手霉素对人卵巢癌3AO细胞增殖和凋亡的影响

肿瘤 2010年8月第 30卷第 8期 Tumor Vo1．30，No．8，August，2010 ·651· DOI：10．378t／j．issn．1000-7431．2010．08．003 手霉素对人卵巢癌 3AO细胞增殖和凋亡的影响 Basic R~ arch·基础研究 张正茂 ，顾来梅 ，刘 洁 ，张 超 ，张风华 ，康 山 ，单保恩 ，王士杰 (河北医科大学第四医院 1．妇产科 ；2．科研中心 ，石家庄 050011；3．河北省人民医院外科，石家庄 050026) [摘要] 目的：探讨手霉素对人卵巢癌3AO细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方 法：MTr法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 手霉素对 3AO细胞的增殖抑制作用；Giemsa染色、透射电子显微镜下观察及FCM 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 手霉素对3AO细胞的凋亡诱导作用；FCM检测手 霉素对 3AO细胞 ras、survivin和核因子一KB(nuclear factor—kappa B，NF—KB)(p65)蛋 白表达的影响。结果 ：手霉素能显著抑制 3AO细胞 的增殖(P<0．05)，并且这种抑制作用随着手霉素浓度的增加和作用时间的延长而增强。Giemsa染色和透射电子显 微镜下观察发现，手霉素可诱导3AO细胞出现典型的凋亡形态学变化及超微结构改变。FCM分析结果显示，与对照组相比， 手霉素诱导3AO细胞凋亡率明显增加(P<0．05)，细胞周期中的G ／M期细胞也明显增加(P<0．05)；3AO细胞的 ras、NF．KB (p65)和 survivin蛋白的表达水平明显下降(P<0．05)。 结论 ：手霉素可明显抑制人卵巢癌 3AO细胞的增殖并诱导其凋亡， 其作用机制可能与下调细胞 ras、NF—KB(p65)和 survivin蛋白的表达有关。 [关键词] 卵巢肿瘤；基因表达；细胞凋亡；手霉素；细胞，3AO [中图分类号] R737．31 [文献标志码] A [文章编号] 1000-7431(2010)08-0651-05 Effects of manumycin on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer 3AO cells ZHANG Zheng．mao ，GU Lai．mei ，LIU Jie ，ZHANG Chao ，ZHANG Feng—hua ，KANG Shan ，SHAN Bao．en ，WANG Shi— jie (1．Department of Obstetrics and Gynecology；2．Research Center，Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 05001 1，China；3．Department of Surgery，Hebei Province People’s Hospital，Shijiazhuang 050026，China) [ABSTRACT] Objective：To study the effects of manumycin on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer 3AO cells，and elucidate the possible mechanisms．M ethods：MTF colorimetric method was performed to evaluate the cytotoxic effects of manumycin on 3AO cells．The apoptosis of 3AO cells was observed by Giemsa staining，transmission electron microscopy，and flow cytometry tech— niques．Expressions of ras，survivin and nuclear factor—kappa B(NF—KB)(p65)proteins of 3AO cells induced by manumycin were ana— lyzed by flow cytometry．Results：Manumycin significantly inhibited the proliferation of 3AO cells in a dose—and time—dependent way(P< 0．05)．The typical apoptotic morphological and super—microstructural changes were observed by light microscopy and transmission electron microscopy after manumycin treatment． Compared with control group，the apoptosis rate and the percentage of 3AO cells in G2／M phase were significantly increased in manumycin treatment group(P<0．05)．Expressions of ras，NF—KB (p65)and survivin protein in 3AO cells treated with manumycin were down·regulated．Conclusion：Manumycin inhibits the proliferation of human ovarian cancer 3AO cells and induced the apoptosis．The mechanism may be associated with down—regulation of the expression of ras，NF—KB (p65)，and survivin protein． [KEY WORDS] Ovarian neoplasms；Gene expression；Apoptosis；Manumycin；Cell，3AO [Tumor，2010，30(8)：651-655] 卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其死亡 率居妇科恶性肿瘤之首。近年来，以铂类为基础的 化疗药物虽然在一定程度上提高了患者的生存率， 但效果仍不理想。因此，积极寻找和探索有效的化 疗药物势在必行。手霉素(manumycin)及其相关化 合物是从链丝菌培养液中发现的抗菌药物 ¨。手 霉素是法尼基转移酶(farnesyltransferase，FTase)特 异性抑制剂，可与法尼基焦磷酸酯 (famesylpyro— phosphate，FPP)竞争性结合 FTase，其毒性低且特 [基金项目] 河北省教育厅普通高校强势特色学科资助项目 [编号：冀教高(2005)52号] Co~espondence to：WANG Shi-jie(王士杰) E-mail：zzm701 105@ hotmail．com 异性强。有研究表明，手霉素具有抑癌作用，其作用 机制可能是影响ras蛋白的法尼基修饰 。Ras、核 因子．KB(nuclear factor—kappa B，NF—KB)(p65)和 survivin蛋白均与卵巢癌的发生、发展密切相关，在 诱导卵巢癌细胞凋亡中分别发挥着不同的作用 。 本研究探讨手霉素对卵巢癌细胞增殖和细胞凋亡的 影响，初步分析其作用机制。 1 材料与方法 1．1 材料 人卵巢黏液性囊腺癌细胞株 3AO由河 北医科大学第四医院科研中心提供；手霉素由华北 制药集团分离、提取并提供；鼠抗人 survivin、NF-KB (p65)和 c-K-ras单克隆抗体以及羊抗 鼠 FITC—IgG 肿瘤 2010年 8月，第3O卷 均购 自 Sigma公司。 1．2 方法 1．2．1 细胞培养 3AO细胞用含 10％胎牛血清的 RPMI 1640培养液，置于37 、CO2体积分数为5％ 的培养箱中培养，以0．25％胰蛋白酶消化细胞并传 代，取对数生长期细胞用于实验 1．2．2 M ITr法检测手霉素对3AO细胞生长的影响 取对数生长期3AO细胞，调整细胞密度为 1×10 个 细胞／mL，接种于96孔培养板中，100 L／孔。实验 组分别加入终浓度为 5、10、20、40和 80~xmol／L的 手霉素各 1O L，以不加手霉素的3AO细胞作为对 照组，以无3AO细胞的 RPMI 1640培养液作为空白 组，每组设 3个平行孔。细胞培养 24、48和 72 h 后，加入 Mrr(5 mg／mL)10 L／孔，继续培养 4 h。 弃去上清液，加人 100 l／孔 DMSO，振荡 10 rain使 结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定波长 492 nm、参考波长620 nm处各孔的吸光度(D)值。 按以下 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算细胞的生长抑制率：细胞生长抑制 率(％)：( 对照组一D实验组)／(D对照组一 空白绀)x 100％；按改良寇式法计算手霉素对 3AO细胞的半 数抑制浓度(half inhibition concentration，IC5n)值。 实验重复3次。 1．2．3 显微镜下观察3AO细胞形态的变化 收集 未经手霉素处理和经 40／,zmol／L手霉素处理 48 h 后的3AO细胞，一部分用 Giemsa染色后，在倒置相 差显微镜下观察 3AO细胞的形态变化；另一部分先 用2．5％戊二醛溶液固定，再用 1％锇酸溶液固定， 逐级乙醇脱水，树脂包埋，行连续 50 nnl超薄切片， 经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，于透射电子显 微镜下观察细胞的超微结构变化。 1．2．4 FCM检测手霉素对3AO细胞周期和细胞凋 亡的影响 收集 0、5、l0、20、40和 80 Ixrnol／L手霉 素作用48 h后的3AO细胞，加 4℃预冷的70％乙 醇溶液固定细胞 2 h；加 RNase酶于37℃作用 1 h； 加碘化丙啶 1 mL，于4℃条件下染色30 min；以500 目铜网过滤，上流式细胞仪分析细胞周期的时相分 布和细胞凋亡情况。 1．2．5 手霉 素对 3AO细胞 ras、survi~’in和 NF．s：B (p65)蛋白表达的影响 收集0、10、20和40 Ixmol／L 手霉素作用 48 h后 的 3AO细胞，用 4 预冷的 70％乙醇溶液固定细胞2 h，RNase酶消化。取单细 胞悬液 1mL，加入 1：500稀释的鼠抗人 ras、survivin 单克隆抗体和1：l 000稀释的NF—KB(p65)单克隆 抗体各 100 jxL，室温培育 30 min；加 PBS 10 mL洗 涤，弃上清液，加 1：100稀释的羊抗鼠FITC—IgG二 抗 100 L，室温下避光培育 30 min；用 PBS 10 mL 洗涤后，加 PBS 100 txL悬浮细胞，500目铜网过滤 后上流式细胞仪检测各组细胞 ras、survivin和 NF— KB(p65)蛋白的表达。以PBS代替一抗和二抗作为 阴性对照，按以下公式计算荧光指数 (fluorescence index，FI)：FI=试验样品的均道值／阴性对照样品 的均道值。 1．3 统计学方法 应用 SPSS 14．0软件进行统计 分析，计量数据用 x-4-S表示，多组问数据进行单因 素方差分析，两组问数据比较采用 t检验。P<0．05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2．1 手霉素对3AO细胞增殖的影响 MTT法检测 结果显示，与对照组比较，手霉素对 3AO细胞的增 殖有明显的抑制作用，且随着手霉素浓度的增加和 作用时间的延长，其对细胞增殖的抑制作用明显增 强(P<0．05)。手霉素作用24 h时，其对 3AO细胞 的Ic50值为63．07 p~mol／L，48 h时为49．17~Lmol／L， 72 h时为32．61~xmol／L(图 1)。 图1 MTT法检测手霉索对 3AO细胞的增殖 抑制作用(n=3) Fig．1 Inhibitory effects of manumycin on 3AO cell prolif~-ration detected by MTT method(n=3 J 2．2 手霉素对 3AO细胞形态学的影响 未经手霉 素处理的3AO细胞贴壁生长，呈菱形或梭形，细胞 透明，形态饱满，细胞问界限清楚，细胞核隐约可见 (图2A)；Giemsa染色后发现，细胞核染色均匀，核 仁清晰可见，未见凋亡细胞出现(图2B)；透射电子 加 ∞ 舳 ∞ ∞ 加 o 第 8期．张正茂 ，等．手霉素对人卵巢癌3AO细胞增殖和凋亡的影响 显微镜下观察可见，细胞形态较大，呈圆形，细胞膜 完整，表面有大量绒毛样突起，细胞核大，形态不规 则，有 1～3个核仁，无明显染色质边集，细胞质内细 胞器丰富，可见内质网、线粒体和溶酶体等细胞器 (图2c)。经 40 p~mol／L手霉素作用 48 h后，3AO 细胞变圆、皱缩、破裂，呈不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 形，出现漂浮状态生 长的细胞数量明显增加，细胞内部结构受到破坏，存 活细胞显著减少(图 2D)；Giemsa染色后发现，细胞 质浓缩，细胞核着色不均匀，出现核分裂现象，呈凋 亡细胞的形态学改变(图2E)；透射电子显微镜下观 察可见，细胞体积缩小，微绒毛减少，细胞质浓缩，细 胞核局部向外呈锐角突起，核染色质高度浓缩、电子 密度增高并边集于核膜下，有的核染色质呈半月形， 有的出现核固缩和核碎裂(图2F)。 E A—C：Untreated with manumycin；D-F：Treated with 40 ~mol／L manumycin；A and D：The morphological changes of 3AO cells under inverted micro— scope(×100)；B and E：The morphological changes of 3AO cells stained with Giemsa(X400)；C and F：The morphological changes of 3AO cells un- der transmission electron microscope(×10 000) 图2 倒置显微镜和电子显微镜下观察手霉素作用48 h后3AO细胞的形态学变化 Fig．2 The morphological changes of 3AO cells treated with manumycin for 48 h observed under inverted microscope and transmission electron m icroscope 2．3 手霉素对3AO细胞周期分布和细胞凋亡率的 影响 0、5、10、20、40和 80 p~mol／L手霉素作用 3AO细胞48 h后，随着药物浓度的逐渐增加，G ／G 期细胞逐渐减少，G ／M期细胞逐渐增多，s期细胞 变化不明显(表 1)，细胞阻滞于 G ／M期。0、5、10、 20、40和80 I,zmol／L手霉素作用 3AO细胞 48 h后， 随着药物浓度的逐渐增加，细胞凋亡率逐渐上升 (图3、表 1)。 2．4 手 霉 素对 3AO 细胞 ras、NF—KB(p65)和 survivin蛋白表达的影响 经 0、10、20和40~xmol／L 手霉素作用48 h后，3AO细胞 ras蛋白表达的 FI值 分另0为 1．000±0．002、0．981±0．0O9、0．772±0．012 和0．211±0．017；NF。KB(p65)蛋白表达的FI值分别 为 1．000±0．020、0．955±0．0l1、0．833±0．028和 0．729±0．029；survivin蛋 白表达 的 FI值分别 为 1．0O0±0．021、0．763±0．069、0．551±0．093和 0．250±0．171。与对照组比较，随着手霉素作用浓度 的增高，3AO细胞ras蛋白表达被明显抑制(P<0．05)， 进而使 NF—KB(p65)蛋白表达下降(P<0．05)，survivin 蛋白表达亦呈进行性下降(P<0．05)。见图4。 肿瘤 2010年8月，第 30卷 表 1 FCM检测手霉素对3AO细胞周期和细胞凋亡的影响 Table 1 Effects of mannmyein on cell cycle and apoptosis of 3AO ceils detected by flow eytometry (i±s／％ ，n=3) P 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 研究显示，手霉素能呈剂量依赖性地抑制人肝 癌、乳腺癌、舌鳞癌和白血病细胞的生长，降低其侵 袭能力[2-5j。手霉素抑制肿瘤细胞生长的主要机制 是影响ras蛋白的法尼基修饰，或通过 p38MAPK通 路和激活线粒体依赖性凋亡通路来诱导肿瘤细胞的 凋亡。本研究结果显示，手霉素对3AO细胞有显著 ∞ l_暑 0j 第 8期．张正茂，等．手霉素对人卵巢癌 3AO细胞增殖和凋亡的影响 的生长抑制作用，并随着作用时间的延长和药物浓 度的增加而增强；手霉素作用后，3AO细胞出现凋 亡的形态学和超微结构改变，细胞凋亡率明显高于 对照组；细胞周期阻滞于 G：／M期。 研究显示，NF—KB通过抑制细胞死亡信号转导、 调节细胞周期、保护细胞免受肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和其他刺激因素诱导的细胞凋 亡，进而抑制细胞凋亡 。Cao等 研究发现，抑制 NF-KB的活性可增加肿瘤细胞对放射线和化疗药物 的敏感度。NF—KB还可作用于与肿瘤发生、发展相 关的癌基因，如抑制 NF—KB信号通路可致 p53基因 缺失而导致肿瘤细胞凋亡 。Survivin蛋白具有抑 制细胞凋亡和调节细胞增殖的作用。在抑制细胞凋 亡过程中，survivin可直接抑制下游凋亡效应因子 caspase一3和 caspase-7而发挥作用 ’ⅧJ。Survivin作 为调节基因，在细胞周期的 G ／M期表达，可对抗 G，／M期凋亡的诱导。在癌组织中，survivin表达增 高，并且与化疗耐药和放疗抵抗相关 ¨。本研究结 果显示，随着手霉素作用浓度的增加，3AO细胞中 ras和 NF—KB(p65)蛋白的表达水平逐渐下降，即手 霉素通过下调 ras基因的表达，进而抑制 ⅣF—KB (p65)基因的表达，使细胞内细胞增殖性基 因(如 survivin)的转录活性降低，阻制细胞周期进程，从而 抑制肿瘤细胞的增殖。作者推测，手霉素通过抑制 survivin基因转录引起细胞 G：／M期阻滞，进而通过 减弱对 caspase凋亡途径的抑制作用引起 3AO细胞 凋亡，这可能是手霉素诱导3AO细胞凋亡的机制之 — — — — O 总之，本研究通过体外实验证实，手霉素具有抑 制卵巢癌细胞 3AO的增殖并诱导其凋亡的作用，其 机制可能是手霉素下调细胞 ras蛋白的表达，进而 抑制 NF．KB／survivin信号通路 ，影响细胞周期进程， 使 3AO细胞被阻滞于 G：／M期。本研究为手霉素 用于卵巢癌的临床治疗提供了实验依据。 [参 考 文 献] [1] HU Y，FLOSS H G．New typeⅡmanumycins produced by strep— tomyces nodosus ssp．asukaensis and their biosynthesis[J]．， Antibiotic(Tokyo)，2001，54(4)：340—348． [2] PAN J，CHEN B，SU C H，et a1．Autophagy induced by famesyl— transforase inhibitors in cancer cells f J]．Cancer Biol Ther， 2008，7(10)：1679-1684． [3] SAHA B，NANDI D．Famesyhransferase inhibitors reduce Ras ac— tivation and ameliorate acetaminophen—induced liver injury in mice [J]．Hepatology，2009，50(5)：1547—1557． [4] SHE M，JIM YEUNG S C．Combining a matrix metall。pr0teinase inhibitor，a farnesyhransferase inhibitor，and a taxane improves survival in an anaplastic thyroid cancer model[J]．Cancer Lett， 2006，238(2)：197—201． [5] SHE M R，GUO K 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