3_脱氢莽草酸生物合成的代谢工程

3_脱氢莽草酸生物合成的代谢工程 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27(12):109,113 32脱氢莽草酸生物合成的代谢工程 毛赟赟 1,2 张部昌 梁 龙 213 (1军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071 2安徽大学生命科学学院 合肥 230039) 摘要 32脱氢莽草酸,是芳香族氨基酸生物合成代谢途径中一种重要的中间产物,可作为一些化学合成制剂和药物中间原料。这样以无毒可再生物质为起始原料的合成 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 与传统的有机合成化学制剂的方法相比,对环境更加有利。此外,它还是一种十分有效的抗氧化剂。工业上一般采用化学合成法和发酵法来生产32脱氢莽草酸,随着代谢工程的兴起,使得 1 更加理性改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。主要介绍了代谢工程在生物合成3氢莽草酸生产菌改造中的应用情况,其中涉及32脱、中心代谢途径的改造和32脱氢莽草酸合成支路的修饰等,关键词 32脱氢莽草酸 代谢工程 中图分类号 Q819 32脱氢莽草酸DHS)分子式为C7H8O5,14,为芳香族氨基酸生物合成途径的中间产物,是一种重要的可再生资源,其进一步加工可以合成原儿茶酸(protocatechuicacid)、香草醛 (vanillin)、儿茶酚(catechol)、没食子酸(gallicacid)及 [1] 已二酸(adipicacid)等重要的化学制剂,解决了以往 但真正有商业价值的高产DHS工程菌种还未见报道。 1 DHS的生物合成 1.1 生物合成途径 DHS是莽草酸途径的中间代谢产物,莽草酸途径广泛存在于植物、微生物中,但在哺乳动物中未曾发现。在大肠杆菌中,莽草酸途径生物合成DHS见图1:葡萄糖经糖酵解和磷酸戊糖途径分别产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖242磷酸(E4P),PEP和E4P缩合形成32脱氧2D2阿拉伯庚酮糖272磷酸(DAHP);然后 DAHP在32脱氢奎尼酸合成酶催化作用下生成32脱氢 以有毒的苯和甲苯等为原料合成这些化学制剂对人体和环 2 境造成的危害问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,是一种环保的生物催化合成方法 [2] 。Li等 [3] 通过减少儿茶酚对其生物合成过程的 [4] 影响,使E.coli突变体以葡萄糖为底物合成儿茶酚,总产率达到43%。Banwell等 还实现了由DHS转变成 唾液酸(sialicacid)KDN。此外,DHS还是一种十分有效的抗氧化剂,其活性甚至优于没食子酸(gallicacid)、丙基没食子酸(propylgallate)、TBHQ butylhydroquinone) (tert2 奎尼酸(DHQ);最后DHQ在32脱氢奎尼酸脱水酶作用下形成DHS。 1.2 DHS生物合成涉及的酶及其编码基因 [7] 、丁羟甲苯(butylated [1] 在大肠杆菌中DHS的生物合成途径共涉及3种酶:32脱氧2D2阿拉伯庚酮糖272磷酸(DAHP)合成酶、32脱氢奎尼酸 3 合成酶、32脱氢奎尼酸脱水酶。DAHP合成酶由aroF、aroG和aroH分别编码的3个DAHP合成酶同工酶组成,且它们分别受到代谢终产物芳香族氨基酸的反馈抑制。aroB编码32脱氢奎尼酸合成酶,负责将DAHP转化为DHQ。32脱氢奎尼酸脱水酶则由aroD基因编码,催化DHQ脱水形成DHS。 hydroxytoluene,BHT)、生育酚(α2tocopherol)等一些商 品化的抗氧化剂 [5] ,具有重要的商业价值。Li等实 现了大肠杆菌突变体以葡萄糖为碳源分批发酵生产 DHS,它在大肠杆菌突变体中具有很高的回收率,在以62碳糖为碳源时理论收率为43%,以52碳糖为碳源时 其理论收率可达71% [6] ,这将具有更广阔的商业前景。 收稿日期:2007208204 修回日期:2007210217 3通讯作者,电子信箱:ll@bioinf.bmi.ac.cn 110 中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.27No.12 2007 把中心代谢流有效地导向DAHP的合成是DHS生物合成产量高低的决定因素,可以利用代谢工程技术,改变中心代谢 4 碳流方向,使之进入莽草酸途径,以DAHP的积累量来鉴定碳流进入DHS的水平高低。 2.1.2 代谢流的改变 莽草酸途径第一个限速反应 的底物之一PEP是多酶竞争底物,除DAHP合成酶可以把PEP和E4P转化为DAHP进入莽草酸途径外, PEP羧化酶(Ppc)可以将PEP转化为草酰乙酸,进入 图1 大肠杆菌莽草酸代谢途径及DHS的去路 PEP:磷酸烯醇式丙酮酸;E4P:赤藓糖242磷酸;DAHP:32脱 三羧酸循环;丙酮酸激酶(pyruvatekinase)可以把PEP转化为丙酮酸;同时,依赖糖2磷酸基转移系统 (PTS)[10]的葡萄糖的吸收,需PEP提供磷酸基。为了 氧2D2阿拉伯庚酮糖272磷酸;DHQ:32脱氢奎尼酸;DHS:32脱氢莽草酸;S3P:莽草酸232磷酸;PCA:原儿茶酸;AroF,AroG, AroH:32脱氧2D2阿拉伯庚酮糖272磷酸合成酶;AroB:32脱氢奎 使代谢流流向莽草酸途径的方向,往往采取以下策略: (1)使用非PTS碳源,非PTS、阿拉伯糖等 尼酸合成酶;AroD:32脱氢奎尼酸脱水酶;AroE:莽草酸脱氢酶;AroK:莽草酸激酶?;AroL:莽草酸激酶?;AroZ:32脱氢 莽草酸脱水酶;AroY:原儿茶酸脱羧酶 5 戊糖。Li等 fbr [11] DAHP合酶 ()L4.79B分别以葡萄 Fig.1 TheshikimicacidpathwayinEscherichiacoli andtheoutletpathwayofD、,木糖或阿拉伯糖为碳源DHS。过量 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf AroF的E.coliKL3/pKL4.124A以3 fbr 2 DHS 胞的代谢网络进行修饰,对细胞分解和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计,然后利用DNA重组技术强化和(或)灭活控制代谢途径的相关基因 [8] 种糖的混合物(葡萄糖?木糖?阿拉伯糖=3?2?2)为碳源与以任意一种糖作碳源时相比,合成DHS的量最高。 (2)克隆表达PEP合成酶(PpsA)和转酮醇酶 (TktA)基因 大多数旨在增加E4P供应量的工作都 。 围绕超量生产TktA进行,Li等 [1] 在DHS生产菌中克 DHS生物合成的代谢工程研究主要涉及两个代谢途径的 6 调控,其一是中心代谢途径,它为DHS生物合成提供原料;其二是DHS生物合成支路。 2.1 中心代谢途径的调控 2.1.1 中心途径和分支酸途径的代谢流分析 大肠 隆表达tktA基因增加E4P供应,使DHS产量达到0.3 mol(每mol葡萄糖)。同时增量表达TktA,PEP合成 酶,DAHP合酶时,过量表达的PEP合成酶能利用ATP水解释放的能量把丙酮酸再转变为PEP,使DAHP产量提高了近1倍,几乎达到其最大理论产量86%(mol/ mo1) [12] 杆菌代谢途径分析表明:葡萄糖经糖酵解和磷酸戊糖途径分别产生PEP和E4P,二者在DAHP合成酶的作用下合成DAHP,为中心代谢途径。这是控制中间产物的代谢流量、形成速率及产率的关键步骤。为高效生产目的产品,须对中心代谢途径的相关步骤进行调节控制。莽草酸途径的前体PEP和E4P均来自中心代谢途径 [6] 。Kim等 [13] 同时表达tktA和aroF基因,使E. fbr 7 coli的DAHP分泌量增加了40倍。 (3)使丙酮酸激酶失活 丙酮酸激酶由pykA和 pykF两个基因编码,研究发现去除任何一个pyk基因 都未能对DAHP产量产生大的影响,但将两个基因去除可使DAHP产量增加3倍 [14] ,同时在该菌株超量表 [15] 。糖酵解途径产生PEP,E4P则经磷酸戊糖 达TktA,DAHP产量可增加4.5倍。在E.coli中串 途径,由tktA基因编码的转酮醇酶催化而得。通过对 E.coli中心代谢途径的计量分析显示,当该菌生长在以 联表达ppsA和pckA基因,使PEP合成酶和PEP激酶活性分别提高到宿主菌的3.1和2.3倍,DAHP产量可提高2.1倍 Yi等 [17] [16] 葡萄糖作为唯一碳源的限制性培养基上时,大约有 30%的葡萄糖262磷酸(G6P)会进入磷酸戊糖途径,但 。但Pps高效表达也会对细胞造成生长 抑制、糖耗过大和向胞外分泌醋酸盐等一些副作用。 鉴定了Pps最佳表达水平,产生的DHS的量 8 为51%,但Pps最佳表达量高于其最高表达量,所以要 仅有3%的PEP用于莽草酸途径 [9] 。在E.coli莽草酸 途径中,DAHP是第一个限制性底物(图1),因此能否 2007,27(12) 增量表达这种酶。Berry等 [18] 毛赟赟等:32脱氢莽草酸生物合成的代谢工程 111 采取扩增E.coli中aroG生物宿主菌,但是,位于一个多拷贝质粒上的基因有可能导致酶表达水平超过改善一个限速酶特性所需。这种代谢负担常常反映在生长率减慢、合成产物的产率和转化率较低;同时质粒的稳定性也值得特别关注。因此,由共同途径上限速酶引起的从葡萄糖到芳香族终产物碳代谢流的阻碍作用可用改构微生物染色体的策略进行纠正,使碳流顺利通过芳香族共同途径,从而促进生物催化葡萄糖转化芳香族化合物 Li等 [1] [26] 和tktA基因,并使两个丙酮酸激酶同工酶(pykA和 pykF)失活,可明显增加DAHP产量,进一步提高DHS 9 产量。 (4)培育非PTS菌株 [6] Yi等 [19] 在用DHS产量 反映不同葡萄糖转化系统对PEP供应的影响时发现 E.coli依赖自身的PTS转运葡萄糖时,48h合成49g/LDHS,但异源表达Zymomonasmobilisglf基因编码的葡 。 萄糖易化子和glk编码的葡萄糖激酶的E.coli,其PTS失活,以易化扩散方式来转运葡萄糖可在48h合成 60g/LDHS [20] 在利用缺乏莽草酸脱氢酶(AroE)的微生 物突变体进行生物合成DHS的研究中发现,染色体上增加一个aroB基因拷贝数,使其编码的DHQ合成酶活性提高2倍,可使增加的底物DAHP全部转化成 DHQ而避免堆积中间产物DAHP。同时过量表达tktA ,减少了对PEP的消耗,使DHS产量得 到提高。 (5)使用丙酮酸为酶作用底物 PTS和DAHP合酶对底物 10 PEP的竞争限制了通过莽草酸途径合成产物的产量,Ran等 [21] 基因和aroF的DHS,产率30% () 27] fbr 构建了莽草酸途径突变体,使丙酮酸。[28] 代替PEP,在62磷酸222酮232脱氧半乳糖酸(KDPGal)醛羧酶(dgoA基因编码)同工酶的作用下直接与作用合成DAHP,率从43%增加到86% 此外,E.coilA因子(carbonstorageorA,CsrA)可抑制葡萄糖异生、糖原生物合成和分解,而激活糖酵解和乙酸代谢等 [22,23] AaroCaroBkan,使整体调控基20倍的,使细胞内PEP的量增加。把莽草酸途径关键酶的基因盒替换到E.coil的基因组染色体内,使莽草酸途径得到最优化,并减少了细胞的代谢负担。这样采用稳定性高的染色体定向整合入途径限速酶基因来提高酶活性的方法,可以避免高拷贝质粒和蛋白过高表达所产生的代谢负担的副作用,更加适合研制生物工程菌的策略。我们已从Zymomonasmobilis基因组中克隆出编码葡萄糖激酶的glk基因,并在E.coli BL21中成功实现了表达,准备利用Red重组系统敲除 11 。敲除csrA基因可增强糖异生和糖原合成酶的 活性而降低糖酵解酶的活性,从而增加胞内PEP流量,为莽草酸途径提供大量的前体物。这是通过细菌基因组,从整体水平上实现对芳香族氨基酸中心代谢途径的调控 [24] 。但中心代谢途径的改变往往会对细胞产生其基因组中的aroE基因,同时插入glk基因,以为下一步进行产DHS发酵奠定基础。 较大压力严重影响细胞生长和代谢流,需进一步优化。 2.2 DHS生物合成支路的研究 2.2.1 在生产菌中克隆表达途径限速酶 脱氢奎尼 3 展 望 传统菌株的改良主要是通过突变、筛选和遗传重组来获得,随着分子生物学、生物信息学等学科的不断发展,代谢工程的研究手段将更加丰富和理性,不仅为人们提供了改造优良工程菌的条件和手段,同时也开拓了人们的思路和视野。代谢工程在芳香化合物的生物合成研究中的成功应用,也实现了利用廉价易得的碳源为底物的微生物发酵法合成DHS。在以后的工作中,既要筛选优良的生产菌,为进一步的菌株改良提供材料;又要加强DHS生物合成的分子生物学研究,以指导DHS高产菌种的基因工程和代谢工程改良,同时还要应用发酵工程技术,建立高效的菌株发酵和产品纯化回收工艺,以获 12 得更加经济的工业生产技术。 酸合成酶(aroB基因编码)是莽草酸代谢途径的第二个限速酶,为合成大量的DHS,需使莽草酸代谢途径得到加强,其中的限速酶需要大量表达,从而使代谢途径中的碳源向DHS合成方向进行。同时将编码莽草酸脱氢酶的aroE基因敲除,阻断DHS形成莽草酸,而尽可能多地合成DHS。杨毅刚等 [25] 成功表达了E.coil莽 草酸代谢途径中的关键酶AroB,构建的E.coilBL21/ pETDuet2aroB重组菌酶活力为178U/L,是未转入重 组质粒E.coilBL21酶活力的35.6倍,从而使代谢系统的碳源更多流向DHS合成方向。 2.2.2 重新设计染色体结构 过去的研究策略主要 依靠染色体外的质粒携带编码途径限速酶基因转化微 112 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology [14]BerryA. Vol.27No.122007 Improvingproductionofaromaticcompoundsin TrendsBioteohnol, 参考文献 [1]LiK,MikolaMR,DrathsKM,etalFed2batchfermentor 13 synthesisof 32dehydroshikimic acid using recombinant Escherichiacolibymetabolicenginering. 1996,14:250,256 [15]CossetG,Yong2XiaoJ,BerryA.Adirectcomparisonof approachesforincreasingcarbonflowtoaromaticbiosynthesisin Escherichiacoli. Escherichiacoli.BiotechnolBioeng,1999,64(1):61,73 [2]DrathsKM,KambourakisS,LiK,etal32Dehydroshikimic Acid:ABuildingBlockforChemicalSynthesisfromRenewableFeedstocksIn:Bozell,JJ.Ed.ChemicalsandMaterialsfromRenewableResources,ACSSymposiumSeries784.AmericanChemicalSociety:WashingtonDC,2001,Chapter11,133 IndMicrobiol,1996.17:47,52 [16]吴永庆,江培,范长胜,等.大肠杆菌ppsA,pckA基因的克 隆与串联表达.复旦大学学报,2002,41(1):31,35 WuYQ,JiangP,FanCHSH,etal.JournalofFudanUniversity,2002,41(1):31,35 14 [3]LiWS,XieDM,FrostJW.Benzene2freesynthesisof catechol:interfacingmicrobialandchemicalcatalysis.JAmChemSoc,2005,127(9):2874,2882 [17]YiJ,LiK,DrathsKM,etal.Modulationof phosphoenolpyruvatesynthaseexpressionincreasesshikimatepathwayproductyieldsinE.coli.BiotechnolProg,2002,18,1141,1148 [4]BanwellMG,HungerfordNL,JolliffeKA.Synthesisofthe sialicacid (2)2KDN andcertainepimersfrom (2)232 [18]BerryA,DodgeTC,M,etal.Applicationof metabolictimboththeproductionanduseofbi., Iiotechnol,2002,28(3): dehydroshikimicacidor(2)2quinicacid.OrgLett,2004,6(16):2737,2740 [5]ChangYC,AlmyEA,BlamerGA,etal.Antioxidantof32dehydroshikimicacidinliposomes,andoil.AgricFoodChem,(:]rathsKM,LiK,etal.Alteredglucosetransportand shikimatepathwayproductyieldsinE.coli.BiotechnolProg,2003,19,1450,1459 15 [6]BongaertsJ,üal.engineering formicrobialpraromaticaminoacidsandderivedcompounds.MetabEng,2001,3:289,300 [20]GossetG.ImprovementofEscherichiacoliproductionstrains of the phosphoenolpyruvate: sugar bymodification phosphotransferasesystem.MicrobialCellFactories,2005,4:14 [7]KramerM,BongaertsJ,BovenbergR,etal.Metabolic engineeringformicrobialproductionofshikimicacid.MetabolicEngineering,2003,5:277,283 [21]RanN,DrathsKM,FrostJW.Creationofashikimate pathwayvariant.JAmChemSoc,2004,126(22),6856,6857 [8]StephanopoulesG.Metabolicfluxesandmetabolicengineering. 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Inadditipotentantioxidant.Chemical synthesisandfermentivemethodistheDHS,andmicrobialrati 19 onalmodificationbasedonthedevelopmentthefermentivemethodmorewidelyused.Metabolicengineeringiniicroorganismsisreviewed,involvingtheregulationofgenesandenzymesinbipathwayofDHS,reconstructiononcentralmetabolismandmodificationinDHSbiosynthesisbranch,moreover,theprospectofDHSproductionisalsomentioned. Keywords 32Dehydroshikimicacid(DHS) Metabolicengineering Biosynthesis 作者更正 本刊2007年27卷第11期66页代文亮等的“响应面法在紫 杉醇产生菌发酵前体优化中的应用”一文,通讯作者电子信箱 应为:wytao1946@163.com。 特此更正。 20