毕赤酵母的培养基1

毕赤酵母的培养 巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样,在无性生长期主要以单倍体形式存在,当环境营养限制时,常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配,融合成双倍体。 比赤酵母表达常用的培养基: 1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养 制作平板加入2%的琼脂粉,121摄氏度20分钟,可于室温保存。用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL(博来霉素,抗菌素) 宿主细胞His- -----------诱变造成的。 MD------------酵母转化筛选培养基(营养缺陷型His-)13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕 赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长,以此筛选出重组子。 MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基,成为基本培养基(minimal medium,MM),有时用符号“[ -]”来表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。 2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5% PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时,加入Zeocin 25ug / ml,可以4℃条件下保存1~2 周. 3 YPD培养基酵母粉1%,胰蛋白胨2%,葡萄糖2%,固体加2%的琼脂粉,YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基,琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml,成为YPDZ 培养基,可以4℃条件下保存1~2 周。 4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%,磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB(酵母氮源)1.34% 生物素(4×10 -5)%甘油1%,毕赤酵母诱导表达前培养基,YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后,一般静置过夜,待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基,改换BMMY培养基,进入诱导表达阶段。 5 BMMY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%,磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB 1.34% 生物素(4×10 -5 )% 甘油1% 甲醇3%, 毕赤酵母诱导表达培养基,YNB和Biotin过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导,一般诱导72小时。 6 YPDS + Zeocin 培养基酵母粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖2%,山梨醇1M, 琼脂2%,博来霉素100mg/ml 不管是液体YPDS 培养基,还是YPDS + Zeocin 培养基,都必须存放4℃条件下,有效 1-2周。 7 MGY培养基34%YNB,1%甘油,4×10 -5 %生物素,将800ml 灭菌水、100ml 的10*YNB 母液、2ml 的500*B 母液和100ml 的10*GY 母液混匀即可,4℃保存,保存期为2 个月。 8 MGYH培养基MGY培养基+0.004%的组氨酸MGYH 在1000ml 的MGY 培养基中加入10ml 的100*H 母液混匀,4℃保存,保存期为2 个月。 9 RD -5 Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基) (含有:1mol/L 的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10 %生物素; 0.005%氨基酸)(1). 将186g 的山梨醇定容至700ml,高压灭菌;(2). 冷却后于45℃水浴;(3). 将100ml 的10*D、100ml 的10*YNB;2ml 的500*B;10ml 的100*AA 等母液和88ml 无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤2 的山梨醇溶液混合。4℃保存。 10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培养基+ 0.004%组氨酸)在RD 培养基配制的第三步中,在加入10ml 的100*H 母液,同时无菌水的体积减少至78ml 即可,其余配制方法与RD 相同。4℃保存。 11 RD 及RDH 平板的制备 1. 将186g 的山梨醇和15~20g 琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴; 2. 参照RD/RDH 液体培养基配制的步骤4,100ml 的10*D、将100ml 的10*YNB;的500*B;2ml 10ml 的100*AA 等母液、(10ml 的100*H 母液)和88(78)ml 无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀;3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。 12 RD 及RDH 的TOP 琼脂的制备(常用于酵母菌的包被)琼脂 的制备(常用于酵母菌的包被)(1).将186g 的山梨醇和7.5~10g 琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;琼脂粉60℃(2).参照RD/RDH 液体培养基配制的步骤4,100ml 的10*D、将100ml 的10*YNB;的500*B;2ml 10ml 的100*AA 等母液、(10ml 的100*H 母液)和88(78)ml 无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1 的山梨醇/琼脂液混匀;(3).将该TOP 琼脂置于45℃水浴冷却、保温,备用。 13 MD 与MDH -5 Minimal Dextrose Medium +(Histidine)最小葡萄糖培养基+(0.004 %组氨酸)(含有:1.34%YNB;;4*10 % 生物素;2%葡萄糖) 1. 100ml 的10*YNB;2ml 的500*B 和100ml10*D 母液,用800ml 的无菌水定容至1000ml 即可;2. 如配制MDH,可在上述的MD 中加入10ml 的100*H 即可;3. 如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15~20g 的琼脂。4℃可保存数月。 14 SOC 培养基:培养基:Trypton Yeast Extract NaCl Glucose (1mol / L) 121℃高压灭菌20min,冷却后,4℃保存。l%0.5% 0.05%2% 母液的配置注:母液的配置注:10*YNB (含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基)4℃保存。34g 酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g 硫酸铵,溶于1000ml 水中,过滤除菌。500*B (0.02%生物素Biotin)4℃保存保存期为 1 年。20mg 的生物素溶于100ml 水中,过滤除菌。100*H (0.4%Histidine 组氨酸)4℃保存保存期为 1 年。400mg 的L- 组氨酸溶于100ml 水中,(加热至50℃以促进溶解),过滤除菌。10*D (20%Dextrose 葡萄糖)保存期为1 年。200g 葡萄糖溶于1000ml 水中,灭菌15min 或过滤除菌。10*M 过滤除菌。(5%Methanol 甲醇)保存期为 2 个月。将5ml 的甲醇与95ml 水混匀,10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期为 1 年以上。将100ml 甘油和900ml 水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。100*AA 过滤除菌。(0.5% of each Amino Acid,各种氨基酸)4℃保存保存期为1 年。分别将500mg 的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml 水中,1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0),将1mol/L 的K2HPO4 溶液132ml 与1mol/L 的KH2PO4 溶液868ml 混匀,其pH 为6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。 10*YNB:34g 酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g 硫酸铵,溶于1000ml 水中,过滤除菌。 500*B (0.02%生物素Biotin)4℃保存保存期为1 年。20mg 的生物素溶于100ml 水中,过滤除菌。 100*H (0.4%Histidine 组氨酸)4℃保存保存期为1 年。400mg 的L-组氨酸溶于100ml 水中,(加热至50℃以促进溶解),过滤除菌。 10*D (20%Dextrose 葡萄糖)保存期为1 年。200g 葡萄糖溶于1000ml 水中,灭菌15min 或过滤除菌。 10*M (5%Methanol 甲醇)保存期为2 个月。将5ml 的甲醇与 95ml 水混匀,过滤除菌。 10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期为1 年以上。将100ml 甘油和900ml 水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。 100*AA 过滤除菌。(0.5% of each Amino Acid,各种氨基酸)4℃保存保存期为1 年。分别将500mg 的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml 水中过滤除菌。 1M磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0),将1mol/L 的K2HPO4 溶液132ml 与1mol/L 的KH2PO4 溶液868ml 混匀,其pH 为 6.0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。毕赤酵母表达常用载体:典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1 和3'AOX1),它们被多克隆位点(MCS)分开,外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1 区。当整合型载体转化受体时,它的5'AOX1 和3'AOX1 能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上,外源基因在5'AOX1 启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白,而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89 个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α 交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有:pPIC9,pPIC9K,pHIL-S1,pPICZα A,pYAM75P 等。胞内表达载体主要有:pHIL-D2 ,pA0815 ,pPIC3K ,pPICZ , pHWO10 ,pGAPZ ,pGAPZa(Invitrogen),pPIC3.5K 等。工 程菌株Y11430,MG1003,GS115 (AOX1)KM71,,SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115 和KM71 两种,都具有HIS4 营养缺陷标记。其中,GS115 茵株具有AOX1 基因,是Mut+,即表型为Muts,甲醇利用正常型;KM71 菌株的AOX1 位点彼ARG4 基因插入,而即甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式:与自主复制的质粒型表达载体不同,整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性,筛选可能的多拷贝插入;而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种:一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中,而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法:酵母系统表达的蛋白一般都具有活性,所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白,分泌型表达的蛋白有利于纯化,可用硫酸铵沉淀,然后用离子交换,凝胶过滤层析,疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 2.毕赤酵母利用的优缺点 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记 等。表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌复制扩增,然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外,表达载体还需带有信号肽序列。甲醇营养型毕赤酵母优点: (1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之一; (2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化;(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养; (4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合; (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。甲醇营养型毕赤酵不足之处: