【doc】用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶

【doc】用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶 用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶 - l? 参考文献 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals1991.24(3) ,1】-',f~CordJMetal:JBiolGhera1969,244:6049 [9]袁勤生等生物化学与生枷物理1987.19:8~ [3]杨苇等:生物化学杂志1989,5:169 [4方允中等:自由基与酶,1989,76页,科学出版社,北 京 【5]袁勤生等本刊1985,16:417 C6】AraiKetal:JImmMeth.出19驰9J?9 [7]谢卫华等:本刊1988,19:e17 [8]鲁子贤:蛋白质稻酶学研究 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,1989,2瓦,科学出 版社,北京 [9】DavisBJ:A.nnatsNewYorkAcadSci1964. lZl:404 C10]Banni~erJVetal:EurJBiochem1971.18: 178 [II】KeeleBBet:JBiolChem1971.Z46:2~75 AFFINITYCHRoMAT0GRAPHYF0R PURIFICAT10N0FCu.Zn-SOD CHENHao,ZHANGBing-Ran,HUANGYing—Huan. JIANGLu,YUANQin—Sheng (D*#arlmenfofBiovhemicaiEnginee,ing,]EastChinal~slituteChemicalTechnology.Shan g~i200237) ABSTRACTBasedon世conventtonalpreparationmethodforSODtheway usingaffinitychromatographytoobtainh螗hpuritySODfromthebovineredcells wa.sdescribed-ThespecificactivityofthepurifiedSODreaches6256U/mg protein,withmolecularweightof31300dalton.isoelectriepointof4.93and maximumUVabsorptionat258?8nin?Theanalysisonaminoacidcomposition indicatesthatbovineSODcontainsnoTrp. KeyWordsaffinitychromatography,purification,superoxidedismutase , charae- teristics [199"2年3月S日收稿】 0.一 用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶 侯建明吴经扬秀琴a Rm3 c河北中医学院生三主.儿;{可北大学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究所.悍定) 摘要以青霉素酰化酶基因工程菌为酶源,选用脱乙酰几丁质为载体,试用了4种固定化方法,从4个方 面(pH温度,盐浓度和结合酶量)摸索了周定化条件.结果在适宜条件下获得比活900U/g(干)(NIPAB 法)的圈定化青霉素酰化酶,回收率可达56%.并测定其酶学性质. 关键词同定化酶重量塞壁当蔓丝三垦二星苄临 6一氨基青霉烷酸(6-APA)是半合成青 霉素的重要原料.为提高6-APA的生产水 平,制备比话高,稳定性好的固定化青霉素酰 化酶(或固定化细胞)是关键技术.本文从高 产青霉素酰化酶的基因工程菌提取青霉索酰 化酶(PA),利用脱乙酰几丁质(cbj)为载体, 进行固定化酶的研究,获得了比活和酶活回 收率高,稳定性较好的固定化酶. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 产酶菌.青霉亲酰化薛基因工程菌Coli198/PPAH 坐星堕蔓些童查!竺!!型!!竺!!竺堡!塑竺J_墨! D1'河北大学生物工程研究所) sepl1ar0s4B和苯乙酰胺(中科院生物物理所赠送) 考马斯亮蓝G一250(Fluka);牛血潸白蛋白(北京红星生化 制品厂),NIPAB(6一硝基_g一莘乙酰胺基苯甲酸(江苏海门 县制药厂);青霉素G钾(华北制药厂);脱乙酰几丁质(核工 业部理化工程研究皖十室) 青霉索酰化酶提取:产酶菌用5OL 发酵罐发酵,5OOr/rain离心收集菌体.用 蔗糖渗透压休克法提取粗提酶,用苯乙酰胺 Sepharose4B疏水层析法制得高纯度的酶 (精制酶). 蛋白质分量洲定:考马斯亮蓝法. 酶活涮定:1.NIPAB法{2.碱滴定 法'. 酶的固定化方法:参照文献进行.用 6为乙酸制成古Chil.3历的胶状液体,注入 2mol/LNaOtt溶液中使其凝同形成颗粒 状,水洗至中性.用此经预处理的Chi按下 法与酶结合. 1.通过戊二醛或甲醛与酶结台:用5 戊二醛(pH8.O)或5为甲醛(pH8.5)在宣 温与经预处理的Chi反应1.5h,以水充分洗 涤后与酶液混和,置摇床振摇l2h,滤出残余 酶液.已与酶结合的Chi用50mmol/LpH 7.5磷酸盐缓冲液充分洗涤直至洗涤液不含 活.分别测定残余酶液和固定化酶的酶活 力,从而计算结台到Chi上的酶活爰其回收 率: 培台酶活:酶液初始总酶话力一残余酶液的酶活力, 酶回收率=』i;{丑. 2.用?一二环已基碳二亚胺(DCCI) 与酶缩合:Chi(湿)0.2g加pH7.8的酶液 2.0ml及DCCI的DMF溶液(I5mg/m1) 68Ol,置摇床于5_Jc振摇17h,充分洗涤后 测酶活. 结果与讨论 一 ,确定固定化方法 我们用4种方法进行优选,结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf l. 表l不同固定化方法的比较 载博简称载蠢等藿殛固定结合酶实铡酶鱼V/g活U/g (干)(干) Chi一甲瞥暑醴活化215.112.960....一 cn一戊鲁焉鸯看醛活化tt4.553.848.8I.———— , 4o9.6175.442.8 ChI-DCl~缔台D与酶直接22L.368.73ta 表1中Chi用量都是0.2g(湿),酶液用 pH7.8的10mmol/L磷酸盐缓冲掖调节 pH,蛋白含量3..57mg/ml,酶活l3.28u, ml.酶用量除DCCI法为2.0ml外其它均 为2.5ml.Chi一甲和Chi-戊一乙一甲都是以载 体上的甲醛与酶蛋白直接结合.结果表明, Chi一甲和Chi-戊一乙一甲的效果与Chi一戊相 比有很大差距,说明甲醛活化不适用于固定 PA,DCCI缩合法结果类似.所以选用戊二 醛活化Chi作为载体. =,固定化条件的确定 以单位酶活及其回收率的提高作为指标 测定了温度,pH,结台酶量以及盐浓度对固 定化效果的影响. I.温度的影响:在3种温度条件下,使 酶与载体结合,发现温度在15~27.C时固定 化效果较好(表2). 表2不同温度时制备固定化酶的结果 [rag/g(W)J[U/g(T)j[U,.:g(T)](N) 用Chi—戊0.2g(湿),pH6.I酶液2.5m】(酶藏蛋白 3.5~mg/ml~酶活13..q8U/roD 2.pH的影响:其它条件相同时和pH 为5.9,6.4或7.8,载体结合蛋白量及酶量 比较接近,但表现出来的酶活却有差别,即回 收率不同.因此pH在6.4以下较为适宜 ?:暑博 蛳眦 "伯俘 嘲唧啪 曲硒2 988盯融 "盯 ?1位一中国医药工业杂志ChineseJOurnalofPharmaz~uticals199S2 (表3). 表8不同p缸时制备固定化奠的结果 0.2g(涅)Chi-鹰,精制酶液3.Bml(酶渍蛋白1.5mg/ m】,酶活n.04U/m1),于盯?反应12h. 3.载体结旮酶量与回收率:固定化酶 的酶活回收率还受载体结合酶量的影响.一 般而言,载体结合酶量少时,回收率较高. 为使载体结合酶量适当,酶的比活高,而回收 率又不致太低,我们做了结台酶量试验(表 4). 袁4每克千固定化酶缝合酶量不 同时,回收率的比较 固定化条{牛I结豢鼻量l ——l—g(王]_J 酶要曼j.t.e1 酶爱壶'1.66. 酶 应 5. 1 o 2 m hl'『306.3 酶禳pH5.9 表4中载体用量,温度及酶液的比活都 与表3相同,但初始酶量和反应时间不同,这 是为了得到结合酶量不同的固定化酶以便比 较其对回收率的影响.可见每克载体结合酶 量为2220U时回收率比结合1956U时要 低,即尽管结合酶量相差近3ooU,而表现出 的酶活却都在860U/g左右.当结合酶量降 低至1593U/g时,酶回收率增加不多,而实 测酶活却降低100U/g.在粗酶液固定化时 也有类似结果.因此用精制酶液(7.4U/mg 蛋白)固定时每克载体结合酶1800~1900U, 用粗酶液(3.7U/mg蛋白)固定时每克载体 结合酶1000~1200U较好.此时固定化酶 的酶活和回收率可分别达到860U/g(千), 45历(精制酶液)和610U/g(于),55%(粗酶 液). 4.NaC1浓度与回收率:考虑列酶回收 率与固定时酶的构象有关,而盐的浓度可影 响蛋白质的盐键和琉水键从而影响蛋白质的 构象,所以考察了盐浓度对固定化的影响.结 果表明NaC1浓度为0.5raol/L时与不加 NaCI时相比,酶活由782提高到908U/g (于),回收率由47.9上升到56.7%.这里 结合蛋白量和酶量都基本一致,说明这个条 件的确有利于固定化过程中酶活的保留.当 NaCI浓度低于或高于0.5mol/L时都达不 到此效果(丧5).盐浓度对固定化酶回收率 的这种影响未见文献报道. 表5NaCI浓度对回收率的影响 固定化时 Ne.C1渡度结台蛋白量结台酶量宴恻酶活 (tool/L)-[?g,干妇[u/g(干)]CU/g(干): 0211.61593.276245 0.1端7.71742.45786.3 0.522B.01598.490635 0.7221.61622.0276932 酶用量:精锚酶3.2ml,pH5.9,27? 三,固定化青霉素酰化酶的酶学性质 测定了Chi固定化均青霉素酰化酶和溶 液态酶的最适pH及pH稳定性;最适温度 和37.C下的热稳定性.pH稳定性实验中的 相对酶活是将酶在不同pH的50mmol/L 磷酸盐缓冲液中于37.c水浴连续保温8h后 测定的;37.C长期热稳定性实验是在水浴中 连续保温113h后测定的. 固定化酶的最适pH由溶液态酶的8.0 降到7—0pH稳定性有明显提高,特别是在 pH7.5以下的较宽pH范围内,固定化酶显 示相当高的稳定性,这有利于用柱式反应器. 固定化酶的最适温度和溶液态酶相比没有大 的变化.长期热稳定性实验表明,在37?,pH 7.O,8.0的条件下固定化酶的稳定性较溶液 态酶有很大提高,在pH7.0时提高幅度最 大.根据计算,pH7.0时固定化酶半衰期为 量,塑, 垦一 , 结一 ? — 空粤墨蔓三些塑查壁垒竺!竺型型!!!竺!!璺苎!望 1120h,而溶液态酶仅270h;pH7.5时,分 别为600h和39050 J=}j青霉素作底物,用碱滴定测酶促反应 的速度,以Hancs—Woolf作图法求出酶的米 氏常数,以Dixon作图法求出苯乙酸抑 制常数K,结果为 溶液态酶=1.97mmol/ K,=7.09retool/L; 固定化酶墨=3.70mmol/L, K,=11.27mmol/L. 四,青霉素酶法裂解为6-APA的初步 实验 青霉索浓度10%,固定化酶与青霉素配 l比为35U:1g,在间歇式反应器中于36, 0T?用NaOH维持pH7.0,7.5,反应3h, 青霉素转化率可达96%以上. 我们由虾壳制备Chi经戊二醛活化后, 惆定PA,方法简便,得到的酶比活和酶回收 率较高.实验表明,在pH64,5.9,温度 ? lO3 15~27.c,结合酶量适当的情况下,固定化酶 比活可分别达860(精制酶液)和610U/g (干)(姐酶液);回收率分别达45和55%左 右.若加入NaC1,用精制酶液制备的固定化 酶更可达906U/g(干),回收率56.7衢.用 Chi制备的固定化青霉素酰化酶最适pH及 最稳定pH都发生酸移,在酶裂青霉素时可 维持pH7.0左右,以减少过程中青霉素的 破坏,也有利于利用柱式反应器,因此用Chi 固定pA有较大的应用潜力. 参考文献 C1]张其夺:生物化学杂志1990,6:327 [2]BradfordMMAnalBiocbem1976.72:248 [3]固相酶作组(上海第三制药厂等):本刊1979p0) 22 [4:DrobnikJ:BiotechBioeng1979,21:1317 [5]MahianPB:ApplBiochemniotechno[19? 9:537 [6]BraumJ:BiotechBioeng1999332船 []SynowieckiJ:ibld1982.24:1871 [s]袁中一:科学通报I~80p14:65l IMM0BILIZATIoNOFPENICIILlN ACYLASEoNCHIT0SAN HOUJ~-Mmg,wuJing-CaiYANGXin-Qin (Depar~mento|Bioch*mislry,HebelCollege.|TraditionalChi~seMedice SM~iazhuang050091;.rnsti~utaBiotechnology.HsbeiUnlversity,Bavding) ABSTRACTChitosanhasbeenusedasthec~rriertoimmobiHzethepenicillin acylase(PA)whichWaSextractedfromE.coli108/pPAHD1constructedbyDNA recombinanttechnique.Threedifferentmethodsand4condkions(pH, tempe. rature,NaCIconcentrationandquantityofPAtobeimmobilized)havebeenc0n. sklered.UnderthesuRableconditions,theactivityofimmobilizedPAWaSas highas900U/g(dry).andtheactivityretentionwasaround56%.Theproperties oftheimmobilizedenzymeweredetermined. S',一14 KeyWordsimmobilizedenzyme 部甲最苯乙醛的筒便箭备法wu珊chn等 penicillinacylase.ehitosan [1992年1月27日收稿] [Synthesis1999:927J 顺?二置一1,2-苛二罅在氮气保护下于室温用 NaIo4术溶液氧化LEh?经后处理即得几乎定量的邻甲酰 苯乙醛(高酞醛),既可避免使用Pb(Oic)iI叉可提高收 率. 【划进前摘张秀平校]