原位杂交技术及难点释疑

测成为可能。我们用普通荧光显微镜结合现代数码技术及 图像分析技术可以进行多重荧光标记及观察 ,取得了研究目 标所要求的结果。其优点如下 : (1) 操作简单。不需要酶组 化方法的脱水、复染等过程 ,而且荧光显色后可直接用水溶 性封片剂封片 ,立即观察和拍摄。酶组化用中性树脂封片 , 中性树脂是用二甲苯为溶剂的 ,对人体有害 ,不能封片后立 即观察和拍照。并且酶组化的某些显色剂如 DAB 是高致癌 性物质 ,荧光染料则对人体无害。(2) 灵敏度高。荧光染色 比酶组化染色灵敏。(3)价格便宜。传统上多重荧光染色标 记物需要激光共聚焦显微镜和多个激光光源才能完成拍摄 , 而这样的设备价格一般在 200 万元以上 ,如果配备多个荧光 通道则价格更昂贵 ,一般实验室难以承担。本实验使用普通 荧光显微镜加数码照相机 ,这使得多重荧光标记的观察、拍 摄和定量分析在普通的实验室条件下就可以完成。(4) 同时 可以进行同一个细胞内的多个目的蛋白的研究。传统的酶 组化和单荧光很难达到这个效果。 应用多重免疫荧光法时 ,必须谨慎选择荧光染料或荧光 标记抗体 ,正确搭配荧光染料是实验取得成功的关键。最好 所选择的几种荧光激发波长重叠越小越好 (距离越远越佳) 。 本实验所采用的几种荧光染料 : FITC 激发波长 492 nm ,发射 波长 520 nm ,绿色 ; CY3 激发波长 550 nm ,发射波长 570 nm , 红色 ;DAPI激发波长 353 nm ,发射波长 420 nm ,蓝色。这三 种荧光激发波长重叠比较小 ,所以是一组很好的染料搭配 (图 4) 。 另外 ,在对多重免疫荧光标记的细胞进行拍照时应注 意 ,在换通道时载物台上的玻片不能移位 ,放大的倍数也必 须一致且必须在相同焦距下拍摄 ,否则拍出的照片无法叠加 和分析 ,每次最好拍摄相差或微分干涉的明场图片 ,这样可 以证明所标记的蛋白在细胞的具体部位 ,而且避免杂质所产 生的荧光干扰。 (本文图 1～4 见图版 4) 参 　考 　文 　献 11 Yu ACH , Chan PH , Fishman RA1 Effects of aracdidonic acud on glutamate and aminobutyric acid uptake in primary cultures of rat cerebral cortical astrocytes and neurons1 J Neurochem ,1986 , 47 :1181～11891 21 薛庆善 , 郭畹华 1 大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培 养及其神经突起生长作用研究 1 神经解剖学杂志 , 1996 , 12 : 151～1551 31 Hsu SM , Raine L , Fanger H , et al1 Use of avidin2biotin2 peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques1 J Histochem Cytochem ,1981 , 29 : 577～5801 41 Wick MR , Riegal GP1 Monoclonal antibodies in diagnostic immunohistochemistry1 New York ,Marcel Dekker Inc1 1988 ,309 ～3181 (收稿日期 :2004203225) 图版说明 图 1 　星形胶质细胞中 GFAP和 VEGF 的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。A1VEGF 用免疫荧光 ABC 法检测 ,羊抗兔二抗用生物素标记 ,再用 SABC2CY3 复合物标记 ,呈红色 ;B1 细胞核用DAPI染色 ,呈蓝色 ;C1GFAP 用免疫荧光AB 法检测 ,兔抗羊二抗用 FITC标记 ,呈绿色。 图 2 　星形胶质细胞的细胞骨架。用 Tubulin 单克隆抗体免疫荧光 ABC法 CY3 标记 ,呈红色 ;细胞核用 DAPI染色 ,呈蓝色。 图 3 　星形胶质细胞中 GFAP 表达。用 GFAP抗体免疫荧光 ABC 法 CY3 标记 ,呈红色 ;细胞核用 DAPI染色 ,呈蓝色。 图 4 　几种荧光染料的激发波长和发射波长 (参考 Jackson 公司图) 11 组胚教研室 原位杂交技术及难点释疑曹 　阳 　黄巨恩1(广西医科大学口腔医学院 南宁 530021)　　RNA 原位杂交技术在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析、已成为最有效的分子病理学技术 , 用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的 mRNA 是较为常见的RNA 原位杂交。该探针方法简便、探针较短 , 组织穿透性好 , 有较高的灵敏度。在大多数的恶性肿瘤中存在 TERT2RNA , 所以采用 TERT2原位杂交检测方法 , 可以应用于众多的恶性肿瘤 , 我们用此方法对舌癌进行检测 , 经过反复的实践、改进、摸索出一套比较实用的方法 , 获得比较满意 的结果 , 现报道如下。1 　材料和方法本院病理科舌癌组织蜡块 ,6μm 连续切片 60μm 烤 015 h37 ℃过夜备用。TERT 原位杂交检测试剂盒 (产品编号MK1158)购自博士德牛物公司 ,包括 (1)胃蛋白酶 , (2) 预杂交液 , (3) TERT寡核苷酸探针杂交液 , (4) 封闭液 , (5) 生物素化鼠抗地高辛 , (6)生物素化过氧化物酶。按使用说明书程序进行 : (1) 石蜡切片脱蜡至水 ; (2) 3 % 832 解剖学研究 2004 年第 26 卷第 3 期　Anat Res ,2004 ,Vol 26 ,No13 H2O 2 min ,蒸馏水 2 次 ; (3) 暴露 mRNA 核酸片段 ,切片滴加 3 %柠檬酸新稀释的胃蛋白酶室温 25 min ,015 M PBS 洗 3 次 ×5 min ,蒸馏水 1 次 ; (4) 预杂交 ,滴预杂交液 20μl/ 片 ,37 ℃ ～40 ℃,2～4 h 吸取多余液体不洗 ; (5) 杂交 :20μl/ 片滴加切 片 ,用原位杂交专用盖玻片盖上 ,恒温箱 37 ℃～40 ℃过夜 ; (6)取掉盖玻片 ,30 ℃～37 ℃水温 2 % ×ssc 洗 5 min ×2 ,015 % ×ssc 15 min ×1 ,012 % ×ssc 15 min ×1。 (7)滴加封闭液 37 ℃30 min ,甩掉多余液体 ,不洗。 (8) 滴加生物素化鼠抗地高辛 37 ℃ 60 min 或室温 120 min ,015 mPBS 5 min ×4 次。 (9)滴力口 SABC 37 ℃20 min 或室温 30 min ,015 mPBS 5 min ×3 次。 (10) 滴加生物素化过氧化物酶 37 ℃ 20 min 或室温 30 min ,015 mPBS 5 min ×4 次。 (11) DAB 显色 1 ml 蒸馏水加显色剂 A、B、C各 1 滴 ,混匀 滴于切片上 20～30 min ,充分水洗。(12) 苏木素复染。(13) 脱水、透明、封片、即可。 2 　结 　果 舌癌细胞及癌旁组织中皆有细胞浆着色呈棕黄色 ,胞核 呈苏木素淡蓝色 ,切片着色清晰、背景适宜。 3 　讨 　论 原位杂交技术步骤多 ,操作技术要求高 ,但如果掌握关 键难点 ,可获得满意结果。 (1)玻片的处理 :玻片必须泡酸 24 h ,碱洗、水洗 8 h 以 上 ,蒸馏水煮 2 次 ,60 ℃烤干 ,然后 200 ℃烤 2～4 h ,这样才能 较彻底消除外源性酶的干扰 ,浸多聚赖氨酸约 60 ℃烤 30 min 备用 ,注意在此过程要使用干净手套 ,以防有外源性酶污染 , 避免用手指直接接触组织、器械、容器和溶液等。(2) 胃蛋白 酶的消化时间 3 %柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 ,其目的是暴 露以 mRNA 核酸片段 ,增加探针与靶核酸的结合率 ,提高阳 性信号。使用说明书给出的消化时间是 3～30 min 经反复多 次的试验 ,我们找出的消化时间是 6μm 切片要 25 min 效果 最好。(3)专用盖玻片的使用问题 ,滴加杂交液不能过多 ,也 不能太少 ,过多造成浪费 ,盖玻片会滑动 ,使杂交液蒸发 ,影 响杂交效果、过少放盖玻片时易影响气泡 ,组织切片不能全 部覆盖杂交液 ,杂交结果不理想。(4) 杂交温度应严格控制 在 37～40 ℃,高或低都可能影响结果 ,而杂交时间经笔者的 经验 ,控制在 18～20 h 为宜 ,而时间过长 ,反而会使杂交后发 生自动解链 ,其杂交信号反而减弱。(5) 关于显色时间 ,说明 书为 20～30 mim ,在实际操作中 ,显色 3 min 后在显微镜下观 察 ,着色适宜为佳 ,不必墨守成规。(6) 非特异性着色是一个 不易避免的问题 ,除了严格遵守操作程序外 ,还要尽量在整 个操作过程戴手套 ,以防外源性酶污染 ;洗涤过程 ,必须严格 完成洗涤时间及次数 ,保证洗涤干净 ,而月。在洗涤过程中 切片绝对不能干燥 ;探针浓度不宜过高 ;杂交温度不宜过低 : 显影时间不宜过长 ;另外可适当延长 SABC的时间 ,可减少非 特异性着色。 (收稿日期 :2003209215) 人体全身血管铸型标本的研制 程明亮 　袁耀华 　侯皓天 　赵建伟 　李桂军 (郑州市卫生学校解剖教研室 ,郑州 450005) 　　铸型标本中 ,血管铸型标本最具代表性 ,因为各血管分 支之间的组织已被腐蚀掉 ,不同方位均能识别主干及分 支[1 ] 。如心冠状动脉的分支 ,颅脑内外血管的分支 ,肝、胆、 胰、胃肠血管分支 ,关节周围的血管网 ,浅静脉吻合成的静脉 网 ,深静脉在动脉周围或某些脏器周围吻合成的静脉丛 ,以 及器官的毛细血管网均能清楚地表现出来。它对临床心血 管外科、颅脑外科、消化外科等的应用解剖学都具有非常重 要的临床指导意义。 目前为止 ,血管铸型的制作多局限于单个脏器、多个脏 器联合及肢体[2 ] ,只能观察单个器官的血管分布状况。而全 身血管铸型。是将全身血管全部显示出来 ,既能观察局部 , 又能体现整体 ,可从铸型分支的粗细、疏密程度对比观察各 个脏器分支和分布状态。 1 　技术原理 —铸型成型法 技术原理是铸型标本成型法 ,分两种 ,即 :溶剂挥发后凝 固成型法及化学成型法 ,此两种方法使用的填充剂各不相 同。 111 　溶剂挥发后凝固成型法 　填充剂的配方为 :15～25 g 过 氯乙烯 (塑料) ,100 ml 乙酸乙酯 (溶剂) ,3～5 ml 邻苯二甲酸 二丁酯 (增塑剂) ,油画颜料 (红蓝黄、绿色) 适量。将上述物 质均匀调剂 ,充分溶解后备用。 112 　化学反应成型法 　填充剂配方为 ,自凝牙托粉 50 g ;自 凝牙托水 50 ml ;邻苯二甲酸二丁酯 (增塑剂) 5～10 ml :油画 颜料 (红、蓝、黄、绿色) 适量。先将配方中的后 3 项混合均 匀 ,再配入第 1 项 ,充分搅拌后 ,立即灌注。 932解剖学研究 2004 年第 26 卷第 3 期　Anat Res ,2004 ,Vol 26 ,No13