小白鼠卵母细胞体外成熟培养环境优化筛选

小白鼠卵母细胞体外成熟培养环境优化筛选 哺乳动物体外受精研究已有一百余年的历史。早在1878年,澳大利亚科学家Schek就用兔进行过实验。1935年，Pincus和Enzmin首次观察到离开卵泡的兔卵母细胞可在没有促性腺激素的培养条件下自动恢复和完成减数分裂[1]。自从他们发现有腔卵泡中的卵母细胞在体外培养可以自发成熟这一事实以来，人们在卵母细胞体外成熟方面做了大量的工作，已成功地使多种哺乳动物的卵母细胞在体外成熟、受精以及受精卵在体外继续发育[2]。1959年张明觉成功使兔卵母细胞体外受精并产仔，获得世界首例的“试管动物”------试管兔。1965年，Edwards通过研究小鼠、绵羊、牛、猪、猕猴和人的卵母细胞体外成熟，发现卵母细胞离开卵泡环境后的自发核成熟是哺乳动物的普遍现象。1968年，Wittingham[3]获得体外受精“试管小鼠”，1982年，Epping[4]等对小鼠腔前卵泡进行了体外成熟和体外受精研究，并成功产仔。国内，陈秀兰等[5]于1986年成功获得“试管小鼠”。关于人的卵母细胞体外受精的研究，Echwards等在1969年就有过报道。通过几十年的不懈努力，卵母细胞的成熟系统已日趋完善，先后有30多种哺乳动物的体外受精后代诞生[6]。 在体外受精技术不断发展的过程中，卵母细胞的体外成熟始终被研究者所关注，卵母细胞在体外成熟的好坏直接会影响受精以及早期胚胎的发育。因此,国内外学者对卵母细胞的体外成熟培养系统进行了大量而卓有成效的研究。总之，卵母细胞体外成熟培养系统的建立是按照仿生学的思路，如模拟卵巢液的成分和卵巢环境而逐步完善起来的，使体外培养环境与母体体内相似，使体外培养的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞相同。 最初使用的卵母细胞成熟培养基础液有Tyrode、Gey、Earle、Hanks等盐类缓冲液，近年来多应用合成培养液如M199、Ham′s F10和Ham′s F12，而以M199应用最广泛。大量研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，以TCM199为卵母细胞体外成熟的基础培养液，对牛、绵羊和猪的卵母细胞进行体外成熟培养，成熟率可达80%以上。在基础培养液中添加其它成分可提高卵母细胞的体外成熟率。不同研究者目前常添加成分也不同。一般都加HCG、PMSG 、FSH、LH、E2等。促性腺激素能诱发卵丘细胞扩展、增加达到MⅡ期的成熟率，并有促进卵裂的作用；FSH可以抑制颗粒细胞凋亡,维持颗粒细胞的成活力,进而维持颗粒细胞和卵母细胞间的联系；能够刺激卵丘细胞扩散,而扩散的卵丘细胞能够分泌一种粘性的透明质酸,它有助于提高精子的活力。FSH、EGF可以促进牛腔前卵泡颗粒细胞的增生和卵泡存活,并使卵泡具备类固醇激素合成能力。添加雌激素对卵母细胞体外成熟的影响，尚存在分歧。多数学者认为雌二醇对卵母细胞完全成熟是有帮助的，雌二醇是促进胞质成熟的重要成分,它能促进卵母细胞成熟分裂的复始,又能显著提高卵母细胞的受精能力及早期胚胎的发育能力。可显著提高受精后胚胎的发育率。但在添加发情牛血清、发情山羊血清时，雌二醇对卵母细胞体外成熟和胚胎发育并不重要。以添加发情牛血清取代促性腺激素和雌激素，同样可使牛卵母细胞成熟率达90%以上，因而主张无激素培养法,并也得到了较好的实验结果。所得结论差异的原因可能是由于成熟培养液中添加了未知大分子物质和激素,从而掩盖、抑制或改变了E2的作用。许多研究证明在牛的卵母细胞成熟培养液中添加LH(理想浓度50ug/ml)可使卵丘细胞利用葡萄糖生产丙酮酸的活性增加，促进三羧酸循环产生更多的ATP，进而提高卵子的成熟度和受精后的发育潜力。Chian指出,在不含促性腺激素的成熟培养液中进行成熟培养,卵丘细胞的有无对卵母细胞后来的激活率无明显影响；但如果在成熟培养液中加入促卵泡素(FSH),则卵丘细胞的存在显著抑制了卵母细胞激活能力的获得[7]。这证明了卵丘细胞的作用受激素的调控[8]。 然而，更多的研究者都在成熟液中添加血清白蛋白。血清白蛋白是血清中的大分子物质，具有很强的结合胆固醇和锌离子的能力，可除去精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，降低胆固醇在精子质膜中的比例，进而改变精子质膜的稳定性，导致精子的获能。此外，BSA还可使获能精子迅速穿透卵子，对受精具有促进作用。研究表明，BSA与丙酮酸钠和乳酸钠同时应用可使鼠卵受精率高达83-95%[9]。血清白蛋白中应用最广泛的是牛血清白蛋白（BSA），由于BSA的作用时间较长，且诱发精子获能的能力不强，故常作为辅助成分，但它对于卵母细胞前期的培养也有一些影响，也有人通过添加牛血清白蛋白(BSA)来提高卵母细胞体外成熟、受精和早期胚胎发育率。所以BSA广泛地应用在的许多动物的体外细胞培养、体外获能和体外受精中。另外，成熟培养液中也经常添加血清。血清是一种含有多种已知和未知生物活性成分的极为复杂的混合物，在卵母细胞体外成熟与受精中起着多方面的重要作用。在培养体系中添加血清能强烈地改变细胞功能,使颗粒膜和膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制失去效果,同时也能为卵母细胞成熟提供所需蛋白质,能为卵丘—卵母细胞复合体（Cumulus—Oocyte Complex，COC）提供所需氮源，补充基础培养液中没有或不足的营养以及必需的生长调节因子，从而促进卵丘细胞层扩散和卵母细胞发育成熟。还能中和毒性物质保护细胞不受伤害；对培养液的PH 有缓冲作用[10]。卵母细胞成熟培养所用血清一般为牛血清，常用的血清有胎牛血清（FCS）、发情牛血清（OCS）和阉公牛血清（SS）。Younis（1989）和Schellander（1990）研究证明OCS比FCS效果好,添加浓度10%为宜。目前，牛、羊卵母细胞成熟培养大都在M199+10%ECS＋FSH＋LH+E2中培养，24-26h后成熟率可达80-90%。 卵母细胞成熟是涉及核、质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的一个复杂生物学过程,在形态上表现为纺锤体形成、核仁致密化、染色质高度浓缩形成染色体；第一极体释放；细胞器重组；卵丘颗粒细胞扩展、膨胀、液化和透明带软化等。近年来研究者借助光镜和电镜逐渐揭示出这一生理生化过程的形态结构变化,由于仅有核成熟和卵丘细胞成熟能在光镜下进行判定,而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体的具有生理学意义的评价[11]。因而现在用于体外受精的主要是卵丘细胞扩散的、并排出第一极体的卵母细胞。 因此，动物卵母细胞在体外进行成熟培养要受到多种因素的影响。诸如动物种类异同、卵母细胞不同类型、获取卵母细胞的卵泡大小、成熟培养时间、培养温度、培养液、生长因子、激素等。即使卵母细胞在相同的培养体系中培养,其成熟率也会存在差异。为了优化小鼠卵巢卵母细胞体外成熟培养液，提高卵母细胞体外培养的成熟率；也为了建立哺乳动物胚胎体外生产技术体系，本试验以小鼠卵巢卵母细胞为研究对象就其培养液对卵母细胞体外成熟的影响进行了研究，以探索昆明小白鼠卵母细胞成熟发育的条件，优化选择培养液。 1　实验材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1　实验动物 昆明小白鼠，雌性，体重20～30ɡ，来自天津医科大学实验中心。分群饲养，自由采食专用颗粒饲料，自由饮水。 1.1.2　实验用的主要仪器 CO2培养箱：型号2306，美国SHELLAB产品； 超净工作台：型号AIR TECH, 苏宁集团安泰公司制造； 实体显微镜：型号BO61，日本OLYMPUS制造； 倒置显微镜：型号IX-71，日本OLYMPUS制造； 电子天平：型号AW-220，日本岛津产品。 1.1.3　实验用的主要试剂 M199 ：GIBICO公司产品，批号：20030522； 石蜡油：SIGMA公司产品；批号：20020612； FSH：杭州日月动物药品有限公司产品，批号：20040112； HCG：杭州日月动物药品有限公司产品，批号：20050226； FCS：宁波市激素制造有限公司产品，批号：20050226； 丙酮酸钠：SIGMA公司产品，批号：20010301； 牛血清白蛋白：SIGMA公司产品，北京拜尔迪生物公司分装，批号：20030312； 链霉素：河北远征药业股份有限公司生产，批号：20051001； 青霉素：河北远征药业股份有限公司生产，批号：20040616。 1.1.4　基础液 1.1.4.1　基础液I: M199 +NaHCO3 (0.22g/100ml)+青、链霉素（各1万IU/100ml）。 1.1.4.2　基础液II: 改良的杜氏磷酸缓冲液（mDPBS），见表1。 表 1 改良的杜氏磷酸缓冲液（mDPBS）配方   成分 分子量 分子式 含量（mmol） 称量（g/100ml）   NaCl 58.44 NaCl 136.89 0.8   KCl 74.55 KCl 2.68 0.02   Na2HPO4 358.14 Na2HPO4·12H2O 8.09 0.290 A液 H2PO4 136.09 KH2PO4 1.47 0.020   葡萄糖 180.16 C6H12O6 5.56 0.100   丙酮酸钠 110.05 C3H3O3Na 0.33 0.036(g/L)   青霉素（IU/ml）       100   链霉素（mg/ml）       50   BSA       3000 B液 CaCl2 110.99 CaCl2 0.90 0.010 C液 MgCl2 203.31 MgCl2·6H2O 0.49 0.010             1.1.4.3　基础液III，TYH液，见表2。. 表 2 TYH液配方   成分 分子量 分子式 含量（mmol） 称量（g/100ml）   NaCl 58.44 NaCl 119.37 0.699   KCl 74.55 KCl 4.78 0.036   KH2PO4 136.09 KH2PO4 1.19 0.016 A液 NaHCO3 84.01 NaHCO3 25.07 0.211   葡萄糖 198.17 C6H12O6·H2O 5.56 0.110   丙酮酸钠 110.05 C3H3O3Na 1.00 0.011   青霉素（IU/ ml）     100     链霉素（mg/ml）     50     BSA     4 0.4 B液 MgSO4 246.47 MgSO4·7H2O 1.19 0.029 C液 CaCl2 128.99 CaCl2·7H2O 0.12 0.015             1.1.5　冲卵液：基础液+5%FCS 1.1.6　培养液：基础液 + FSH(1IU/ml) + HCG(2IU/ml)，在基础II液，还加丙酮酸钠（0.11g/L）、丙酮酸钠（0.11g/L）和FCS (10%)或丙酮酸钠（0.11g/L）+BSA 1.2 实验方法 1.2.1 小鼠的处死及其卵母细胞的获取 颈椎脱臼处死小鼠，取出卵巢，放入盛有冲卵液的大凹玻皿中，用异物针和1mL注射器在实体显微镜下刺破卵泡，尽可能使卵母细胞充分溢出。 1.2.2　检卵 用异物针在实体显微镜下把卵母细胞拨在一起，并把卵母细胞分级（A级：四周有四层致密的卵丘细胞包裹；B级：有部分的卵丘细胞；C级：裸卵），然后用自制的玻璃吸管把不同的卵母细胞吸入相应的冲卵液，洗涤2~4遍。 1.2.3　培养 在实体显微镜下，把卵母细胞移入盛有500μL培养液中，上面覆盖石蜡油400μL，然后倒罩一个小凹玻皿，置于37℃、5%CO2、饱和湿度CO2培养箱中培养。 1.2.3 观察 2h观察一次卵母细胞的发育情况（以生发泡破裂及第一极体排出为标准）。一般2~3h后出现生发泡破裂(GVBD)，8~9h开始排出第一极体(PBI)。 2 实验结果 2.1　成熟培养液对小鼠卵母细胞成熟发育的影响 实验选择mDPBS 、M199 或TYH +FSH(1IU/ml) + HCG(2IU/ml)作为卵母细胞成熟的培养液，就其对小鼠C级卵母细胞的成熟发育的影响进行了研究。实验结果表明，培养在mDPBS中的C级卵母细胞无论是生发泡破裂的比例（GVBD %）还是第一极体排出的比例（PBI%）都明显高于培养在M199、TYH中的〔P＜0.05〕，详见表3。 表 3　不同的培养液中C级小鼠卵的体外成熟发育情况 培养液 GVBD／% PBI／% mDPBS 19.8（16/81） 12.3(10/81) M199 13.3(12/90) 8.9(8/90) TYH 12.3(10/81) 7.4(6/81)       2.2　培养液添加成分对小鼠卵母细胞成熟发育的影响 从表4可以看出，在培养基础液中加入添加物后，小鼠卵母细胞的成熟发育效果明显见好（表4）。单纯添加丙酮酸钠一种成分后，无论 GVBD %还是 PBI% 都有明显提高（P＜0.05）；当添加丙酮酸钠BSA或丙酮酸钠和FCS时，GVBD %和 PBI%都有更大的提高，特别在丙酮酸钠和FCS时，GVBD %和 PBI%分别达到100%和86.2%，取得良好的效果（P＜0.01）。 表 4　培养液添加成分对小鼠C级卵体外成熟发育的影响 培养液 GVBD／% PBI／% mDPBS 19.8(16/81) 12.3(10/81) mDPBS+丙酮酸钠 42.9(36/84) 23.8(20/84) mDPBS+丙酮酸钠+BSA 63.2(48/78) 53.8(42/78) mDPBS+丙酮酸钠+FCS 100（153/153） 86.2(132/153)       2.3　不同类型卵母细胞在mDPBS培养液中的发育能力 实验也对A、B、C级卵母细胞在体外成熟培养中的发育能力进行了比较研究。成熟培养液为mDPBS+丙酮酸钠+FCS时，A、B、C级卵母细胞的GVBD %分别为88.5%、76.5%和100%，PBI%分别为65.6%、36.0%和86.3%，C级卵母细胞明显优于A、B级卵母细胞（P<0.05）。 表 5　不同级别卵母细胞在mDPBS培养液中的发育能力 卵母细胞分类 GVBD% PBI% A 88.5(28/32) 65.6(21/32) B 76.5(38/50) 36.0(18/50) C 100(153/153) 86.3(132/153)       3　讨 论 3.1　培养液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 小鼠卵母细胞成熟受诸多因素的影响，如动物个体差异、卵巢生理状况及外界环境条件等，其中培养液是影响小鼠卵母细胞体外成熟的一个重要因素。在本实验过程中我们发现与M199、TYH比较，mDPBS液对小鼠裸卵的成熟培养效果较好。目前，多数资料报道用M199、TYH来培养小鼠卵母细胞，从本实验结果来看，mDPBS作为培养液则具有更好的成熟培养效果。当然，表1中三种培养液的成熟率都很低，这可能是因为培养液中缺乏某种物质如丙酮酸钠和生长因子等所致。 3.2　培养液添加成分对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 丙酮酸钠作为一种胚胎早期发育的主要能量代谢底物，它对卵母细胞的成熟起到举足轻重的作用，我们在实验中发现添加丙酮酸钠能显著促进卵母细胞的成熟发育，从表4 看，添加丙酮酸钠后卵母细胞的成熟率由12.3%提高到23.8%。而用mDPBS+丙酮酸钠+BSA或mDPBS+丙酮酸钠+FCS组成的培养液来培养卵母细胞，它的成熟效果又高于mDPBS+丙酮酸钠组成的培养液，这表明BSA和FCS对卵母细胞的成熟又有促进作用。许多研究者在卵母细胞成熟培养液中添加BSA和FCS来提高卵母细胞的体外成熟率，据认为BSA和FCS对卵母细胞的早期发育有益处，尤其添加FCS后，其效果不仅明显优于不添加蛋白组，而且明显优于添加BSA。与本试验结果相似，李朝军等在进行体外受精研究时发现，在含血清的培养液中成熟卵母细胞的，其体外受精率要高于在含BSA的培养液中成熟的卵母细胞[12]。与BSA相比，血清除含有BSA外，还含有许多对细胞生长发育有益的物质如生长因子、激素、维生素、抗氧化物等。 3.3　卵子类型对卵母细胞成熟发育的影响 Eppig等报道，裸卵的GVBD和PBI的发生率要高于A、B级卵的GVBD和PBI的发生率。与Eppig等的报道相似，本实验裸卵的GVBD发生率（100.0%）也明显高于复合卵母细胞（A级86.5%，B级76.0%），PBI的排出率也明显较高（C级86.2%，A、B级分别为65.6%和36.0%）。而且与大多数研究相似，发现裸卵的GVBD 和排出PBI的时间较早。研究表明卵母细胞周围的颗粒细胞能分泌卵母细胞成熟抑制因子（OMI）,抑制卵母细胞的自发成熟[13]。在培养操作过程中，由于机械性作用致使颗粒细胞脱落，从而解除了对卵母细胞成熟的抑制，使卵母细胞的成熟机制启动[14]，从而大大的提高了裸卵的成熟率。而在A、B级卵中，由于卵丘细胞较多，卵母细胞与周围的卵丘细胞和颗粒细胞的联系紧密，培养操作时不能使颗粒细胞脱落，颗粒细胞分泌的卵母细胞成熟抑制因子的作用不能解除，所以A、B级卵母细胞在体外成熟培养过程中成熟的少，成熟的速度慢。 参考文献 [1] Vanderhyden BC,ArmstrongDT.Role of cumlus cells and serum on the in vitro maturation,fertilization andsubsequent of rat oocytes[J].Biol Rep rod,1989,40(2): 720 -728. 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