禽脑脊髓炎病毒内蒙株分子致病机理的研究

禽脑脊髓炎病毒内蒙株分子致病机理的研究 1 2 1 1 1 1 3 马学恩, 哈斯阿古拉, 赵振华, 徐晓静, 张 键, 顾玉芳, 赵心力( )1. 内蒙古农业大学, 呼和浩特 010018; 2. 内蒙古大学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中心; 3. 内蒙古自治区兽医站 ( ) 文章编号: 100725038 1999320062203 中图分类号: S852. 3; S858. 31; S855. 3 文献标识码: A () 1. 1. 4 仪器 扩增仪 公司, 高速冷冻 PCR P E : 本文应用分子克隆技术获得了鸡摘 要 ( ) 离心机和紫外分光光度计 日立公司, 紫外透视 ( ) 白细胞介素 121片段, 并对其 ΒIL ΒcDN A ()仪 北京六一仪器厂。 进行了序列分析, 与人及小鼠 21基因IL Β 1. 2 方法 核酸序列同源性分别为 45% 和 30% 。并应 1. 2. 1 分离 鸡 21 诱生和细胞总 提取 IL RN A 用核酸原位杂交、斑点杂交技术检测了正 (培养鸡外周血单个核细胞, 加入诱生剂 L P S, 终 常 和 禽 脑 脊 髓 炎 病 毒 内 蒙 株 2A EV 浓度为 15, 20 ?, 5% 悬浮 ƒ, 24 , 37 ΛgmL h CO 2 ) N H 937 感染鸡脑组织中 IL 21Β 及其受体培养, 4 ?离心及收集细胞, 用异硫氰酸胍一步法 ( ) 21 产生细胞的分布, 试图进一步从 IL R 提取诱生细胞总 。RN A 分子水平阐明禽脑脊髓炎的某些发病机理。 1. 2. 2 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 根据文献报道的 8 种哺乳动 关键词: 禽脑脊髓炎; 21 , 分子克隆; 原 IL Β物 21, 以计算机辅助, 人工设 核酸序列保守区IL Β 计合成了一对引物: 位杂交 禽脑脊髓炎是严重影响种鸡和幼禽生产的 一种呈世界性分布的传染病。在获得了该病毒内 () 5′2端 引 物: 5′A A GA A T CC T GT GGC2 蒙株并对其致病机理进行了系统研究的基础上, ( ) 3′2端引物: 5′GC T 2 ′引物 ; 3IC T T GGG 我们利用分子生物学方法克隆了鸡 21IL Β cDN A 片段, 制备探针检测正常和感染鸡脑组织中 2IL ()() ′引物 。 3?GA T GTA CCA GT T A GGG 1. 2. 3 同位素标记的寡核苷酸探针合成 用 [ 2121 产生细胞的分布, 以期阐明本病中和 ΧΒIL R 32 ( ) 21及其受体的消长规律。ƒ制备 213′端引物的标 ]300IL ΒP A T P Λc imm o lIL Β 记探针。同时根据国外已发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的鸡 21 序列自 IL R 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法32 行合成标记探针用以检测 21 产生细胞:P IL R 1. 1 材料 5′CA GCA A A GGA T GGCA GGA GC T CC GA TA 3′。CCA A A GCA CA A TA T C 实验用健康母鸡由本校动 动物和种毒 1. 1. 1 1. 2. 4 用 斑 点 杂 交 法 检 测 正 常 鸡 和 2A EV 物园提供, 种毒 2由本课题组保存。 937 A EV N H 感染鸡 脑 和 脾 细 胞 中 产 生 21 937 N H IL Βm RN A1. 1. 2 工程菌和载体质粒 大肠杆菌 JM 109 和 甲醛 用 2酚法提取细胞 经 70 ƒ, SD SRN A mL L质粒 pU C 19 由内蒙古大学生物工程中心保存。 1. 1. 3 其他试剂 反转录试剂盒、AM V T 4DN A 10×SSC 于 100 ?处理 5 m in , 点样于处理好 和 连 接 酶、核 苷 酸 激 酶 等 购 自 公 司, T 4 P rom ega 的硝酸纤维素膜上。 室温晾干, 80 ?烘烤 2 , 按 h 32( ) 试剂盒、[ 购自华 2]300 ƒPCR ΧP A T P Λc imm o l常规方法进行斑点杂交, 显影与定影。 美工程公司, 限制性内切酶、淋巴细胞分离液、细 ()( 1. 2. 5 菌脂多糖 、32223用原位杂交法检测正常 鸡 与 感 染 A EV L P SA m inop rop y le tho xysilane 鸡脑组织中产生 IL 21Β及 IL 21 R 细胞的分布 )、培养基购自 公司, 感 1640 A P T E SR PM I S igm a ( ) 正常鸡与感染 鸡脑组织冰冻切片 5 分 A EV Λm 光乳胶购自北京原子能物理研究所。 () 别展于 业 经 处 理 处 理的 载 玻 片 上, 用A P T E S 两 种 核 酸 探 针 杂 交 后 经 充 分 洗 涤, 涂 布 感 光 乳收稿日期: 1999207221 胶, 常规曝光、显影、定影、光镜观察。 ( )基金项目: 国家自然科学基金资助课题 39560064 () 1. 2. 6 用逆转录2多聚酶链式反 2合成 1143 株、2937 株 感 染 脾 组 织 作 4 倍 稀 R T PCR N H RN A () 鸡 21取提纯 含 2. 6 9. 5 IL ΒcDN A RN A ΛL Λg32释, 脑组织 作 8 倍稀释, 标记探针 斑 点 RN A P 经 100 ?变性 5 , 冰浴 5 , 建立 50 m in m in ΛL PCR 杂交可检出阳性结果。 作为对照的脾、脑呈弱阳 ( 扩增体系 95 ?变性 40 , 50 ?退火 605 ,secsec 性, 这说明健康未感染 鸡的脾和脑组织中 A EV ) 72 ?延伸 60 , 反应 30 个循环。取 10 secΛL PCR也能产生一定量的 21。IL 产物进行 10 琼脂糖凝胶电泳观察结果。ƒgL 2. 3 原位杂交检测结果 1. 2. 7 21克隆及鉴定 2产物IL Β cDN A R T PCR 32用标记 的 鸡 213′端 引 物 探 针 和 自 制 P IL Β () 即 21片 段经 酶 处 理, 与 经IL Β cDN A K lenow 21探针, 经杂交、显影、定影后用光镜进行 IL ΒR 酶切的质粒 构成连接反应体系。制 检查, 在部分染病脑组织切片中, 神经胶质细胞 19 S m a I pU C 胞浆内有微细银染黑色颗粒, 但多不甚清晰。 表 备感受态细胞 取 200 加入 10. 109, , ECo li JM ΛL 明在目前试验条件下中枢神经系统内产生 21IL Β ΛL 重组质粒 DN A , 混匀冰浴 3 m in , 42 ?热冲击的 和产生 21的 量低, 拟用原位RN A IL ΒR RN A 90 , 冰浴冷淬 2 , 加 1 液体培养基 secsecmL L B —后再做原位杂交检测。PCR 复壮, 37 ?, 1 。取 0. 2 培养物铺于含h rmL AM P 100 ΛgmL 、X 2ga l、IP T G 的 L B 琼 脂 平 板 上, 37ƒ 2. 4 2结果 R T PCR ?倒置培养过夜。次日, 用 法筛选重组子,K ie se r 21 、 进行反转录和 扩增用引物I?IL ΒPCR 电泳观察结果; 再对滞后条带进行 扩增及用 PCR 后, 扩增产物进行 20 gL 琼脂糖凝胶电泳, EB 染 ƒ限制酶 和 双酶切, 电泳观察。B am H I E coR I 分 子 量 比 较, 色, 紫 外 灯 下 观 察, 与 标 准 DN A 1. 2. 8 21片段的序列分析 在 培 IL Β cDN A L B PCR 扩增片段分子量为 200, 300 bp 之间, 且该 养 液 内 扩 增 转 化 菌, 采 用 碱 裂 解 法 提 取 质 粒, 片段经多次 扩增均较稳定。PCR 沉淀纯化, 用荧光标记法自动序列分析仪进 P E G 2. 5 重组质粒的鉴定及序列分析行序列测定。 重组质粒转化入宿主菌 培养 . 109, ECo li JM 2 结果 后可产生蓝色和白色菌落, 挑取白色菌落扩大培 2. 1 外周血单个核细胞总 的提取RN A 养, 并以蓝菌落作为对照, 经 法快速提取 K ie se r 提取的总 之比为 1. 8,260ƒ280 RN A OD OD 质粒, 10 琼脂糖凝胶电泳, 染色, 观察, 发ƒgL EB ) ( 2. 0, 经 12 琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭ƒgL EB 现有滞后的条带, 提示此滞后质粒可能含有目的 染色, 紫外灯下观察, 28、18带清晰可见,SS RN A 片段。 将可疑阳性重组质粒作为模板, 利用引物 表、引物 进行 扩增, 12 琼脂糖凝胶电 I ƒ?PCR gL 明提取的 无降解, 无 及其它杂质污染。RN A DN A 泳, 染色, 观察, 均得到一条符合目的基因大 EB 小的特异性条带, 长约 270 。 再用 和 bpB am H I 2. 2 斑点杂交检测结果 双酶切, 经 15 琼脂糖凝胶电泳, 染色 ƒE coR I gL 将含量为 2. 5, 1. 25, 0. 625, 0. 3125, 156, 0.观察, 见重组质粒经双酶切后可得到一条 270 bp ( ) 078, 0. 039, 0. 0195 的提纯染病组织 脑、脾Λg 的片段, 与原设计相符, 证明此插入片段即为鸡 点在硝酸纤维素膜上, 经杂交及显影、定影 RN A 21片段, 经 1998 年 2 月和 12 月两次序 IL Β cDN A 后, 脾脏 0. 625 的样品, 脑 0. 3125 的样品 Λg Λg 列测定, 结果完全一致。此序列与人及小鼠 21IL Β 出 现 黑 色 斑 点, 表 明 213′端 引 物 与 鸡 21IL Β IL Β 基因同源性分别为 45% 和 30% 。 具 有 互 补 性。的 株、m RN A A EV V an R o ck e l ISm a ? CCC A A G A T T CC T GT G GCC T T G GGT GT G A GC T GC T T G T T C A A A T C T T CA GT C T GA T GA T C T TA A GC T CA C A CA GCA T C T A GG T GA GCA GGT A CC T CC T T T C T G C T C CA G C T T CCC GC T CA A A T C A A G GC T A A T GCA A A G C T G CA T C GT GT G GC T C GG GGC T GT GT C CA G GT G A A G T C T GA A TA C C T C CCA CA C T GG A GG CC T C GC A GC C T C GGA A GA A T G T T T T T C C T T T C T GGT CC T C TA GTA GTA CCC TA G A T G CCC A A C T GG TA C A T C A GC GGG 根据国际上已发表的鸡 21序列也合成了特 IL R 3 讨论与小结 32异性的标记探针。前者用于斑点杂交检测收到 P 3. 1 本研究为开展鸡 21 全序列的研究奠定 IL 较好的效果; 两种探针用于切片的原位杂交效果 了扎实的试验基础: 细胞因子的研究是当前国际 免疫学界和免疫病理学界的一个研究热点。细胞 尚 不理想。 本结果初步表明鸡中枢神经系统内 21 和 21拷贝数较低, 不易以常规原 因子指活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的 IL IL R m RN A 位杂交法检出。现在我们已建立起切片原位 PCR 一类具有非特异性调节免疫应答和介导炎症反 方法, 待细胞内被检目的基因大量扩增之后, 再 应的除免疫球蛋白和补体以外的可溶性小分子 用原位杂交法检测将会收到良好的效果。 蛋白质。 21 具有多种功能, 它在排除外来微生 IL 物感染、免疫调节、抑制肿瘤细胞生长及调节机 3. 3 鸡 21 是在抗感染、调节免疫功能、调节 IL 体内环境平衡中均起到十分重要的作用。迄今为 炎症、抗肿瘤以及神经免疫网络联系方面起重要 止尚未见鸡 21 全序列的 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。 本项研究对鸡 IL 作用的关键性细胞因子之一。它可以作为免疫佐 21 的 诱 生, 分 离, 引 物 设 计, 2条 IL RN A R T PCR 剂, 特别是免疫增强剂, 在禽病防制中发挥作用。 件, 鸡 21 片段测序等工作都积累了较 IL Β cDN A 可以用 等诱生外周血单个核细胞表达 21, L P S IL 丰富的经验和试验手段, 已经为鸡 21 基因文库 IL 也可以把鸡 21 基因插入原核细胞质粒内以求 IL 的构建和全序列测定奠定了坚实的基础。 高效表达。用低成本制备 21 作为免疫佐剂来增 IL 强禽传染性疫病的免疫效果, 将是 21 潜在的巨 IL 3. 2 本项研究结果表明, 我们自行设计合成的 大应用价值。 鸡 213′端引物探针具有一定的特异性, 同时IL Β 高钠所致肉用雏鸡肺动脉高压模型的心电图学研究 孙卫东, 王小龙, 张克春, 李锦春 ( )南京农业大学动物医学院, 南京 210095 ( ) 中图分类号 S852. 33; S856. 5 文献标识码: A 文章编号: 100725038 19990320064205 (() 摘要: 本 试 验 用 心 电 描 记 法 对 三 组 共ƒ和 ƒƒ呈强正相关 RV TV RV TV BW R ) = + 0. 723 到+ 0. 728; ?对照组、试验I285 羽健康 A A 肉鸡从 8 日龄开始分别用 含氯化钠 0. 0% , 0. 15% 、0. 30% 的饮水所 组、试 验 ? 组 分 别 有 0. 0% , 6. 25% , 28. 75% 鸡发展成临床型腹水。因此心电图 ( 致 肉 用 雏 鸡 肺 动 脉 高 压 综 合 征 P u l2 上的这些特征性变化可作为 早期阶 PH S ) 进 , m o n a ry h yp e r ten sio n Syn d rom ePH S 段的一个准确、可靠的指标。 另外, 跟踪心 行了研究。 结果表明: ?试验组的右心室 电图显示最初的 和 波型在 的 R s rS PH S ( ) ( , 和 全 心 室 R igh t V en t r ic leRV T o ta l易感上差异显著, 波型可作为一项很有 R s ) () 希望的抗 的育种指标。, 的重量比 ƒ较对照 PH S V en t r ic leTV RV TV 组显著增高; ?回归分析表明 、导联?aV E 关键词: 肺动脉高压; 肉用雏鸡; 腹水; 氯化 () S 波波幅的变化与 RV TV 和 RV TV ƒƒƒ钠; 心电描记法 ( ( ) 的变化呈强负相关 BW bo dy w e igh t R ) = - 0. 798 到 - 0. 812 ; 平 均 组 合 向 量现在已有充分的实验证据证实肉鸡的肺动 () ,的变化与1, 2 M ean R e su ltan t vec to rM RV 脉高压最终会导致肉鸡腹水综合征。 右心作 为 肺 动 脉 压 的 承 受 中 心, 随 着 肺 动 脉 高 压 的 发 收稿日期: 1999205204 基金项目: 国家自然科学基金和江苏省“九五”农业科技 生, 势必出现相应的病理变化。 心电描记作为一 重点攻关资助项目