实验七动物骨髓细胞染色体的制备与观察[实验目的]通过青蛙或小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。[实验原理]骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次是要能够清楚的观察染色体的形态。为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。制备优良的标本可获得满意的观察效果。利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。[实验用品]动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。2.试剂：﹪秋水仙素、l氯化钾(kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50ml、100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。[实验内容与方法]一、试剂配制﹪秋水仙素溶液：秋水仙素2mg，灭活生理盐水（蛙类﹪、哺乳类﹪的nacl）10ml溶解，避光保存。lkc1溶液：原液：kcl双蒸水100ml溶解。使用液：原液1份，双蒸馏水19份混合，3.吉姆萨(giemsa)染液：原液：吉姆萨染粉，甘油33ml，甲醇33ml，配制时先将giemsa粉置于研体中，加入少量甘油，研磨至无颗粒，再加入余下的甘油，拌匀后放入56℃温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀，滤纸过滤用棕色瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。使用液：原液1份，磷酸缓冲液9份稀释。使用液不宜长期保存，一般现配现用。磷酸缓冲液：该液可先配成甲液和乙液，然后混合使用。甲液：kh2po4蒸馏水100ml溶解。乙液：na2hpo4·2h20（或na2hpo4·12h20）加蒸馏水100ml溶解。使用液：甲液，乙液混合，该使用液也不易久放，一般也是现配现用。二、染色体制备各种动物骨髓细胞染色体的制备方法基本都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备的过程。1.取健康小鼠一只，按每10g体重由腹腔注入含量为%的秋水仙素（此步在实验前12～24小时完成，哺乳动物在实验前2～4小时完成）。将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。3.用剪刀、镊子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结，迅速用5ml注射器抽取l的kcl溶液，从一头插入骨髓腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，直至骨髓腔变白。此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用镊子或吸管取出。加低渗液至5ml或8ml刻度，放入37℃恒温水浴箱内低渗处理25分钟。4.低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3﹕1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。1～2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平，使两支管的重量相等，然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1500r/min离心5～8分钟。取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6～8ml，用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37℃水浴箱中固定15～20分钟。再取出离心管，配平后离心5～8分钟，转速同样为1500r/min。离心完毕，去掉上清液，再加入1ml左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。7.取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，再用口吹散滴液，置于酒精灯上微微火烤，最后放玻片架或玻片盒中晾干。8.将晾干的玻片放入吉姆萨应用液染色缸中，或将玻片平放于桌上，将染液滴在片上染色。染色10分钟后，用蒸馏水或自来水小心冲去染液，电吹风吹干后镜检。三、染色体观察将制好的玻片置于显微镜下，首先观察标本的制备效果，检验操作过程是否正确。一般来说，制得好的标本应是细胞多、颜色为紫红色。此时间期细胞由于低渗和固定处理，细胞膜和质已被去掉，镜下看到的仅为膨胀后呈圆形的细胞核。分裂期细胞染色体集中在一起，其外也无细胞膜包裹，染色体之间无重叠，易分辨，臂的长度适中。但最重要的是分裂相要多。分裂相的多少主要取决于秋水仙素的用量和时间。秋水仙素还影响染色体的形态，如用量过大，常使染色体过于缩短，不利于观察。青蛙体细胞的染色体数目(2n)为26条，性染色体机制为xx-xy，即雌性为xx，雄性为xy。染色体的形态随青蛙种类不同略有差异，主要表现为亚中着丝粒染色体的序号和数目不同，如黑斑蛙的亚中着丝粒染色体为3、7、8、11、12等5对染色体，金线蛙为3、7、11、12等4对染色体，虎纹蛙为3、6两对染色体。小白鼠的染色体数目（2n）为40条，但全部为端着丝粒染色体，大小区别不明显，较难分组编号。图6-1小鼠染色体核型大白鼠的染色体（2n）为42条，家兔的染色体（2n）是44条。观察染色体时，不需加盖玻片，镜下先用低倍镜调好焦距，找到无离散，无重叠，形态好，可记数的一个分裂相，然后转高倍镜或油镜观察、记数，观察完毕后也不需擦试玻片，这样的玻片可保存数月。表6-1几种动物染色体形态特征动物名称染色体数染色体类型x染色体形态y染色体形态青蛙26中央、亚中央着丝粒染色中央着丝粒染色中央着丝粒染色体体，介于6～7号体，介于8～9号小白鼠40全部为近端着丝粒染色体大小介于5～6号大小介于19～20号大白鼠42中央、亚中央近端着丝粒近端着丝粒染色近端着丝粒染色染色体体，介于4～5号体，介于18～19号家兔44中央、亚中央近端着丝粒亚中央着丝粒染色近端着丝粒染色染色体体，介于5～6号体，介于19～20号[注意事项]腹腔注射秋水仙素溶液时，注意不要使针头损伤动物内脏。制片所用离心管、吸管等勿必洗涤干净，否则细胞会滞留于管壁收集不到细胞导致实验失败。离心时，离心管一定要先平衡，然后在离心机中对应放置。使用药品时要注意药名标签，注意使用正确浓度。5.观察计数染色体数目时，观察的分裂相一般要在10个以上，这样计数才比较准确。[实验
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]绘图绘制一个你所观察到的动物骨髓细胞染色体分裂相。思考题简述青蛙骨髓细胞染色体的制备过程。制片过程中为什么要进行低渗处理低渗的时间长短对染色体制片效果有何影响在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素？
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