血管活性肠肽在胃腺癌组织及细胞中的表达及意义

血管活性肠肽在胃腺癌组织及细胞中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及意义 [摘要] 目的:研究胃腺癌组织和细胞中是否存在分泌血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)的肿瘤细胞,以探讨VIP在胃腺癌发生及发展中所起的作用。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 通过免疫组织化学和RT-PCR检测正常胃组织、胃腺癌组织和培养的胃腺癌细胞中VIP蛋白和 mRNA表达情况。结果:胃腺癌组织出现VIP免疫反应阳性细胞,相对正常的胃组织中均未见VIP 阳性细胞,胃腺癌组织中无阳性神经纤维,而相对正常的胃组织中均有阳性神经纤维存在,有 显著性差异(P<0.01)。培养的胃腺癌细胞中均有VIP免疫阳性细胞染色;胃癌组织和培养的胃 腺癌细胞中均有VIP mRNA表达。结论:胃腺癌组织和细胞中含有分泌VIP的肿瘤细胞,VIP在 胃腺癌的发生和发展中起着至关重要的作用。 [关键词] 血管活性肠肽;胃腺癌;肿瘤细胞 [中图分类号] R735.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)08(c)-018-03 Expression and significance of vasoactive intestinal peptide in the gastric adenocarcinoma tissue and cells ZHANG Yan1, SONG Ping1, LI Hongli2* (1.Clinical Nursing Staff Room, Technical Secondary Department of Dezhou College, Dezhou 253014, China; 2.Medicine Research Experiment Center of Science Research, Weifang Medical College, Weifang 261042, China) [Abstract] Objective: To study the expression of vasoactive intestinal peptide (VIP) in gastric adenocarcinoma, and evaluate the role of VIP in tumor genesis and progress of gastric adenocarcinoma. Methods: The expression of VIP protein and mRNA in the normal gastric tissue, gastric adenocarcinoma and cells was detected by immunohistochemical staining and RT-PCR. Results: The tissues of gastric adenocarcinoma had the positive cells stained by anti-VIP antibody, but the normal gastric tissues had no such positive cells. The normal gastric tissues had the positive nervous fibers, but the tissues of gastric adenocarcinoma had no such positive nervous fibers. The difference was statistically significant (P<0.01). There were VIP immunopositive cells in the gastric adenocarcinoma cells. Gastric tumor tissues and gastric adenocarcinoma cells could express VIP mRNA. Conclusion: The gastric adenocarcinoma has tumor cells secreting VIP, which indicates that VIP plays an important role in tumor genesis and progress of gastric adenocarcinoma. [Key words] Vasoactive intestinal peptide (VIP); Gastric adenocarcinoma; Tumor cells 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国,其发病率居各类肿瘤的首位,每年有17万人 死于胃癌,接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4,且每年还有2万以上新的胃癌患者出现,但目前 为止胃癌的发病机制尚不十分清楚,尤其是在神经内分泌方面的发病机制研究甚少。许多肿瘤 能分泌胃肠激素,血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是重要的胃肠激素之 一,参与了一些肿瘤的生长调节[1]。本实验旨在研究VIP在胃癌中的表达,以探讨VIP在胃癌 发病中的作用。 1 资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1 免疫组织化学标本30例胃腺癌手术切除标本均来源于潍坊医学院附属医院2000,2005年接受手术治疗的患者,其中,男性21例,女性9例;平均年龄(50.0?3.2)岁。正常对照20例均为尸体解剖所取的胃窦部相对正常胃组织全层。 1.1.2 RT-PCR标本15例胃腺癌标本均取自潍坊医学院附属医院手术切除标本。正常对照为手术切除胃标本的胃窦部相对正常胃组织全层。 1.2 检测方法 1.2.1 主要试剂兔抗人VIP多克隆抗体浓缩液、SABC免疫组化染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Trizol、M-MLV第一链cDNA合成试剂盒及PCR扩增试剂盒均购自上海生工生物工程公司。VIP、β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下,VIP:FP 5’-TAA TGG TGG ACC GCA ACA AC-3’;RP 5’-GTG AGC ACT GAA GCG AAA GC-3’;产物长度为390 bp。内参照β-actin,FP 5’-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3’;RP 5’-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3’;产物长度为314 bp。 1.2.2细胞培养采用中分化胃腺癌细胞系SGC-7901,在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中37?,5% CO2条件下常规培养。 1.2.3 免疫组织化学染色组织免疫组织化学染色:按SABC法免疫组化染色试剂盒操作步骤进行。细胞VIP蛋白表达:制备细胞爬片及固定,按2×107个/L细胞浓度接种12孔板,每孔2 ml,常规培养24 h。取出培养板中的盖玻片,用0.01 mol/L PBS洗2次,再滴加丙酮溶液固定5~10 min。每次实验随机取4张进行免疫组织化学染色,重复3次。 1.2.4 RT-PCR反应用Trizol法提取胃腺癌组织或细胞中的总RNA;逆转录获得cDNA后进行PCR扩增,反应体系为:10×PCR Buffer 5 μl,MgCl2 3 μl,dNTP Mix 5 μl,cDNA 7 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,Taq DNA聚合酶0.5 μl,总体积50 μl。反应条件如下:94? 5 min,94? 1 min?60? 1 min?72? 1 min,共30个循环,72? 10 min。 1.3结果判定 免疫组织化学染色结果判定:DAB显色后,显微镜下有棕黄色颗粒状物或棕黄色串珠形排列的物质为VIP阳性细胞或阳性神经纤维。组织的RT-PCR结果用OD值表示,正常胃组织与胃腺癌组织OD值与内参照β-actin OD值对比。 1.4统计学方法 结果用均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(x?s)表示,用SPSS 11.5统计软件进行独立样本t检验,P<0.05表示有显著性差异。 2 结果 2.1 免疫组织化学染色结果 2.1.1 组织免疫组化染色结果12例(12/30)胃腺癌组织出现VIP免疫反应阳性细胞,相对正常的胃组织中均未见VIP阳性细胞,经精确概率法检验显示,有显著性差异(P<0.01)。胃腺癌组织中无阳性神经纤维,而20例(20/20)相对正常的胃组织中均有阳性神经纤维存在,经精确概率法检验显示,有显著性差异(P<0.01)。 2.1.2胃腺癌细胞免疫组化染色结果胃腺癌SGC-7901细胞为VIP免疫反应阳性细胞,其免疫反应阳性颗粒大多在胞质,也有少许胞核染色。见图1。 图1 免疫组化染色显示胃癌细胞系SGC-7901 VIP阳性 2.2 RT-PCR反应结果 2.2.1 组织RT-PCR反应结果采用RT-PCR法从正常胃组织和胃腺癌组织总RNA中扩增出 VIP目的基因,产物长度约为390 bp(图2)。通过凝胶图像扫描仪对DNA电泳条带做光密度分析,与内参照比较,VIP在胃腺癌组织中OD值大于正常胃组织OD值,有显著性差异(P<0.05)。见表1。 2.2.2腺癌细胞RT-PCR反应结果腺癌细胞总RNA中也能扩增出VIP目的基因。 3 讨论 许多胃肠激素对肿瘤的增殖、转移有重要的影响,而且一些肿瘤能分泌胃肠激素,对自身的生物学特性有着重要的影响。胃腺癌组织中也发现有内分泌能力的肿瘤细胞。Tzaneva[2]对56例胃腺癌组织进行免疫组化染色发现,30.4%的胃腺癌中具有内分泌细胞,但这些细胞是否分泌VIP未进行研究。于庆生等[3]为了探讨健脾通里中药芪黄煎剂对胃癌手术后VIP的调节,将30例欲行胃癌手术的患者随机分为研究组和对照组,分别观察两组VIP的变化,结果显示胃癌患者VIP术前高表达,术后1 d高于正常水平,术后7 d基本恢复正常,与对照组相比,术后应用中药芪黄煎剂能有效调节术后VIP的变化。Qvigstad等[4]通过内分泌细胞的标志抗原嗜铬粒素的免疫组化染色发现,17%~75%的胃腺癌组织含有内分泌细胞。本实验为阐明VIP在胃腺癌中的作用,用免疫组化方法观察胃腺癌组织和细胞中是否存在VIP蛋白,是否存在分泌VIP的肿瘤细胞。用RT-PCR方法观察胃腺癌组织和细胞中mRNA的表达。 笔者在以前的研究中发现,胃溃疡组织中有VIP阳性细胞存在,并且其mRNA的表达明显高于正常胃组织[5]。胃腺癌组织免疫组织化学染色结果显示,胃腺癌组织有VIP免疫阳性细胞,而正常对照组无免疫阳性细胞,有显著性差异,与李国华等[6]的研究结果相符。陈晖等[7]通过免疫组化方法,检测30例正常胃窦黏膜、30例不典型增生胃黏膜和74例胃腺癌组织中VIP蛋白的表达,以及胃腺癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27中VIP蛋白的表达,结果显示,48.6%的胃腺癌组织中发现VIP阳性细胞,13.3%的不典型增生及10.0%的正常胃窦黏膜存在VIP阳性细胞,胃腺癌细胞株VIP蛋白呈高水平表达。对阳性神经纤维的观察发现,正常胃黏膜间质中可见VIP 阳性神经纤维,而胃腺癌组织中未见阳性神经纤维。Sitohy等[8]发现,用化学药物诱导的大鼠结肠癌中,其病变组织中的VIP免疫阳性的神经纤维数量改变,推测局部神经的异常也可能参与了肿瘤的病变过程。 李国华等[9]采用RT-PCR检测30例功能性消化不良患者和15例正常对照组胃窦黏膜VIP mRNA的表达,结果显示,运动障碍性消化不良患者胃窦黏膜VIP mRNA表达量显著增多,胃窦黏膜VIP mRNA的表达改变可能参与了运动障碍性消化不良的发病。李国华等[10]还发现,肠型胃腺癌组织VIP mRNA表达明显高于不典型增生胃黏膜,VIP可能在肠型胃腺癌的发生及发展中起重要作用。VIP mRNA在胃腺癌组织中表达上调,而VIPR mRNA表达下调,胃腺癌组织中存在分泌VIP的内分泌细胞[11]。本结果显示,在胃腺癌组织中VIP的OD值大于正常胃组织OD值,有显著性差异,说明胃腺癌组织中VIP mRNA很可能来源于肿瘤细胞。而通过对胃腺癌细胞株中VIP mRNA的检测结果进一步证实了VIP mRNA来源于胃腺癌细胞。胃腺癌细胞不仅表达VIP mRNA,而且是VIP免疫阳性细胞,表明SGC-7901细胞具有VIP的自分泌调节作用[12]。 总之,胃腺癌组织及细胞中VIP蛋白和mRNA的改变,表明VIP在胃腺癌的发生和发展中起着重要的作用。 [参考文献] [1]Nagakawa O, Murata J, Junicho A, et al. 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