乳酸脱氢酶制备
原理:
乳酸脱氢酶(LDH)(EC1.1.1.27)存在于具糖无氧代谢途径的细胞中，为水溶性酶，催化如下反应:
+ + L(+)—乳酸+NAD? 丙酮酸 + NADH +H
乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。制备的方法为捣碎心肌组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最后结晶出乳酸脱氢酶。
?乳酸脱氢酶活力检测原理是在pH10.0的条件下，LDH催化NAD还原生成NADH。NADH在340nm有最大吸收，摩尔消光系数为6.2×310，NADH的分子量为663.44。
LDH活力单位定义为:25?、每分钟催化生成1微摩尔NADH的酶量为1个活力单位。用紫外分光光度计测定酶反应进程的OD的增340量，可求出制备样品中的LDH活力。
试剂:
(1)CaCl •6HO 22
(2)NaPO 34
(3)冰乙酸
(4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)
(5)0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)
(6)0.3饱和度的硫酸铵溶液(19.5g/100ml)
(7)丙酮
(8)硫酸铵粉末
(9)0.5mol/L DL-乳酸钠。
++(10)2mmol/L NAD溶液:称取133mg NAD，溶于5ml蒸馏水中，加入约0.15ml 1mol/L NaOH 调pH为6.0，定容10ml，冰箱贮存。 (11) 0.1mol/L pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
A液0.2mol/L甘氨酸溶液:称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。
B液0.2mol/L NaOH溶液:称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。 取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容200ml。 操作:
一、 磷酸钙胶制备
(1) 称取19.8g CaCl •6HO，溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释22
成1600ml。
(2) 称取22.8g NaPO•12HO溶于150ml蒸馏水中。 342
(3) 将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙
胶沉淀。
(4) 吸去上清液，4000r/min离心3min，收集胶体备用。 二、 LDH制备
1、 LDH水提取
(1) 取100g新鲜或短期冰冻保存的牛心，去除脂肪、血管，称重，
切成小块，低温下绞碎。
(2) 加入400ml冰冷的蒸馏水，冰浴中搅拌，提取20min。
(3) 4000r/min离心3min。吸出上清液，测量体积并记录。 (4) 取样测定LDH活力。
2、 磷酸钙胶吸附及洗脱
(5) 上清液中加入磷酸钙胶80g左右，置冰浴中搅拌15min。 (6) 将胶悬浮液转入离心管中，3000r/min离心3min，弃去上清液，
保留磷酸钙胶。
(7) 向磷酸钙胶沉淀中加入约0.8倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲
液，于冰浴中充分搅拌10分钟。
(8) 3000r/min离心3min，保留上清液。测量并记录体积，取样测
定LDH活力。
3、 盐析
(9) 将上清液置冰浴中冷却，搅拌下缓慢加入固体硫酸铵粉末，至
0.6饱和度(按39g/100ml比例加入)，冰浴中放置10min。 (10)4000r/min离心5min，弃去上清液
(11)向沉淀中加入20ml0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，使沉淀溶解，测量并记录体积，取样测定LDH活力。
4丙酮沉淀
(12)将溶液置冰浴中，缓慢加入0.6倍体积(要准确)-20?预冷的丙酮，边加边轻轻搅匀，放置10min。
(13)于4?4000r/min离心5min，弃去上清液。
(14)沉淀溶于适量蒸馏水，记录体积，测定LDH活力。 三、LDH活力测定
操作:
(1) 按下表在两只石英比色杯中分别加入以下试剂:
甘AA缓冲液 乳酸钠 NAD+ 蒸馏水 LDH制备液 空白 2.7ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml - 样品 2.7ml 0.1ml 0.1ml 0.09ml 0.01ml
(2) 从样品杯中加入LDH制备液混匀的瞬时开始记时，测定酶反
应30秒时的A值。
结果:
将各
步骤
新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤
测定的数据及计算结果填入下表并对制备工艺进行
评价
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。 样品 A吸收值 V(ml)总体积 U总活力 1. 水提取
2. 吸附
3. 盐析
4. 丙酮沉淀
3-36总活力(μmol/min)=A/6.2×10×3×10×60/30×10×V/0.01
浙公网安备 33021202002483