[doc] 一种简便快速的羊水细胞原位培养和染色体制备方法

[doc] 一种简便快速的羊水细胞原位培养和染色体制备方法 一种简便快速的羊水细胞原位培养和染色 体制备方法 ? 50?中国优生与遗传杂志2OO2年第1O卷第3期 一 种简便快速的羊水细胞原位培养和染色体制备方法 黄莉,.曾.郝.马绍武.乃东红.谢丹尼.孙燕萍.张海英 (1.广西区生殖健康中心,530(121;2.中国协和医科大学基础医学研究院,中国医学科学院基础医学研究所) 摘要:羊水细胞培养一直是一项难度很大的技术,本中心在参考国内外先进技术的基础上,建立了一种快速简便的羊水细 胞原位培养和染色体制备方法,在加例产前诊断中,除1例母血污染过重无法培养外,其余均获得成功,成功率达95%.该方法成 功率高,操作简便,培养时间短,细胞损耗小,染色体形态质量好,利于分析,缩短出 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 时问,对异常胎儿能及早终止妊娠.可进一 步推广. 关键词:羊水细胞;原位培养;染色体 羊水细胞培养作为一种胎儿产前诊断的有着不可替代的 作用,其经典方法长期以来,由于其培养周期长,分裂相少, 形态差,不稳定,细胞损耗大诸多难点,给大部分实验室实际 应用带来很多困难,因此建立一种稳定,快速,操作简便的羊 水细胞培养方法对优生优育有着重要的意义. 资料与方法 1.标本来源:来我中心进行胎儿产前诊断染色体的孕16w , 20w孕妇抽取的羊水20例. 2.标本采集:在B超引导下用9号穿刺针经腹抽取羊水 2Ora1分别置于2个l(~nl无菌试管中,待检. 3.培养器皿:C02培养箱,一次用无菌25Il1l方形培养瓶, 无菌吸管,低速离心机,倒置显微镜或体式显微镜. 4.试剂:羊水培养基自配,其主要成分为:FIO,胎牛血 清,促生长因子.固定液:甲醇:乙酸=3:1秋水仙素:终浓 嚏24ng/ml低渗液:0.8%柠檬酸三钠.胰酶:终浓度0.025% Giemsa染液 5.方法:接种:将羊水离心去上清液,每管加入0.25ml 培养液混匀,分别加入2个培养瓶中,但不能铺满瓶底,而是 接种于瓶底中央lem,2era范围内.然后将其置于c培养箱 培养,24h后再向每个培养瓶加入1,Oral培养液,继续培养72h 后每天观察,若观察到梭形细胞克隆则更换培养液,于24h后 收细胞. 6.羊水细胞染色体制片: 在每个培养瓶加入秋水仙胺后置(培养箱继续培养1h , 2h,去培养液,加入2M低渗液,继续培养0.5h,lh左右, 在相差显微镜下观察,若梭形细胞变成圆形时加入0.5ml已预 冷一加的固定液,预固定3rrfin后,去掉培养瓶中的液体, 沿着培养瓶边沿缓慢加入5O%3:1固定液2M,3min加入纯固 定液3min弃液.反复三次后,加入3:1固定液固定5min弃液, 反复二次.放入37?温箱中过夜.待检.(整个收获过程均在 体视镜或倒置镜下观察,37C恒温台上操作) 分带之前,用尖嘴钳将培养瓶上层撬开,使之成为敞开 的皿以便分带染色. 7显带 在0.025%胰酶溶液中消化2rain,3min后.放入10:1的 Ciemsa染色lOn~n,自来水冲洗,自然干燥后镜检. 8.原位杂交 制好的玻片也可以用于原位杂交. 结果 1.20例标本中,除1例被母血污染过重无法培养外,其 余19例均获得成功.成功率为95%. 2.19例标本中出现克隆细胞群的时间,分裂相数,有效 分裂相数见下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf . 表19例标本中观察结果 讨论 1.成功率高,操作简便.我们研究建立的这个方法,成 功率达95%,在操作上较酶消化法简便的多,细胞丢失减少 到最小程度,在整个操作过程中不需离心,减少操作步骤.另 外,在培养基中添加有生长因子,营养成分更加合理,促进羊 水细胞的贴壁生长. 2.培养时间短,节省试剂.在成功的19例中,培养时间 最短5天,最长9天即可收获,较其它原始羊水细胞培养方法 培养时间短.在接种时,接种面积小,培养基用量少,细胞数 量在相对面积中较密集,从而产生细胞群体效应,加快细胞贴 壁生长和增加细胞克隆群,这样既节省培养基,又缩短培养时 间.同时由于培养箱的湿度一直保持在95%以上,培养基不 会因温度而挥发,减少培养基的用量,培养基铺开的厚度减 薄,使悬浮细胞更贴近瓶壁,增加羊水细胞贴壁数量. 3.该方法另—个特点是从低渗到固定对不同的个体采用 不同的时间,低渗需看到细胞变圆膨大后才加固定液,在固定 过程中其浓度是逐渐增大,以增加染色体分裂相数目和染色体 分散程度. (下转第64页) 中国优生与遗传杂志2OO2年第1O卷第3期 ;翼静和触赫动的效果.5.穿刺针锋利程度直接关系到穿刺 功率目此,脐带越细,漂浮度大的情况下,最好选择新的 刈的, 困外之献报道0.J,脐血穿刺可能出现的并发症中,1.9% , ,)O柏黔死官内.0.6%的宫内感染.9.0%的早产.国内有 泉道,31.O%的胎盘渗血,43.2%的脐带渗血(>15秒), 盱勺胎儿心动过缓本资料显示胎盘渗血为12-3%,脐带渗 血为16.3%(>30秒),胎儿心动过缓为5.9%,未出现胎死宫 内,早产和官内感染等其它并发症.心动过缓引起的原因可能 是因穿刺引起脐血管痉挛或者抽侪血导致胎儿急性血容量下 昕放.处理1.立即辱止穿刺.2.孕妇吸氧左侧卧位.3.静 倍高渗枷和VitL:脐带渗血由于侪血管壁收缩及胎儿凝血机 毒4参与怍片j,渗血能自行停止.胎盘渗血亦可自行停止.对于 峨盘渗血u寸问特别长者,笔者曾采取腹部穿刺点处用手掌适 当加压约30s左右,增加宫内压力,达到止血的目的,效果不 错 总之,B超引导下游离脐静脉穿刺术是一种成功率高,安 全可靠的方法. 参考文献 [1]Dg~o8F,PadovsksMc,ForesfierF.AnewprocedureforfldH】bkrA?? 龇in:唧tB脚一three?.AmJ()Gv— nd?l.1953.146:985 [2]何超,叶怀英,胡引珍,等.经腹脐静脉穿刺术及临床应用. 中华妇产科杂志,1988,23:218 [3]IHel(G,YildizA,Kdank~yaA,eta1.i?0feon~)- centesisinhi曲一riskI?eg:eff~s(11f1cHswe~’mdeliveW. 10130 Pm1atDiagn,1995,15(11):995— 【4jn]nnerC,RyF,P,qquetV,ela1.sforrapidk咖: 421c?9e口”c8s?.FetalDiagn1her,1995,10(3):192,9 [5]陈建生,方群,游泽山,等.B超监测下游离脐带穿刺术200 例分析.广西医学,1997,19(4):684,685 收稿日期:2001—09一 上接第65页) 的反应可通过它与Hb的关系反应出来,即Hb越低,EPO水 则越高,所以贫血和缺氧一样可刺激肾脏产生更多的EPO. 至于妊娠早期为什么EP0对贫血反应较迟钝_3J,这主要是由 妊娠早期为适应妊娠促进了肾的氧感受器供氧,因此EP(=l 的辞放减少,在这个时期,肾血流量及2,3一二磷酸甘油酸增 多,增加了肾的供氧量.但在妊娠晚期由于扩大了胎盘及皮肤 盼血循环,相对肾血流减少.另有认为胎盘生乳素(HPL)可 增愠LYK)的活性驯,还有研究认为胎盘可产生?o-.所以, 随稽孕周增加,胎盘逐渐成熟,产生的|?增加,血清EPO 也升高..产后胎盘娩出,I[J在产后7h即测不到.故产 矗H水平较好娠晚期低 参考文献 i(ArrccriN,l8GA,lilzzichiniM,ela1.Rd~im. p商nandvinfinn【ImBland口妇cpIw0|帕I[J].(d OdInve~t,1995,39(2):13,g7 [2c毗iN,Pa6~hioMR,Etd试taGA.In虹悯l8iron吐旧s pregnancyanemiawithhi【曲levels[Jj.Ot~ster蛳i, 1997.940:650,653 [3]BenY,LipescenG,mnH,da1.Bluntederythrt~iefinpm- dllc~(1landdecremeda_y【hln]p茁sinyp1日r-cy[J].Blood,1991, 78(1):89,93 [4jGldt~CH,schdlKH,G0lS,ela1.F(mtiner~sesery. t}l『.pinc(fl傀n0r坷1gtocolys;s[J].BrJClin升m?,1998, 45(2):157, [5]C【_lKP,l~myoDF,w瞄】8en—LarsenA,da1.Fzcpr~ion erythrt~e6nbythehln锄plao即诅[J.FAsEBJ,1996,10(5):76 , 766 收稿日期:2{101—12—31 一 ;接第50页) 4,(()2培养筑的作用,在培养接种前,预先将培养基放 l:培养箱平衡2小时,使培养基的pH值平衡达到羊水细 所需的pH值,由于不加Hepas减少培养基在G02箱中因时 而产的毒素;减少对细胞的损伤,在接种后,放入c02培 衔足半开放式培养,可保持pH值的稳定.另外在培养接种 的前五灭,我们不移动和不观察培养的细胞以保持培养细 ?:l对的静止平稳,使细胞贴壁更牢固. 5.在整个收获过程中,均在37~C恒温台上操作,但固定 .:足持在冰点以下,这样在固定过程中,可以起到冰片过火 的作用,以增加染色体分散程度. 6.在加例中,有2例均为血性羊水,母血污染较重,其 中l例培养失败,另l例在培养第五天时,我们试着用培养基 冲洗,将母血细胞洗掉,并同时换上新鲜培养液继续培养,后 在第8天出现克隆细胞,第9天收获细胞,这说明母血污染的 羊水通过合适的处理还是可以成功的,但要注意避免污染. 总之,该方法解决了羊水细胞培养时间长,操作复杂, 丢失细胞多,成功率低等诸多问题,而且还可以用于细胞分子 学分析,作原位杂交.是一种简便,快速,成功率高的一种新 的羊水细胞染色体制备方法.易于向基层推广. 收稿日期:2OOl一07—19