胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素受体的相互作用：...

胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素受体的相互作用：... 胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素受体的 相互作用:... 4J厂牛 第24卷第5期 l蚴2年9月 生物化学与生物物理 A0TABIO0111MTnetBIOPIIYBIOASIN10A 鼬/) V01.24,No.5 Bept.,19姻 胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素 受体的相互作用 —— 能与受体结合的最小B链片段 范剑华唐月华.,冯佑民 (中国科工吾磊花学研薨丽否手至家重点 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 ,~oooBa) 摘要 . &j;| 本文研究了用酶解及化学台成法所获得的一系列胰岛素B链片段 与红细胞胰岛素受体 的结台.B链,[B22~p]B链及片段B22~30在高浓度时能与胰岛素受体结台,其他片段则 不能.该结果支持了胰岛素的受体结合部位的中心可能是B23~25的论点.结合前文结果, 讨ie了片段分子的柔性,疏水性及B22Arg在它们与胰岛素受体相互作用时的重要性. 关键词胰岛素;胰岛素B链片段;胰岛素受体;受体结合部位 ?’?-_---., 蛳r税 前文[1,23根据对一系列B链a一端改变了的类似物以及若干胰岛素片段与胰岛素受体 结合能力的比较研究提出:Bl2Val,B16Tyr,B24Phe和B25Phe形成的疏水面可能是结 合部位的主要部分,其中Gly(B23)一Pho(B24)~Phe(B25)可能是结合部位的中心.胰岛 素与受体的结合方式与胰岛素由单体形成二体的方式类似.本文应用酶解和化学合成方 法制备了一系列胰岛素B链片段,比较了它们与胰岛素受体的结台能力,实验结果进一 步支持了上述胰岛素的受体结合部位的论点及胰岛素与受体结合方式的假设.并结合前 文1:1,23对胰岛素的受体结合部位的性质以及胰岛素与受体相互作用机制作了进一步讨 论. 材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.胰岛素B链片段的制备本文所用胰岛素B链片段如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1所示. 猪胰岛素B链按Paynovi~h等瑚方法制备.B链片段BIN由去B链o-端五肤 胰岛素(DPI)用P町nich等方法获得,其氨基酸组成如表2所示. BIll6和Bl7—3o=片段由胰岛素B链经胰凝乳蛋白酶水解后,分离纯化而得.即 取20mg磺酸化B链溶于2ml0.125mol/L硼酸缓冲液中于25.c保温,加1nag胰凝 乳蛋白酶(51U/mg)混匀,5分钟后加0.5mi冰醋酸终止反应.酶解液经RP08I~PLG 本文1990年月窖日收到.修改稿1991年I1月2r日牧到. .浙江省医学科学院药物所. 生物化学与生物物理泓春 Table1Fragments0finsulinB-e~dnuforexperiment 1.InsulinB_c]~ain 2.B一25 8.B1一l6 4.Bl_s0 5.B船I30 30 6.B28— B1 Bl Bl6 B17 7.【B船血p】B血inBl B四B30 B船一 Ba0 A印一 BS0 CB船) Table2Aminoaddcompo~tfons.flhefragmen~ o,?ohainofinsuHn Sampl鼬of1,5nmolw日rebydzoly~zedin5rNHO1foz24b.Tbe凹etica1zemdue nnmbeT8工丑g押eninparenthes~-Compositionnormalizedtot21eozetJcalOlycontent (CyB,ProandTrpWenotde怡zmin- 分离,收集各峰(图1)测得氨基酸组成(表2)确定Rt20分钟峰为 B17N30,Rt27分钟 为B1N16. [B2”2Asp】B链由多肽台成仪台成(崔大敷同志赠送),取纯化的[B船Asp]B链 20mg溶于2ml7mo1/L尿素0.1mol/LTris—H01(pH7.5)缓冲液中,加Na~SOs和 N~S40目各2Omg,30”C反应12小时,使磺酸化,经SephadexG一15去尿素和盐后冷冻 干燥,氨基酸组成如表2所示. 片段B22,30和B23~30分别由徐明华和曹秋平同志赠送. 2.I_胰岛素与人妻’细胞的制备(1)I-胰岛素的制备按顾等方法进行. (2)红细胞按Gambhir等方法制备.取静脉血,加抗凝剂,室温下离心(2000r/m. 5分钟).所得红细胞用冷生理盐水和缓冲液G(每升中含50mmol/LTris,50mmo]/ LHEPES,10mmol/LMgO12,3_0mmo]/LOaO12,3_0mmol/L葡萄糖,5Ommo]/L NaOl,5mmo]/LKO1和2mmo]/nEDTA,pH8.0)洗2次,用2倍体积含0.1茹牛 5期胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素受体的相互作用453 l4mm F培.1HPLCofdigestionproductsofinsulinB-chainwith t翠psi?0?MiorcoorhC8colum?withflowrateoflml/min an4monitoredat280Bin Elrltlor~condition:0rain,B:0%;30ml”n,B:60%(~olventA,5% ~onitrilein0.1%TFA;solventB.80%a~onitrilein O.1%TFA]. 血清白蛋白(B8A)的缓冲液G稀释至2.5N4x10.个红细胞/毫升(目视显徽镜计数红 细胞). 3.受体结合试验取红细胞悬浮藏0.2ml,不同浓度胰岛素或B链片段0.1ml. .I一胰岛素(约5N10万cpm)0.1ml,总体积为0.4ml.置于计数管中,4oc保温34 小时,其间振摇2次.然后向各管中加入O.5ml冷的含0.1%BSA的缓冲液G混匀后 再加入0.5ml冷的邻苯二甲酸二丁酯,离心(6000r/m)15分钟弃水层及大部分邻苯二 甲酸二丁酯,取红细胞部分用计数器计数.每个浓度做2个平行管,每一个样品重复3 至5次. 结果 图2为胰岛素,B链及其片段与人红细胞胰岛素受体的结合曲线,说 明除B链, [B~Asp]B链及片段B2flN30在高浓度时能竞争I_胰岛素与受体结合外,其他片段 无作用.在相同浓度(3.33~10,mol/L)T,胰岛素B链及其片段对i25I-胰岛素与其受 休结合的抑制能力如图8所示. 讨论 本文研究的B链片段中只有B22N30片段在高浓度时有明显的与受体的结合能力 454生物化学与生物物理24卷 Amo~tadded0g) F蟾.2Bindingofingu?nan矗l如ag— men~sB—oh~inh~nsu~nreoe~for onIntlma~0妇?tes ~ILTVOI,~nsulin;~LTV8If,B-chaln;~2rv@ ?’B?_30;?rIV,[~2Amp]B—曲ain; c耵wV’B2吕O;cuTveVI,B1_】6BIT- 3O.andBl_笥. Fig.8Percentdispl~ementI-in.din fromtheinsui~nzecep~ronhumanery[hroey- tesb,insulinB-ohainaitsfragme~atthe concenfrafionof3.33xl0一M column1.B-eeain;colum~2,B船.30;column3? [B02Arg]Bhain;colum~rB船一30;eoI~n5, B1-1~,BIF-~0andB1-$5. eh,olnand~;he.irre~pforbindingacridly Table3FragmenbofinsuhuB— FragmenfsofinsuHnB-chalal~ceptorbinding~ivi%y B--~hainpheVal…TyrLeuValCysGlyG]uArgGlypbsPheTFThrproLys 1口.-.16?18:19蜘虹船232士?B02728姻 B23一鼬 B船—26 B28_3O B船13O B17一eO B一16 BI-25 [B~2Asp] B~hain 有与受体结合能力的最小片段为B23,25(GlPhe—Phe). 以此为中心在其N_一或a一端增加氨基酸残基时,随着肽段的延长,与受体的结合能力有的 表现,有的消失.说观B23~25在溶液中有一定构象而且与其在完整胰岛素分子中的构 象类似.当在其两端延长氨基酸残基后,由于氨基酸残基的性质和增加的长度不同,对 B船,25的原有构象会发生改变,从而导致其与受体结合能力的变化.例如B23,25 (Gly-Phe—Phe一0Me)-~肤甲脂在同样条件下其与受体结合能力比B,23~25三肽高,而 B22~26(Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr)五肽却丧失了与受体的结合能力.施等用NMR 研究了这两个肽段的溶液构象,发现五赋中的芳香侧链比三赋甲脂中的运动性小.这不 仅说观]323~25在溶液中有一定构象,而且提示了胰岛索与受体结合时B24,B25的芳香 侧链可能发生比较大的运动. Nakagawa和Tager提出在完整胰岛素分子中B26~30为柔性部分,对胰岛素溶 液构象有比较大的影响.本文观察到B2”2~30在高浓度时具有观显的与受体结合能力, 而B1,25则丧失了与受体结合能力,说明虽然B26~30本身不能与受体结合,而它的 存在有利于维持结合部位的正确构象. B链和[B22Asp]B链在高浓度时都能抑制卜胰岛素与受体的结合,但在等摩尔 浓度下B链的抑制率比[B22Asp]B链高,在完整胰岛素分子中,B22Arg与A2iAsp形 成盐键,稳定了结合部位的疏水面.在B链中的B22Arg可能通过与其他残基形成盐 键或其他方式仍对维持结合部位的构象起作用.因此当它被Asp取代后,结合部位的正 确构象发生更大的变化. 胰岛素与受体的结合是疏水的相互作用,虽然Bl~16和B17~30片段中都包含 有部分结合部位,但它们都不能与受体结合,可能由于在它们的分子中存在有很强的亲水 性基团(一SS0a),使整个分子的亲水性增强,破坏了结合部位的构象,使之不能与受体结 合.本文用的B链和EBmA~p]B链虽然也是一SS0.型,但由于它们几乎包含有所有结合 部位残基而且是完整的B链,所以仍能部分维持结合部位的构象,表现出与受体的结合 能力. B22~26,B23~30,B2~30和B链四者对受体的结合能力是从无到有,到明显,到 更观显.溶液构象研究表明在B22~26五肽中B22Arg和B26Tyr的存在使得B24和 B26的芳香侧链运动性减小,改变了B23~25的原有构象,使之丧失与受休的结合能力. 柔性部分(B26,30)的存在虽然有利于与受体结合的正确构象的维持,但由于该柔性部 分是指完整胰岛素分子而言,而对维持结合部位最小片段(B23,25)的构象来说可能并 不需要.而对较大片段尤其是在B23N一端延长的片段有利,这可以从]323,3o,B22— 30和B链三者对受体的结合能力从弱到明显到更明显得到证明.同样,B22Arg的作用 也是指对完整胰岛素分子而言,而对结合部位最小片段,它的存在则要与影响构象的其他 因素综合考虑,可能有利于维持正确构象如对B22~30和B链,或改变正确构象使之丧 失与受体的结合能力如对B22~26.对于上述片段的溶液构象,尤其是对B23~30.B丑2一 456生物化学与生物物理24卷 30,BI7~30及B链的溶液构象尚有待进一步研究. [I】 兰州医学院薛晓冬基生参加部分工作 heinteractionsofinsulinanditsanalogswlthinsulinreceptor.cj魄擅l撕 口,1974,17t779. FengYou-~inet8】_.Studiesonthe]21echa~妇mofinsu]iaacOonVI.Theinteraction时insulin Tgme?怊withinsulinreoeptoy.1NSULIN~he.,m4stryandF耐如n如and 丑舒面日)脚,1980,455.~randenburg,D.&Wollnmr,A.(eds),WalterdeGruytez&a mp;Oo.r Be~Rn. Pa,D0vjcb,R.et31.,Oxida廿0?ofsulfuc~rylfor瑚日nfhesullnA-chainandB呻haln.肺.,.妇 .,1979,13,133. 中国科学院上海生物化学研究所胰岛素组:去B链羧端五肽胰岛素的结构研究I.箭备及性质生物化学与 生枷特理,1976,8J蛆. 顾嘉剥等:用1.3,士,6-圈氯一3一二苯甘腮固相氧化剂碘化标记胰岛素去B链羧端亢挠胰岛素.生物亿 学与生特特理,1986,18,28. @ambhir,?.?.et.,Insulinzadionscepto~a羽aoThumaneThrocytes一0j.Chum.,1977,23, 1950. ]~]undell,T.L.eta1..Insulin—likegrowthfactor:Amode1fOrtezt~rygu0抽 Ieaccountingfor immunoreactivityandzeceptorbinding.研?.?.c胡.&.USA,1978,75,180一 施点洛等:胰岛素~r2-96五昧稻B23龉三蓝醣j;较磁共撮——溶蝮构象比较.生靳化学与生柏|恂理? 1988,蛾459 Nakugawa~8.甘.甘ta】..~~oleinthe~henyla,lanineB5aidechainindirectingin~ullninteractionw ish itsrecept.J.B.Cm..1986,蚰1,7582. InsulinStructursResearchGroup(Peklng).Studies0nthinsulincrystalB虹u?工e:TbI meleculazat1.8直resolu??.柏~inica.1974,17,752. 5期胰岛素B链片段与人红细胞胰岛素受休的相互作用57 InteractionofFragmentsofInsulinBChainwith InsulinReceptoronHumanErythrocytes TheSmallestFragmentofInsulinBChainWhich CanBindwithInsulinReceptor FanJian-huatTangYue-huaandFengYou—rain at~tmaZ皿o;BoLabara~ory,2~hanghaiI~l,ituCe盯 跏删打Avadamia,.qirdoa,2o0o31) ABST玉LACT AseriesofinsulinB_chainfragmentswereobtnedbymeansofchemic synthesisandlimitedenzym~icdigestion.TheirroteptorbindingcapacitieswitJa theinsulinreceptoronhumanerythrocyteswrestudied.Athigherconcentra— tionstheB—chain,[B22Asp]B-chainand]323一’加 havedefinitespedfiebinding withthereceptorwhilesuchspecificbindingwasnotfoundintheotherfrag- merits.Theresultsareconsistentwiththehypothesispreviousl丫setfor七 hth B23,25妇thecenterofthereceptorbindlngsiteofjn日u1in. Consideredtogetherwithpreviousresults,theimportanceofflexibilityt hydrophobicpropertiesandB22Argofthefragmentswasdiscussedwhenthe fragmentsinteractwiththereceptor. KEYWORDS:Insulin;FragmentsofinsulinB-chain;Insulinreceptor; Receptorbindingsite