舌黏膜上皮bax，bcl-2基因表达与舌苔厚薄关系的研究

舌黏膜上皮bax，bcl-2基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达与舌苔厚薄关系的研究 舌黏膜上皮bax，bcl-2基因表达与舌苔厚薄 关系的研究 ? 176?中国中医药科技2O05年5月第12卷第3期M.2O05Vo1.12No.3 ? 专题报道? 舌黏膜上皮bax,be]一2基因表达与舌苔 厚薄关系的研究* 贾海霞?屈伸 (深圳市干部保健办专家门诊部?深圳518020华中科技大学同济医学院?武汉430000) 摘要目的:探讨舌黏膜更新代谢与细胞凋亡,bax/bcl一2mRNA和蛋白质表达的关系.方法:运用 ~NEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的d—U1P缺口末端标记)技术,原位杂交,免疫组化和图像分析技术. 结果:与薄苔比较,厚苔bax基因低表达伴随细胞凋亡减少;bax基因表达水平变化趋势与细胞凋亡水平变 化趋势一致.在各组舌苔中均未检测到bcl一2基因表达.结论:bax基因表达水平的变化可能是影响舌 苔上皮细胞凋亡并导致舌苔厚度变化的重要原因之一. 主题词一舌苔细胞凋亡基因表达舌诊客观化人类 随着生物科学的发展,对舌黏膜更新代谢机理的研究已 深入到亚细胞水平【1.2】,但在基因水平的研究尚属罕见.近 年来,随着对细胞凋亡研究的深入,发现正常表皮细胞依靠 生长,分化,凋亡处于相对平衡的状态而维持生理功能【3】3. 而舌苔变化是否与舌苔上皮细胞凋亡程度有关,以及不同类 型舌苔其凋亡相关基因表达变化规律的研究目前国内外尚 未见报道.为此,本课题运用TUNEL技术(terminal deoxynucleotidyltra~el'aae—mediatedd—U1Pnick—endk止IeliIlg u~chnique,末端脱氧核苷酸转移酶介导的d—UrP缺口末端标 记技术)检测舌苔上皮细胞凋亡情况,运用原位核酸分子杂 交,免疫组织化学技术对凋亡相关基因bax,bel一2在正常及 常见病理舌苔上皮细胞中的mP,NA转录水平及蛋白产物进 行测定,以期从基因分子水平阐明常见舌苔的形成机理及影 响因素., 1材料与方法 1.1标本来源病理舌苔受检者均系深圳市第二人民医院 门诊及住院病人,病种不限,但注意各组病种分布的均衡;正 常组选择无全身各系统器质性病变,并排除近月内舌,口, 鼻,咽等局部病变,舌质淡红,舌苔薄白而润者.参考《中医 诊断学》舌诊 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 辨舌苔,分为4组:?正常薄白苔组12例. 其中男6例,女6例,平均年龄43.5岁;?病理薄苔组30例, 男l4例,女l6例,平均年龄48.17岁;?厚苔组30例,男l7 例,女13例,平均年龄47.87岁.经统计学分析,各组性别, 年龄分布无显着性差异. 每个观察对象用经高温高压消毒的丝瓜络用力刮取舌 背中部(花剥苔者取无舌苔覆盖部位)舌苔,装于有预冷生理 盐水(含0.1%DEPC)的10ml具塞离心管中,洗涤,涂片后一 70?密闭保存备用. 1.2主要试剂TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,bax,be]一2原 *国家自然科学基金资助项目No.39770890 ?华中科技大学同济医学院在职博士研究生 位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司,抗Bax多克隆抗 体,抗Bd一2单克隆抗体均为美国Onc~rle公司产品,第二 抗体Envision+购自美国DAKO公司,DEPC(--乙基焦碳酸 酯)购自华美生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司,其余试剂均为国产分析纯试剂. 1.3方法 1.3.1TUNEL法所有标本涂片用4%多聚甲醛固定 15rain,PBS洗涤3min×2次,ddH20洗涤3min×2次;3%H202 浸泡30m/n,ddH20洗涤5min×3次;涂片加标记缓冲液湿润 后,加标记液37?标记2h,TBS洗涤5min×3次;加封闭液封 闭30rain;加生物素化抗地高辛抗体,37?孵育30min,TBS洗 涤5min×3次;加SABC,37oC孵育601n/n,TBS洗涤5min×4 次;DAB显色.阳性反应为细胞核中有棕黄色颗粒,阴性对 照(以标记缓冲液代替标记液)细胞核中无棕黄色颗粒. 1.3.2原位杂交方法所有标本涂片用4%多聚甲醛固定 15rain,ddH20充分洗涤;0.5%H202/q~醇溶液浸泡30m/n, ddH20洗涤5rain×3次;胃蛋白酶37?消化3min,PBS洗涤 5min×3次,ddH20洗涤1次;40?预杂交4h;40~C杂交17h;用 37?水温的2×SSC洗涤5min×2次,0.5×SSC洗涤15rain×1 次;0.2×SSC洗涤15rain×2次;再进行地高辛一过氧化物酶 显色反应.阳性杂交信号为棕黄色,阴性对照(用预杂交液 代替杂交液)为无色. 1.3.3免疫组化方法采用I.DP法.所有标本涂片以冷丙 酮固定15rain,ddH20充分洗涤;0.5%H202/甲醇溶液浸泡 30mln,PBS洗涤5min×3次;加TGF一岛多抗后,4?孵育17h, PBS洗涤5min×3次,加Envision37?孵育40mln,PBS洗涤 5min×3次;DAB显色.阳性反应信号为棕黄色,阴性对照 (以PBS代替一抗)为无色. 1.3.4图像半定量分析和统计处理采用CMIAS真彩色病 理图像分析系统(空军总医院生物医学工程研究所研制),在 光镜下(×4o0)每张涂片随机选取5个视野,对TUNEL法结 果以平均每100个细胞中含凋亡细胞数作为凋亡指数(); 中国中医药科技2OO5年5月第l2卷第3期May.2OO5Va1.12No.3?177? 对b旺原位杂交和免疫组化涂片,测定每张涂片的阳性细胞 率(%)和阳性单位(PU值).数据均数?标准差(?s)表 示.结果中所有百分数的比较都先经过平方根反正弦变换( 血I1)后采用方差分析,q检验(Newman—Keuls法).PU 值的比较则直接进行方差分析,q检验. 2结果 2.I11JNEL法结果见表I.与正常薄苔比较,厚苔AI降 低(P<0.0I5).此外,薄苔与厚苔问AI存在显着差异(均为 P<0.o5). 表l不同厚度舌苔上皮细胞凋亡指数的比较(二?s) 2.2b旺原位杂交结果见表2.与正常薄苔比较,厚苔b旺 阳性细胞率存在显着差异(P<O.05),此外,薄苔与厚苔之间 阳性细胞率差异均有显着性意义(P<O.0I5).阳性单位(PU 值)各组间差异无显着性意义. 表2舌苔上皮细胞bet原位杂交图像分析结果(二?s) 不同颜色(黄,白)舌苔间b旺 在薄苔或厚苔组内部, mP,NA阳性细胞率和阳性单位值差异均无显着性. 2.3b旺免疫组化结果见表3.与正常薄苔比较,剥苔b旺 蛋白阳性细胞率升高,而厚苔b旺蛋白阳性细胞率降低(均 为P<0.o5).此外,薄苔与厚苔,正常苔之间阳性细胞率差 异均有显着性意义(P<0.0I5),而厚苔与剥苔差异具有非常 显着性(P<O.01).各组间PU值差异无显着性. 表3舌苔上皮细胞bet免疫组化图像分析结果(二?s) 在薄苔或厚苔组内部,不同颜色(黄,白)舌苔间b旺蛋 白阳性细胞率和阳性单位值差异无统计学意义. 2.4Bcl一2原位杂交和免疫组化检测结果在各组舌苔中 均未检测到be1—2基因表达. 3讨论 细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式. 它参与机体许多的生理,病理过程.在正常表皮中,上皮角 质形成细胞通过调节其增殖,分化,凋亡的过程来维持表皮 结构的动态平衡….对于同属于复层扁平上皮的舌粘膜上 皮,本课题用11JNEL技术证实了舌上皮细胞的增殖,分化的 同时,有一部分细胞发生了细胞凋亡.舌苔的厚度与舌上皮 细胞的增殖,分化及凋亡之间的平衡密切相关.当舌上皮细 胞增殖与分化,凋亡处于相对平衡状态时,舌苔表现为薄苔. 而当细胞增殖占优势,细胞凋亡和分化相对占劣势时,舌上 皮细胞增多,舌苔即变厚;反之则出现剥苔.而我们临床上 常见到痰湿患者,其特征性的体征之一是舌苔厚腻.根据中 医辨证给予化湿药后一两天左右厚腻苔开始消退.化湿药 物及其他多类中药是如何影响舌苔消长的,其中是否涉及到 凋亡调控机制改变,都值得研究. 上皮细胞凋亡的调控涉及到许多基因的表达,其中be1 — 许多 2(B—celllymphoma/leuk~A一2)是原癌基因的一种,实验证据表明bcl一2可抑制多种因子激发的细胞凋亡【5J, 延长细胞寿命,但并不能刺激细胞增殖.b旺也是be1—2基 因家族成员之一,但其生物学作用是拮抗be1—2.b旺与be1 — 2各自可形成同源二聚体,也可相互作用为异二聚体【6】6,两 者之间的比例决定了细胞的命运.当细胞中Bax蛋白高表 达时形成同源二聚体,可促进细胞凋亡;而当Bcl一2蛋白高 表达时则形成Bcl一2/Bax异二聚体,抑制细胞凋亡【7J.本 课题首次从mP,NA和蛋白质两个水平探讨了b旺基因在舌苔 上皮细胞凋亡中的变化规律.我们发现,与正常薄苔比较, 厚苔b旺基因低表达伴随细胞凋亡减少.b旺基因表达水平 变化趋势与细胞凋亡水平变化趋势一致.结果提示,b旺基 因表达水平的变化可能是影响舌苔上皮细胞凋亡并导致舌 苔厚度变化的重要原因之一.在各组舌苔中均未检测到抑 凋基因be1—2的表达.可能是因为be1—2主要表达于基底 层【8J,而本研究为了保持中医诊断的无创性特色,在舌苔取 材时考虑到要使用患者易于接受的无创方式,故刮取到的基 底层细胞很少.因此,be1—2在不同舌苔中的表达规律有待 于以后做进一步的研究. 参考文献 I吴正治着.舌苔原理研究.第1版.广州:中山大学出版社.1996;9 2吴正治,郭振球,李新华.等.七种常见舌苔的细胞化学计量诊所 研究.北京中医药大学1996;19(3):57 3Ge~mnBR,FutmllJW.MandersEl(.^p呷t0ei8endplasticsmBe~y.Plast l~xxmstrsIlIg200~;111(4):1481 4TakehashiH,AokiN,NekanmnzS,eta1.Comifiedcellenvelopeformation isdistinctfrom,0Iin甜印瑚lk.氍mq懈.JD置咖0IS~~2000; 23(3):161 5a蛐唱JH,KwonOS,F_anHC,eta1.^Iinthepam叼 cutaneouslupusdytk舶.AmJD簋m岫叩ll01.1996Jm;2o(3): 233 6姜泊主编.细胞凋亡基础与临床.第l版.北京:人民军医出版社. 1999;19;273 7OltvaiZN,Mill/manCL.?n目sI.bcl一2heterodhnedmsinvivo withaconservedhemolo~y,bet,thatac~esates0粤celldl. Cell1993;74;609 8BalmaB,ddM.^pindiffermtalImanifestat/om l瑚ayt}lem毗0匝m.BrJD目咖0I2001;144(5):958