,2001(5):42—43. 鄂文弟,王振华,张立国,等.玉米瘤黑粉病的研究进展 [J].玉米科学,2006,14(1):153—157. 董金皋.农业植物病理学(北方本)[M].北京:中国农 (上接第83页) El0]武莹,刘春生,刘玉法,等.5种习用柴胡的ITS序列 鉴别[J].中国中药杂志,2005,30(10):732—734. [11]李梅云,谭丽华,方敦煌,等.哈茨木霉的培养及其对 烟草疫霉生长的抑制研究[J].微生物学通报,2006, 33(6):79—83. E12]纪明山,李博强,许远,等.绿色木霉TR一8菌株的生 物学特性研究EJ].沈阳农业大学,2004,35(3): 195—199. [13]刘连妹,屈海泳,牛潇,等.绿色木霉HT—O1的生物 学特性和抑菌特性[J].西北农业,2008,17(6): 179-183. [14]陆家云.植物病原真菌学EJ].北京:中国农业出版社, 2001:388—389. [15]贺运春.真菌学[J].北京:中国林业出版社,2008: 254. [16]李梅云,李天飞,王革,等.木霉对烟草黑胫病菌的拮 抗机制[33.植物保护,2002,29(4):309—312. E17]朱廷恒,邢小平,孙顺娣.木霉T97菌株对几种植物 病原真菌的拈抗作用机制和温室防治试验EJ].植物 保护,2004,31(2):139—143. ? 86? 业出版社,2001. 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