猪_干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

46 卷 　3 期 2006 年 6 月 4 日 微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica 46 (3) :412～417 4 June 2006 基金项目 :南京农业大学青年科技创新基金 ( KJ05013)3 通讯作者。Tel : 86225284396028 ; Fax :86225284396335 ; E2mail : aid @njau. edu. cn 作者简介 :曹瑞兵 (1976 - ) , 男 ,江苏海安人 ,博士 ,讲师 ,主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。E2mail : crb @njau. edu. cn 收稿日期 :2005209201 ;接受日期 :2005212205 ;修回日期 :2005212229 猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用 曹瑞兵 ,周国栋 ,周海霞 ,包晶晶 ,陈溥言 3 (南京农业大学　农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室　南京　210095) 摘 　要 :为了研制高活性的重组猪β干扰素 ,对 PoIFN2β成熟蛋白第 3、7 和 164 位的 3 个氨基酸密码子进行毕赤酵 母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体 pPICZαA2PIB。pPICZαA2PIB 经 Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株 X233。多株 PCR 鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了 PoIFN2β, 其中 B1 株酵母的 PoIFN2β产量最 高 ,约为 215 ×105UΠmL ,其表达量约为 60μgΠmL ,比活为 4117 ×106UΠmg。将发酵上清液用 PEG20000 浓缩后进行 SDS2 PAGE和 Western blot 检测 ,结果表明表达产物是分子量约为 28kDa 和 25kDa 蛋白的混合物 ,两者均可与 PoIFN2β阳 性抗血清发生特异反应。表达产物比 PoIFN2β理论推导分子量 (约 2018kDa)大 ,推测可能是表达产物发生了不同程 度的糖基化。重组 PoIFN2β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用 ,并且 rPoIFN2β对伪狂犬病毒在 MDBK细 胞上早期增殖的抑制效果最为明显。 关键词 : 猪β干扰素 ;毕赤酵母 ;分泌表达 ;伪狂犬病毒 ;抗病毒 中图分类号 :Q78 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :000126209 (2006) 0320412206 　　干扰素是一类动物机体产生的多功能分泌蛋 白 ,涉及抗病毒、细胞生长调节和免疫激活等。β干 扰素 ( Interferon beta , IFN2β)主要由成纤维细胞产生 , 具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤 细胞的活性、增加抗原提呈细胞 MHC I 型分子表达 以及抑制白细胞增殖等功能 ,在人类主要用于治疗 多发性硬化症[1 ] 。IFN2β氨基酸序列和抗原性与 IFN2α显著不同 ,但与 IFN2α结 合同 劳动合同范本免费下载装修合同范本免费下载租赁合同免费下载房屋买卖合同下载劳务合同范本下载 样的受体 ,发挥 相似的生物学活性 ,因此都属于 I型干扰素。 Weingartl 和 Derbyshire 等[2 ] 用聚肌胞 (ployI : C) 刺激猪肾细胞 PK215 获得了具有较高抗病毒活性的 猪β干扰素 ( Porcine interferon beta , PoIFN2β) ,发现 PoIFN2β可较好地抑制猪流感病毒、轮状病毒和水疱 性口炎病毒在猪肾细胞上的增殖。Artursson 等[3 ] 于 1992 年首次克隆了 PoIFN2β编码基因并证明其在猪 基因组中只存在 1 个拷贝。PoIFN2β基因全基因为 561bp ,编码 165 个氨基酸的成熟蛋白和 21 个氨基 酸的信号肽 ,PoIFN2β成熟蛋白部分含有 3 个半胱氨 酸和 3 个 N2糖基化位点。在氨基酸水平上 PoIFN2β 与人类β干扰素的同源性为 63 % ,而与猪α干扰素 的同源性只有 32 %。 我们在前期的研究中克隆了 PoIFN2β基因并在 大肠杆菌中进行了表达 ,表达产物以包涵体的形式 存在 ,纯化的复性后产物的抗病毒活性为 516 × 105UΠmg[4 ] 。毕赤酵母是一种新型的外源基因表达 系统 ,已有多种蛋白在此系统中高效表达[5～7 ] ,不存 在原核表达系统的内毒素难以去除的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,也不存 在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问 题 ,并可进行类似高等真核生物的信号肽剪切和糖 基化等 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 后加工[8 ] 。表达载体 pPICZαA 的醇氧化 酶启动子 AOX1 可用甲醇严格调控 ,表达盒的 N 端 带有引导分泌表达的α2MF 信号肽序列 ,表达产物可 分泌到上清。本研究应用毕赤酵母表达系统来表达 PoIFN2β,获得分泌表达的高活性重组 PoIFN2β,并研 究其对伪狂犬病毒 (Psuedorabies virus ,PrV)的抗病毒 作用 ,为实现重组 PoIFN2β工程化生产和进一步研 究其生物学功能提供实验基础。 1 　材料和方法 111 　材料 11111 　菌株、病毒株、细胞和动物 : 大肠杆菌 ( Escherichia coli ) DH5α、MDBK细胞、RK213 细胞、143 TK- 细胞、水泡性口炎病毒 ( Vesicular Stomatitis Virus ,VSV)和伪狂犬病毒上海株 ( Pseudorabies Virus , PrV2SH) 均为本室保存。毕赤酵母 ( Pichia pastoris ) X233 和分泌型酵母表达载体 pPICZαA 为 Invitrogen © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 公司产品。5 周龄的清洁级 BALBΠc 雌性小鼠购自 扬州大学实验动物中心。 11112 　主要试剂 :含 PoIFN2β全基因的克隆载体 p GEM2TB 由本室构建保存。蛋白质分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 购 自中国科学院上海生化与细胞研究所。限制性核酸 内切酶、连接酶、ExTaq 聚合酶、核酸分子量标准均 购自大连 TaKaRa 公司。层析介质购自安玛西亚公 司。酵母培养基 Peptone、YNB (WΠO)为Difico 公司产 品 ,Easy SelectTM Pichia Expression Kit 和 ZeozinTM均为 Invitrongen公司产品 ,羊抗鼠 IgG2HRP、生物素购自 华美生物工程公司 ,其它试剂均为分析纯。 112 　引物的设计和合成 根据文献 [1 ]设计一对引物用于扩增和改造 PoIFN2β成熟蛋白编码基因。引物序列为 P1 :5′2ATA GAATTCATGAGCTACGATGTGCTTCGTTAC 23′( EcoRⅠ) ; P2 : 5′2CGATCTAGAGAGTTACGGAGGTAATCTGTAAG TC23′( Xba Ⅰ) 。另设计一对醇氧化酶 (AOX1) 基因 特异引物用于检测外源基因是否插入酵母基因组 , 引物序列为 P3 :5′2GACTGGTTCCAATTGACAAGC23′; P4 :5′2GCAAATGGCATTCTGACATCC23′。引物由上海 博亚生物技术公司合成。 113 　PCR扩增 PCR 反应中模板为含 PoIFN2β全基因的质粒 p GEM2TB , 总体积为 50μL , 其中 10 ×buffer 5μL , 25mmolΠL Mg2 + 3μL , 215mmolΠL dNTP 4μL , 20pmolΠμL 引物 P1、P2 各 1μL , 模板 2μL , ExTaq 015μL , ddH2O 3315μL。反应条件 : 94 ℃ 5min ; 94 ℃ 1min , 54 ℃ 1min ,72 ℃90s ,30 个循环 ;72 ℃10min。 114 　pPICZαA2PIB载体的构建 将改造的 PoIFN2β成熟蛋白基因和表达载体 pPICZαA 用 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ进行双酶切 ,回收酶切 片段 ,PoIFN2β基因和 pPICZαA 载体按 3∶1 的摩尔比 4 ℃过夜连接。转化氯化钙法制备的感受态大肠杆 菌 DH5a。挑取低盐 LB 平板上的 Zeocin 抗性菌落 , 提质粒用 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ进行双酶切鉴定。将获 得的阳性重组载体命名为 pPICZαA2PIB ,送上海博亚 生物技术公司测序。 115 　酵母细胞的转化及鉴定 参照 Easy SelectTM Pichia Expression Kit 的说明 , 制备毕氏酵母菌株 X233 的感受态细胞 ,并将 Sac Ⅰ 单酶切的线性化重组质粒 pPICZαA2PIB 经电转化导 入感受态细胞 , 电转化的条件为 115kV、25μf 和 200Ω。将电转化后的酵母细胞涂板于含 100μgΠmL ZeozinTM的 YPDS平板 ,30 ℃培养 2d。挑选 ZeozinTM抗 性克隆复制到 MM平板和 MD 平板 ,30 ℃培养 3d 后 筛选出在两种培养基上都能正常生长良好的 Mut + 菌落。将这些菌落进一步复制到 ZeozinTM 浓度为 500μgΠmL 的 YPDS 平板筛选出多拷贝整合的酵母克 隆。挑选单个克隆接种于含 100μgΠmL ZeozinTM 的 YPD 培养液 ,取少量发酵菌体按文献[9 ]介绍的煮沸 冻溶法提取酵母基因组 ,应用 PoIFN2β基因特异引 物 PCR 鉴定其基因是否整入酵母基因组 ,用醇氧化 酶 (AOX1)基因特异引物 PCR 鉴定猪β2干扰素基因 是否插入 AOX1 启动子部位。 116 　酵母重组子的诱导表达 将筛选的多个酵母克隆接种于 BMGY培养液 , 30 ℃震荡培养 16 ～ 20h ( OD600 约为 410 ～ 610) 。 3000rΠmin 离心 5min 收集细胞 ,用 BMMY培养液重 悬并调节浓度至 OD600约为 110 ,30 ℃震荡培养每隔 24h 补加甲醇至终浓度为 1 % ,连续培养 4d。每 24h 取样一份 ,测定蛋白表达量及其抗病毒活性 ,确定最 佳收获时机。 117 　鼠抗 PoIFN2β抗体的制备 取 6 周龄的清洁级 BALBΠc 雌性小鼠 5 只 ,每只 小鼠腹腔注射原核表达的 PoIFN2β与等体积的弗氏 完全佐剂的乳化物 400μL ,约含抗原 30～40μg ;3 周 后用等量的重组 PoIFN2β和弗氏非完全佐剂乳化后 腹腔注射进行二免 ;再过 3 周后每只小鼠腹腔注射 重组 PoIFN2β200μL。3d 后按常规方法采血制备抗 血清 ,ELISA 测定效价。 118 　表达产物的 ELISA检测及 Western blot 鉴定 将收集的发酵液 8000rΠmin 离心 15min ,尽可能 除去酵母细胞。用 ELISA 进行表达产物的初步检 测 ,主要步骤为将待检样品倍比稀释后加到包被兔 抗 PoIFN2β IgG 的酶标板 ,阳性对照为原核表达的 PoIFN2β,阴性对照为相同处理的空载体转化酵母菌 发酵液 ;一抗为原核表达的重组猪β2干扰素免疫小 鼠制备的阳性血清 ,二抗为羊抗鼠 IgG2HRP ; SΠN > 211 且 P ≥013 判断为阳性。取 20mL ELISA 阳性的 上述处理的发酵上清 ,置截流分子量为 10000Da 的 透析袋 ,用 PEG20000 反透析浓缩。取 10 倍浓缩的 发酵上清加入等体积的 2 ×SDS 上样缓冲液 ,煮沸 5min。将上述样品进行 SDS2PAGE 和 Western blot 检 测分析。 119 　表达产物的处理及抗病毒活性测定 将发酵液 8000rΠmin 离心 15min , 取上清用 0145μm 的滤膜过滤后 ,用 011molΠLPBS (pH712)充分 透析。用 0122μm 的滤膜过滤除菌 ,至 4 ℃保存备 314曹瑞兵等 :猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用.Π微生物学报 (2006) 46 (3) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 用。应用微量细胞病变抑制法检测干扰素抗病毒活 性 ,采用 MDBK细胞2VSV (水泡性口炎病毒) 系统 , 具体步骤参照文献 [10 ]。将抑制 50 %细胞病变出 现孔最大稀释度的干扰素定义为 1 个干扰素活性单 位 (U) 。 1110 　rPoIFN2β对 PRV2SH在 MDBK、RK213 细胞 和 143 TK2细胞中增殖的影响 用含 10 %小牛血清的 DMEM 营养液将 rPoIFN2β 稀释为 1000UΠmL。在 96 孔细胞培养板上用 100μLΠ 孔的 rPoIFN2β分别预处理 MDBK细胞、RK213 细胞 和 143 TK2细胞 24h ,同时设各种细胞的空白对照。 作用结束后 ,弃去培养上清 ,用无血清的培养液洗涤 一次 ,每孔加入 100μL 1000TCID50ΠmL PRV2SH 病毒 液 ,吸附 1h。弃去上清 ,加入含 2 %小牛血清的维持 液 ,置于 37 ℃,5 % CO2 继续培养 ,观察各处理的病 变出现情况。 1111 　PRV2SH在 rPoIFN2β预处理的 MDBK细胞 中的增殖试验 胰酶消化的MDBK细胞记数后用营养液稀释到 适当的密度 , 滴加到 3 块 24 孔板 , 置于 37 ℃、 5 % CO2 培养待细胞贴壁。分别将含 1000UΠmL 和 100UΠmL rPoIFN2β的完全培养液按 1mLΠ孔加入 24 孔板的细胞中 ,每个浓度 6 个孔 ,置于 37 ℃、5 % CO2 的培养箱中作用。20～24h 后弃去培养液 ,用无血 清的培养液洗涤一次 ,每孔加入 1mL 1000TCID50ΠmL PRV2SH病毒液 ,置于 37 ℃、5 % CO2的培养箱中吸附 1h 后弃去上清 ,每孔加入 1mL 含 2 %小牛血清的营 养液。同时设病毒对照和细胞对照各 6 个孔。分别 于接毒后 12h、24h 和 48h 取出一块 24 孔板 , 置 - 20 ℃冻存。冻融 2 次后用 RK213 细胞测定各处理 中 3 个细胞孔中的 PRV2SH 滴度。按 Reed2Muench 法计算病毒 TCID50 。试验重复 3 次。 1112 　数据分析 每个处理取 3 个平行样 ,试验重复 3 次 ,平均值 作为统计数据 ,用平均数 ±标准误 (Mean ±SE) 表 示。数据用 SAS和 Microsoft Excel 软件分析 ,差异显 著性采用 Student’s T检验。 2 　结果 211 　PoIFN2β基因的扩增、克隆和测序分析 以 p GEM2TB 为模板 ,应用引物 P1 和 P2 PCR 扩 增出大小约为 515bp 的片段。用 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ双 酶切后插入 pPICZαA 载体的 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ位点 间 ,获得重组载体 pPICZαA2PIB。测序结果表明插入 基因为阅读框对位的完整的 PoIFN2β成熟蛋白编码 基因 ,且编码 PoIFN2β的第 3、7 和 164 位氨基酸的密 码子分别由酵母稀有密码子改造为偏嗜密码子 TAC、CGT和 CGT。 212 　酵母转化及获得克隆的鉴定结果 线性化的 pPICZαA2PIB 电转化毕赤酵母 X233 感 受态细胞获得 100 多个 ZeozinTM抗性克隆。在这些 克隆中筛选出 25 个在 MM 和 MD 两种培养基上都 正常良好生长的 Mut + 菌落。进一步用高浓度的 ZeozinTM培养基筛选得到 5 个多拷贝克隆。应用猪 β2干扰素特异引物 P1 和 P2 及醇氧化酶特异引物 P3 和 P4 进行 PCR 鉴定 ,结果 (图 1)表明在筛选的菌株 中 PoIFN2β基因已整合到酵母染色体的 AOX1 位置。 图 1 　PCR鉴定酵母中的 poIFN2β基因 Fig. 1 　Identification of the gene of poIFN2βin yeast by PCR. M1. Marker DL15000 ;1. Products of PCR from pPICZαA2PIB transformed yeast ; 2. Products of PCR from pPICZαA transformed yeast cells ;3. poIFN2βgene ; M2. Marker DL2000. 213 　阳性酵母克隆的诱导表达及表达产物的检测 先将获得的 5 株酵母克隆进行小量甲醇诱导培 养 ,检测 PoIFN2β的表达情况。ELISA 检测结果表明 编号为 B1 克隆酵母菌的发酵上清中 PoIFN2β的含 量较高。PEG20000 浓缩的表达上清进行 SDS2PAGE , 可见有两条分子量约为 25kDa 和 28kDa 的条带 (图 2) ,而空白对照和阴性对照的相应位置没有条带。 　　　 图 2 　表达产物 SDS2PAGE( A)及 Western blot( B)鉴定 Fig. 2 　Expressed products analyzed by SDS2PAGE and Western blot . M. Protein Marker ; 1 ～ 5. Expressed products from five selected clones namely A2 , B1 , E4 , F2 and G1 ; 6. Western blot result of expressed product of B1 ; 7. Western blot result of expressed product of pPICZαA transformed yeast cells. 414 CAO Rui- bing et al .ΠActa Microbiologica Sinica (2006) 46 (3) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 进一步的 Western blot 结果 (图 2)表明这两条带均可 与 PoIFN2β阳性抗血清发生特异反应 ,都具有良好 PoIFN2β抗原性。 214 　表达产物的产量及抗病毒活性检测 将克隆 B1 进一步放大诱导培养 ,测定不同诱 导时间的发酵上清中表达产物活性。最早可在诱导 后 24h 检测到 PoIFN2β,诱导后 72h 的发酵上清抗病 毒活性最高 ,达 215 ×105UΠmL ;随着诱导时间的继 续延长发酵上清抗病毒活性反而降低 ,到 96h 时只 有 1189 ×105UΠmL ,可能是表达产物被蛋白酶水解 所致。因此确定诱导时间为 72h。 采用薄层扫描 B1 克隆诱导后 72h 的表达产物 电泳结果 ,估测 25kDa 和 28kDa 的条带蛋白约占总 蛋白的 82 %。根据微量蛋白检测仪的测定得知 ,其 上清中可溶蛋白的总浓度为 73μgΠmL ,因此重组猪 β2干扰素的表达量约为 60μgΠmL ,其比活为 4117 ×106UΠmg。215 　rPoIFN2β预处理 MDBK、RK213 细胞和 143TK2细胞对 PRV2SH增殖的影响用 1000UΠmL rPoIFN2β预处理的 MDBK细胞与未处理的对照相比 ,出现 PRV2SH 病变的时间推迟 ,病变的严重程度也较轻 (图 3) ,尤其在出现病变的早期对比最明显。用 1000UΠmL 的 rPoIFN2β预处理的 RK213 细胞和 143TK2细胞与未处理的对照相比 ,在接种 PRV2SH后病变的出现时间和严重程度并没有明显的差异。此外 ,PRV2SH在MDBK细胞上的病变特征表现为细胞塌陷 ,形成空圈 (图 3) ,并迅速扩散。而 PRV2SH在 RK213 细胞和 143TK2细胞则具有明显的溶细胞特征。 图 3 　PrV SH株在不同处理的 MDBK细胞上的病变 Fig. 3 　Cell pathological effects of pseudorabies virus SH strain in different treated MDBKcells . A : Severe CPE of PrV in MDBKcell ; B : CPE of PrV in rPoIFN-βpretreated MDBK cells ; C : Control MDBK cells. 图 4 　接毒后不同时间各处理组 MBD K细胞中的 PrV2 SH增殖滴度的比较 Fig. 4 　Comparison of PrV titers in different treated MDBK cells during different times after virus inoculation. Mean values with different superscripts (A , B , C) are extra- significantly different P < 0. 01 and with (a , b , c) are significantly different P < 0. 05. 216 　rPoIFN2β预处理 MDBK细胞对 PrV2SH增殖 的影响 PrV2SH在 1000UΠmL 和 100UΠmL rPoIFN2β处理 及对照MDBK细胞中不同时间的病毒增殖滴度有明 显差异。数据分析结果 (图 4) 表明 :接毒后 12h ,两 种浓度的 rPoIFN2β处理组中病毒滴度与对照组中的 病毒滴度差异均极显著 ;1000UΠmL rPoIFN2β处理组 与 100UΠmL rPoIFN2β处理组之间的作用差异不显 著。接毒后 24h ,不同处理的 3 组细胞中的 PRV2SH 滴度均显著。到接毒后 48h ,100UΠmL rPoIFN2β处理 组与对照组中的 PRV2SH 滴度差异不显著 , 而 1000UΠmL rPoIFN2β 处理组与对照组和 100UΠmL rPoIFN2β处理组的病毒滴度均差异显著。 3 　讨论 本研究实现了 PoIFN2β基因在毕赤酵母中的高 效分泌表达 , 获得的稳定分泌表达 PoIFN2β的酵母 菌株B1 在BMMY培养基中经甲醇诱导发酵 72h 后 , 上清液中 rPoIFN2β的活性为 215 ×105UΠmL ,表达量 约为 60μgΠmL ,rPoIFN2β比活为 4117 ×106UΠmg。 在前期的研究中用大肠杆菌表达的 PoIFN2β经 复性和纯化后的比活为 516 ×105UΠmg ,因此 ,酵母表 达 PoIFN2β的活性显著高于大肠杆菌表达的 PoIFN2 β。大肠杆菌表达的 PoIFN2β以包涵体的形式存在 , 514曹瑞兵等 :猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用.Π微生物学报 (2006) 46 (3) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 需经提取、变性、复性和纯化后才具有活性。酵母表 达的 PoIFN2β直接以有活性的形式分泌到发酵上清 液中 ,不需要变性和复性等生产工艺 ,发酵上清液中 的杂蛋白含量很低 ,更易进行大规模的生产。而且 毕赤酵母表达的 PoIFN2β发生了糖基化修饰 ,更接 近于 PoIFN2β在猪体内的存在形式。 本研究中 PoIFN2β表达产物的分子量分别约为 25kDa 和 28kDa ,均高于 PoIFN2β成熟蛋白和 C 端融 合蛋白的理论推导分子量 22kDa。黄海等[11 ]应用毕 赤酵母表达的猪α干扰素时也发现理论分子量为 22kDa 的 PoIFNα由于糖基化作用其酵母表达产物为 2618 kDa。PoIFN2β成熟多肽由 165 个氨基酸组成 , 成熟多肽中含 3 个糖基结合位点 Asn2X2SerΠThr , 分 别位于 73～75Aa、80～82Aa、152～154Aa 位。因此 , 推测分子量偏大可能是 PoIFN2β表达产物发生不同 程度的糖基化 ,但其确切原因还有待今后的去糖基 化分析或分离纯化后进一步研究。 在研究中发现诱导表达的后期 ,随着时间的延 长 (72h 至 96h) ,表达上清的抗病毒活性反而有些下 降。这可能是由于酵母在发酵过程中产生了少量的 胞外蛋白酶 ,目前已有一些办法解决这一问题[12 ] 。 如在培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物作为蛋白 酶的底物 ;改变培养基的 pH 值 ,以降低蛋白酶的活 性 ;使用蛋白酶缺陷酵母菌株来表达外源蛋白 ,如 SMD1163、SMD1168 等 ;点突变外源蛋白基因的个别 位点 ,改变其蛋白序列中蛋白酶的作用部位使其免 受蛋白酶的破坏。 研究发现伪狂犬病毒在重组 PoIFN2β处理的 RK213 和 143TK- 细胞中病变产生时间与严重程度 与对照组没有差异 ,推测这两种细胞表面没有或很 少存在 PoIFN2β可结合的受体。而MDBK对 PoIFN2β 较为敏感 , rPoIFN2β处理后可明显抑制伪狂犬病毒 的病变形成。 PrV2SH接种 MDBK细胞后的 12h ,1000UΠmL 和 100UΠmL rPoIFN2β处理组与对照组的病毒平均滴度 差异均极显著 ,表明 1000UΠmL 和 100UΠmL rPoIFN2β 均可有效抑制 PrV2SH在 MDBK细胞上的早期复制。 而接毒后 48h ,1000UΠmL rPoIFN2β处理组与 100UΠmL rPoIFN2β处理组和对照组差异显著 ,而后两组的差 异不显著 ,表明 PrV 存在着一定的拮抗干扰素抗病 作用的能力 ,但是这种拮抗能力与干扰素的抗病毒 能力的作用结果与干扰素的剂量有关。本研究为重 组 PoIFN2β的工程化生产及其抗病毒作用的进一步 研究奠定了基础。 参 考 文 献 [ 1 ] Nachum D , Pamela BY. 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All rights reserved. http://www.cnki.net Secreted expre ssion of porcine interferon beta in Pichia pastoris and it s inhibition effect on the replication of p seudorabie s virus CAO Rui2bing ,ZHOU Guo2dong ,ZHOU Hai2xia ,BAO Jing2jing ,CHEN Pu2yan 3 ( Key Laboratory of Animal Disease Diagno stic and Immunology , Ministry of Agriculture , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China) Abstract : In order to develop recombinant porcine interferon beta with high bioactivity , the rare codes that encoded 3th ,7th and 164th amino acids of porcine interferon beta mature protein were mutant into bias codes of Pichia pastoris and then the modified gene was introduced to yeast secreted expression vector pPICZαA which resulted in pPICZαA2PIB. The SacI linearized plasmid pPICZαA2PIB was transformed into Pichia pastoris X233 by electroporation. The transformants were identified by PCR using PoIFN2β and AOX1 specific primers. The expression of PoIFN2βwas induced with methanol. Several po sitive clones were obtained and the one namely B1 produced the highest level of PoIFN2β. The B1 was further fermented in shake2flask in larger volume . The concentration of the secreted PoIFN2βwas about 60μgΠmL and it s antiviral activity is about 215 ×105UΠmL , so the specific activity of porcine interferon beta produced by the Pichia pastoris is approximately 4117 ×106 UΠmg. The expressed supernatant was concentrated and identified by SDS2PAGE and Western blot . There are two major proteins with respective molecular mass of approximately 25kDa and 28kDa in the supernatant . The result s of Western blot indicated that the two proteins were po sitively reacted and manifested well PoIFN2β antigenicity. In contrast with the deduced theoretical molecular mass value of PoIFN2β, the expressed two major proteins were larger which maybe due to the difference of glyco sylation. The antiviral effect of recombinant porcine interferon beta ( rPoIFN2β) on Pseudorabies virus ( PrV) was studied in the present experiment . The result indicated that rPoIFN2β could effectively inhibit the replication of PrV in MDBK cells , especially during the early phage of the virus replication. Keywords : Porcine interferon beta ; Pichia pastoris ; Secreted expression ; Pseudorabies virus ; Anti2virus3 Corresponding author. Tel : 86225284396028 ; Fax :86225284396335 ; E2mail : aid @njau. edu. cn Received :1 September 2005ΠAccepted :5 December 2005ΠRevised : 29 December 2005 科学出版社生命科学编辑部新书推介 《中国科学院优博论丛》 白春礼 　主编 　ISBN 7 - 03 - 017034 - 2ΠN. 248 　定价 :50. 00 元 　2006 - 04 本书是在 2005 年评选出 50 篇中国科学院优秀博士 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 的基础上整理而成 ,内容涉及数理化、生 物、资环、工程等学科的一些最新、最前沿的研究热点 ,是对这些研究方向的综合论述 ,内容比较广泛也 比较具有代表性 ,整体水平比较高 ,充分体现了各学科相关领域发展的前沿性和创新性。本书可供相关 研究领域的科研人员、研究生等检索和参考 ,对于正在攻读博士学位的研究生具有很好的参考意义 ,也 可作为相关人员了解学科发展的参考资料。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书 (免邮费) 。 邮购地址 :100717 北京东黄城根北街 16 号科学出版社 科学分社 ,联系人 :阮芯 　电话 :010264034622(带传真) 更多精彩图书请登陆网站 http :ΠΠwww. lifescience. com. cn ,欢迎致电索要书目 ,010264012501 714曹瑞兵等 :猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用.Π微生物学报 (2006) 46 (3) © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net