GB反式脂肪酸的检测标准

婴幼儿配方食品和乳粉反式脂肪酸的测定Milkpowderandformulafoodsforinfantandyoungchildren—Determinationoftransfattyacids（草案）GB/T中华人民共和国国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ICS前言本标准遵循GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则。本标准起草单位：国家乳制品质量监督检验中心本标准主要起草人：亢美娟本标准为首次发布。婴幼儿配方食品和乳粉反式脂肪酸的测定范围本标准规定了用气相色谱法测定反式脂肪酸的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中反式脂肪酸的测定。 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准；然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682－1992分析实验室用水规格和试验方法方法提要用有机溶剂提取样品中的脂肪。提取物在碱性条件下与甲醇反应生成脂肪酸甲酯，用配有氢火焰离子化检测器的毛细管气相色谱仪分离顺式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，外标法定量。试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。石油醚：沸程30-60℃乙醚。乙醇：体积分数为95%。正己烷。氨水：25-28%。氢氧化钾:优级纯。甲醇。3.8淀粉酶：活力单位:≥4000,根据活力单位大小调整用量。3.9无水硫酸钠。3.10氢氧化钾―甲醇溶液（4mol/L）：称取26.4g氢氧化钾，溶于约80mL无水甲醇中。冷却至室温，用甲醇定容至100mL，加入约5g无水硫酸钠（3.9），充分搅拌后过滤，保留滤液。3.11脂肪酸甲酯标准品：十八酸甲酯（C18：0）、反-9-十八碳烯酸甲酯（C18:19t）、顺-9-十八碳烯酸甲酯（C18:19c）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:29t,12t）、顺-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:29c,12c）。3.12刚果红溶液：称取1g刚果红溶解稀释至100mL。3.13反式脂肪酸甲酯标准贮备液：浓度分别为：10mg/mL。准确称取500mg，精确到0.1mg反-9-十八碳烯酸甲酯标准品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯标准品，分别用正己烷溶解并定容至50mL。放入冰箱在-22℃保存。3.14反式脂肪酸甲酯标准中间液：浓度分别为1mg/mL。分别吸取两种反式脂肪酸标准储备液（3.13）10mL入同一100mL容量瓶中并定容。现用现配。亦作为标准曲线最高点。3.15系列标准工作液：现用现配。分别吸取标准中间液0、1.0、4.0、8.0、10.0mL于10ml容量瓶中，用正己烷定容，此浓度即为0、0.1、0.4、0.8、1.0mg/mL的标准工作液。3.16脂肪酸甲酯标准混合溶液：将脂肪酸甲酯标准品（3.11），用正己烷配制成脂肪酸甲酯标准混合溶液，其中每种成分的浓度约为0.05mg/mL至0.5mg/mL。用于进行顺反脂肪酸甲酯分离程度的鉴定。4仪器与设备实验室常用仪器及：气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器。4.2色谱柱：HP-88[100m×0.25mm(内径)，0.2µm],或相当的毛细管柱。4.3旋转蒸发仪。4.4恒温水浴。4.5涡旋振荡器。4.6离心机4.7毛氏抽脂瓶：抽脂瓶应带有合适的优质软木塞或其他不影响溶剂使用的的瓶塞（如硅胶或聚四氟乙烯）。软木塞应先浸入乙醚中（3.5），后放入≥60℃的水中保持至少15min，然后在水中冷却。使用时从水中取出，不用时要一直浸泡在水中，浸泡用水每天更换一次。4.8毛氏抽脂瓶摇混器；可夹放毛氏抽脂瓶，摆动频率为100+10次/分钟。4.9脂肪收集瓶：平底烧瓶，与旋转蒸发仪配套。5操作步骤5.1样品处理5.1.1含淀粉的样品：准确称取1.5g样品放入毛氏抽脂瓶中，加入约0.1g淀粉酶和一小磁力搅拌棒，混合均匀后，加入8-10mL45℃的水，盖上瓶塞于置于55℃水浴中2小时，每隔十分钟摇混一次。检验淀粉是否水解完全：加入两滴约0.1mol/L的碘溶液，无蓝色出现，水解完全，否则将毛氏抽脂瓶重新置于水浴中，直至蓝色消失。冷却毛氏瓶。5.1.2不含淀粉的样品：准确称取1.0g样品放入毛氏抽脂瓶中，加入10mL45℃的水，将试样洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到样品完全散开，放入流动水中冷却。5.1.3脂肪的提取：向毛氏抽脂瓶中加入3mL氨水（3.5），混匀。置60℃水浴中15-20分钟。冷却至室温。加入10mL乙醇（3.3）和1滴刚果红溶液（3.12），混匀。加入25mL乙醚，塞上软木塞，放到毛氏抽脂瓶摇混器上震荡1分钟。再加入25mL石油醚（3.1），震荡1分钟，离心分层。倾出上清液于脂肪收集瓶中。这是第一次提取。在剩余样液中再加入5mL乙醇，25mL乙醚，25mL石油醚按上述操作步骤进行第二次提取。离心分层后倾出上清液与第一次的上清液合并。于旋转蒸发器上，60℃，通入氮气条件下旋转蒸发除去溶剂，保留脂肪。用正己烷（3.4）溶解并定容至10mL。5.1.4脂肪酸甲酯的制备：将上述脂肪用10mL正己烷溶解，取出3mL入10mL指形瓶中，加入0.3mL氢氧化钾-甲醇溶液（3.10）。盖紧瓶盖，涡旋振荡器上剧烈振摇2分钟。离心5分钟，取上清液进样。5.2测定5.2.1推荐性色谱条件进样口温度：250℃；载气（Ｎ2）。检测器温度：300℃；进样量：1µL。程序升温：升温速率（℃/min）目标温度（℃）保持时间（min）初始温度120010175105210552305测定5.2.2.1标准曲线的绘制在仪器最佳工作条件下，对标准工作液(3.15)分别进样，以峰面积（峰高）为纵坐标、标准工作液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。5.2.2.2样品测定将样品制备液注入气相色谱仪，反式脂肪酸甲酯峰位置见图1。测定峰面积,查标准曲线后分别对反-十八碳一烯酸和反-十八碳二烯酸定量，以两者总合计。分析结果的表述按公式（1）分别计算反十八碳一烯酸甲酯和反-十八碳二烯酸甲酯含量（分别计为X1和X2）:X=A×10×100/m………………………………………………………………(1)X—样品中反式脂肪酸含量，单位为（mg/100g）；A—被测液中反式脂肪酸的浓度，单位为(mg/mL)；m—样品质量，单位为克（g）。样品中反式脂肪酸的含量：F=（X1+X2）×0.96………………………………………………………………（2）F—样品中反式脂肪酸的含量（mg/100g）。7精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。7.1重复性重复性标准差为sr=3.8956+0.03238m，重复性限为：2.8×sr在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。7.2再现性再现性标准差为sR=0.06194m，再现性限为2.8×sR在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，如果差值超过再现性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。8附录A资料性附录反式脂肪酸标准品色谱图反式脂肪酸样品色谱图本标准最低检出限为方法提要用有机溶剂提取样品中的脂肪。提取物在碱性条件下与甲醇反应生成脂肪酸甲酯，用配有氢火焰离子化检测器的毛细管气相色谱仪分离顺式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，外标法定量。试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。石油醚：沸程30-60℃乙醚。乙醇：体积分数为95%。正己烷。氨水：25-28%。氢氧化钾:优级纯。甲醇。3.8淀粉酶：活力单位:≥4000,根据活力单位大小调整用量。3.9无水硫酸钠。3.10氢氧化钾―甲醇溶液（4mol/L）：称取26.4g氢氧化钾，溶于约80mL无水甲醇中。冷却至室温，用甲醇定容至100mL，加入约5g无水硫酸钠（3.9），充分搅拌后过滤，保留滤液。3.11脂肪酸甲酯标准品：十八酸甲酯（C18：0）、反-9-十八碳烯酸甲酯（C18:19t）、顺-9-十八碳烯酸甲酯（C18:19c）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:29t,12t）、顺-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:29c,12c）。3.12刚果红溶液：称取1g刚果红溶解稀释至100mL。3.13反式脂肪酸甲酯标准贮备液：浓度分别为：10mg/mL。准确称取500mg，精确到0.1mg反-9-十八碳烯酸甲酯标准品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯标准品，分别用正己烷溶解并定容至50mL。放入冰箱在-22℃保存。3.14反式脂肪酸甲酯标准中间液：浓度分别为1mg/mL。分别吸取两种反式脂肪酸标准储备液（3.13）10mL入同一100mL容量瓶中并定容。现用现配。亦作为标准曲线最高点。3.15系列标准工作液：现用现配。分别吸取标准中间液0、1.0、4.0、8.0、10.0mL于10ml容量瓶中，用正己烷定容，此浓度即为0、0.1、0.4、0.8、1.0mg/mL的标准工作液。3.16脂肪酸甲酯标准混合溶液：将脂肪酸甲酯标准品（3.11），用正己烷配制成脂肪酸甲酯标准混合溶液，其中每种成分的浓度约为0.05mg/mL至0.5mg/mL。用于进行顺反脂肪酸甲酯分离程度的鉴定。4仪器与设备实验室常用仪器及：气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器。4.2色谱柱：HP-88[100m×0.25mm(内径)，0.2µm],或相当的毛细管柱。4.3旋转蒸发仪。4.4恒温水浴。4.5涡旋振荡器。4.6离心机4.7毛氏抽脂瓶：抽脂瓶应带有合适的优质软木塞或其他不影响溶剂使用的的瓶塞（如硅胶或聚四氟乙烯）。软木塞应先浸入乙醚中（3.5），后放入≥60℃的水中保持至少15min，然后在水中冷却。使用时从水中取出，不用时要一直浸泡在水中，浸泡用水每天更换一次。4.8毛氏抽脂瓶摇混器；可夹放毛氏抽脂瓶，摆动频率为100+10次/分钟。4.9脂肪收集瓶：平底烧瓶，与旋转蒸发仪配套。5操作步骤5.1样品处理5.1.1含淀粉的样品：准确称取1.5g样品放入毛氏抽脂瓶中，加入约0.1g淀粉酶和一小磁力搅拌棒，混合均匀后，加入8-10mL45℃的水，盖上瓶塞于置于55℃水浴中2小时，每隔十分钟摇混一次。检验淀粉是否水解完全：加入两滴约0.1mol/L的碘溶液，无蓝色出现，水解完全，否则将毛氏抽脂瓶重新置于水浴中，直至蓝色消失。冷却毛氏瓶。5.1.2不含淀粉的样品：准确称取1.0g样品放入毛氏抽脂瓶中，加入10mL45℃的水，将试样洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到样品完全散开，放入流动水中冷却。5.1.3脂肪的提取：向毛氏抽脂瓶中加入3mL氨水（3.5），混匀。置60℃水浴中15-20分钟。冷却至室温。加入10mL乙醇（3.3）和1滴刚果红溶液（3.12），混匀。加入25mL乙醚，塞上软木塞，放到毛氏抽脂瓶摇混器上震荡1分钟。再加入25mL石油醚（3.1），震荡1分钟，离心分层。倾出上清液于脂肪收集瓶中。这是第一次提取。在剩余样液中再加入5mL乙醇，25mL乙醚，25mL石油醚按上述操作步骤进行第二次提取。离心分层后倾出上清液与第一次的上清液合并。于旋转蒸发器上，60℃，通入氮气条件下旋转蒸发除去溶剂，保留脂肪。用正己烷（3.4）溶解并定容至10mL。5.1.4脂肪酸甲酯的制备：将上述脂肪用10mL正己烷溶解，取出3mL入10mL指形瓶中，加入0.3mL氢氧化钾-甲醇溶液（3.10）。盖紧瓶盖，涡旋振荡器上剧烈振摇2分钟。离心5分钟，取上清液进样。5.2测定5.2.1推荐性色谱条件进样口温度：250℃；载气（Ｎ2）。检测器温度：300℃；进样量：1µL。程序升温：升温速率（℃/min）目标温度（℃）保持时间（min）初始温度120010175105210552305测定5.2.2.1标准曲线的绘制在仪器最佳工作条件下，对标准工作液(3.15)分别进样，以峰面积（峰高）为纵坐标、标准工作液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。5.2.2.2样品测定将样品制备液注入仪器中，测定峰面积（或峰高）,查标准曲线后分别对反-9-十八碳烯酸品和反-9，12-十八碳二烯酸定量，以两者总合计。分析结果的表述按公式（1）分别计算反-9-十八碳烯酸甲酯和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯含量（分别计为X1和X2）:X=A×10×100/m………………………………………………………………(1)X—样品中反式脂肪酸含量，单位为（mg/100g）；A—被测液中反式脂肪酸的浓度，单位为(mg/mL)；m—样品质量，单位为克（g）。样品中反式脂肪酸的含量：F=（X1+X2）×0.96…………………………………………………………（2）F—样品中反式脂肪酸的含量（mg/100g）。7精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。7.1重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。7.2再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，如果差值超过再现性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。8附录A资料性附录反式脂肪酸标准及样品色谱图T=28.30:反式油酸；t=28.79:油酸；t=29.78反式亚油酸；t=30.33:亚油酸图一、婴幼儿奶粉样品色谱图T=28.20:反式油酸；t=28.69:油酸；t=29.73反式亚油酸；t=30.77:亚油酸图二标准样品色谱图附录B资料性附录反式脂肪酸标准及样品十三及十九碳脂肪酸色谱图图三、十九碳脂肪酸本底标准色谱图图三、十九碳脂肪酸本底标准色谱图十三碳脂肪酸(t=15.061);十九碳脂肪酸(t=22.964)图五、样品中十三碳与十九碳脂肪酸本底色谱图《婴幼儿配方食品和乳粉反式脂肪酸的测定》编制说明引言反式脂肪酸(transfattyacids,TFA反式脂肪酸是不饱和脂肪酸的一种，反式脂肪酸的碳链上双键两侧的碳原子连接的氢原子在碳原子的两侧，碳链的空间结构为直线形。食品中的反式脂肪酸主要来源有：(1)反刍动物(牛、羊)脂肪和乳脂肪；(2)氢化食用油脂[1]中，如用大豆油、棉籽油、花生油等加氢而成的人造黄油、起酥油等；(3)油脂精炼脱臭过程中产生的部分反式脂肪酸。反式脂肪酸的危害：随着民生活水平的提高和社会的发展，食品安全问题越来越受到国家和社会上普遍的关注。近几年的科学研究表明,反式脂肪酸对人体造成危害,主要有：（1）导致心血管疾病和肥胖还可能加剧糖尿病和动脉硬化等疾病。（2）影响儿童发育：反式脂肪酸会影响中枢神经系统的发育，这种影响对于婴幼儿和正在快速发育中的儿童危害较大。（3）对类花生酸的生成具有强烈的干涉作用。类花生酸作为生物膜磷脂的基本构成成分对维持膜的功能起着重要作用。必要时类花生酸还可以离开磷脂转变成前列腺素等，发挥广泛的代谢调节功能。2003年，丹麦政府开始对食用油脂反式脂肪酸的含量制订了严格的标准成为世界上第一个对食品工业中反式脂肪酸设立法规进行限制的国家。同年，美国FDA公布的规章中指出：食品营养标签中必须标注产品的反式脂肪酸的含量。被认为是美国自建立食品营养标签制度以来的一次重大改动。与此同时，加拿大、巴西等国家和一些地区也通报了类似的新规定。反式脂肪酸在我国也引起了普遍关注。我中心2006年提出了开展“反式脂肪酸检测方法研究”课题，作为内部课题展开研究。并于2007年通过全国乳品标准化中心向国家标委会提出了制定该标准的 申请 关于撤销行政处分的申请关于工程延期监理费的申请报告关于减免管理费的申请关于减租申请书的范文关于解除警告处分的申请 。1、任务来源、起草单位、验证单位和主要起草人任务来源：起草单位：国家乳制品质量监督检验中心验证单位：国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江省农垦乳品检测中心,圣元食品营养有限公司,内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司：主要起草人：亢美娟魏雪冬夏行昊房玉国张丽红2、制定标准的必要性和意义2.1维护消费者健康的需要　随着民生活水平的提高和社会的发展，食品安全问题越来越受到国家和社会上普遍的关注。婴幼儿配方食品和乳粉是我国人民生活中需求量很大的食品。对婴幼儿来说，是赖以补充营养的重要食品，它的安全与否直接影响儿童的生长发育，如果存在涉及食品安全的问题，往往会带来终生的伤害。天然的乳脂肪中含有少量的反式脂肪酸。但是一些生产厂家为了降低生产成本，加入了非乳脂肪成分，例如氢化植物油，使得反式脂肪酸的含量大大增加。这对婴幼儿的生长发育十分不利。为了维护消费者健康和知情权，制定有效的检测方法标准是非常必要的。国家政府部门食品安全监管的需要本标准是有关食品安全的标准。食品安全问题是党和国家越来越重视的问题，是人们越来越关注的问题。是直接影响人体健康和生活质量的问题。为了规范食品安全生产、最大程度地保护广大消费者的利益，产品质量的监督必须有相应的技术标准支持，否则无法有效监管。由此可看出，制订此检测方法标准的重要性。2.3完善国家标准的需要反式脂肪酸是脂肪酸的一种有害成分。我国也陆续制定了检验方法标准。如中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《食品中反式脂肪酸的测定方法毛细管气相色谱法》；中华人民共和国国家标准《植物油和含植物油食品中反式脂肪酸的测定气相色谱法》。婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法，即GB/T5413-1997现有的检测方法标准中，尚无反式脂肪酸的检测方法标准。此标准的制定也是根据婴幼儿配方食品和乳粉的特点。因此，制定《婴幼儿配方食品和乳粉反式脂肪酸的检测》方法标准也是完善食品检测方法国家标准的需要。3、起草过程3.1前期工作2006年，国家乳品质量监督检验中心向所属黑龙江省乳品工业技术开发中心的国家质检总局提出开展“乳与乳制品中反式脂肪酸检测方法研究”的申请，并经专家组讨论通过。之后，展开研究。经过一年多的研究，技术路线基本确立，并通过专家鉴定。实验室内验证工作2007年，国标委立项后，开始按照国家标准制定的要求对方法进行完善，对适用范围、采用的标准、验证方法、准确性、精密度等方面进行了分析和确认。到2008年5月，国家乳品质量监督检验中心内部实验室内完成了脂肪提取、甲酯化、色谱方法的条件试验和优选工作，并对分析结果的计算公式、添加标准物质的回收试验、重复性验证等方面做了多次核实。3.3实验室间验证工作2008年7月，我们邀请了黑龙江省农垦乳品检测中心,圣元食品营养有限公司,内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司等单位进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度，并将方法整理成为征求 意见 文理分科指导河道管理范围浙江建筑工程概算定额教材专家评审意见党员教师互相批评意见 稿。4.制定标准的原则和依据。送审稿中的脂肪提取部分是采用国家标准GB/5413.6-1997婴幼儿配方食品和乳粉脂肪的测定。反式脂肪酸甲酯的制备参照采用ISO5509动植物脂肪和油－脂肪酸甲酯的制备中的“酯交换方法”。标准主要条款的说明5.1标准名称婴幼儿配方食品和乳粉反式脂肪酸的测定5.2范围本标准针对于婴幼儿配方食品和乳粉，适用于婴幼儿配方食品和乳粉中反式脂肪酸的测定。脂肪提取方法脂肪提取方法我们采用了国家标准GB/5009.6-2003《食品中脂肪的测定》中第二法（酸水解法）的脂肪提取方法和国家标准GB/5413.6-1997《婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法》婴幼儿配方食品和乳粉脂肪的测定的提取方法进行比较，发现GB/5009.6-2003中脂肪的提取方法不能彻底提取乳粉中的脂肪，检测结果偏低。对于谷物类食品，两种方法均能彻底提取脂肪。所以最终选择上述GB/5413.6-1997的方法提取脂肪。考虑到温度及氧化对反式脂肪酸的影响，将水解温度改为60℃，并在脂肪提取率上与在原方法温度下提取进行比较，结果证实在提取率上没有差别。并在原法的基础上，将最后的烘干步骤改为60℃水浴通入氮气的条件下旋转蒸发。5.4反式脂肪酸甲酯的制备反式脂肪酸甲酯的制备方法采用ISO5509动植物脂肪和油－脂肪酸甲酯的制备中的第5条“酯交换方法”（“ISO酯交换方法”），中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《食品中反式脂肪酸的测定方法毛细管气相色谱法》和中华人民共和国国家标准《植物油和含植物油食品中反式脂肪酸的测定气相色谱法》都是非等效采用此方法。我门也从原理上采用此方法.但在用量上做以调整,使之适合婴幼儿食品和乳制品中脂肪酸的甲酯化:分别配制2mol/L,3mol/L,4mol/L,5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液.样品提取脂肪后,用正己烷定容到10mL,分别吸取其中的3毫升,各加入上述各浓度的氢氧化钾-甲醇溶液0.3mL,做甲酯化率实验,并对不同的样品多次测试,以响应值达到最高点的且达到稳定来判定,最终选择4mol/L,并在样品中添加反式脂肪酸标准品做单步甲酯化率回收率实验,单步回收率达到98%以上,符合要求。5.5色谱条件5.5.1色谱柱的选择色谱分离是测定的关键.色谱柱是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。色谱柱的选择从类型和长度来考虑.根据待测组分的性质需选用极性色谱柱.一般情况，柱子的长度与分离效果成正比，柱子越长分离的效果越佳，，所以我们推荐采用100m的色谱柱.除了色谱柱的长度外，柱子的类型对分离效果也有一定的影响，我们选择了安杰伦生产的HP-88和DB-23两种毛细柱。两种色谱柱的性质全部属强极性，只是填料不同：前者填料为后者填料为（50%-氰丙基）-甲基聚硅氧烷。实验时我们采用HP-88和DB-23做了对比实验，发现在分离顺反脂肪酸甲酯上,DB-23分离效果没有HP-88好.所以,最终选择HP-88[100m×0.25mm(内径)，0.2µm]5.5.2色谱条件每一个根色谱柱可能都有自身最适合的色谱条件。起始升温低、分离时间长，分离效果比起始温度高、分离时间短较好。最终推荐的色谱条件为：我们采用高纯氮气作为载气。色谱条件色谱柱:HP-88(100m×0.25mm×0.20µm)；升温程序：升温速率（℃/min）目标温度（℃）保持时间（min）初始温度120010175105210552305载气：氦；流速：1.3ml/min；氢气流量：30ml/min；空气：300ml/min。5.5.3反式脂肪酸色谱定性定量我们经过大量的实验发现,正常的乳粉中含有少量的反式脂肪酸,以反十八碳一烯酸为主,主要是(反-11-十八碳烯酸),在婴幼儿配方粉中有的还含有少量反十八碳二烯酸.反十八碳三烯酸,在正常该类产品中很少含有,偶尔有含量也非常少,即使在非法掺假的产品中也是如此.非法掺入的反式脂肪酸,主要是反十八碳一烯酸和反十八碳二烯酸,以反十八碳一烯酸(反-9-十八碳烯酸)居多,所以我们日常检验,根据该类产品的特点,只检验反十八碳一烯酸和反十八碳二烯酸.反十八碳一烯酸有三个异构体,即分别是C18:111t;C18:19t;C18:16t.其中通常C18:16t含量很少,C18:19t是非乳反式脂肪.但在色谱定性定量中,该三种异构体即使是混合标准品,也很难达到理想的分离效果,样品分离难度更大,浓度差距不大时,色谱峰的顶部能够分开,差距大时通常融合为一个峰,单独定量难度很大,特别随着色谱柱柱效下降时更是如此,所以我们采用区域划分法对反式脂肪酸进行定性定量。也就是首先在能良好分离顺式反式脂肪酸甲酯的前提下,不刻意去分离各反式脂肪酸甲酯的异构体,也就是定总量,并采用峰面积定量.而且相同浓度的不同异构体响应值相同.经过标准物质的对照，可以看出虽然各种反式脂肪酸色谱峰的保留时间稍有区别，但是反式脂肪酸的总是比顺式脂肪酸出峰早。C18:1反式峰在C18:0和C18:1顺式峰之间，C18:2反式峰在C18:29t,12t和C18:2顺式峰之间。甲酯峰的识别参照采用ISO15304：2002《动植物脂肪和油－植物脂肪和油反式脂肪酸异构体含量的测定－气相色谱法》标准品色谱图样品色谱图5.6分析结果的计算常见的气相色谱分析方法有内标法和标准曲线法。我们最初考虑采用采用内标法，因为内标法有很多优点，特别是在样品前处理前加入内标物，可以部分补偿预测组分在样品前处理、进样量的变化、色谱条件的微小变化对检验结果的影响，应该优先采用。但我们实验过程中发现我们预先选择的几种内标物都在样品中发现了本底，虽然含量较低，但也对检验结果有所影响，我们经过讨论最终决定不采用内标法而是决定采用标准曲线法作为本标准的计算方法。5.7线性范围为了确定本标准适用的线性区间，设计实验测定方法线性范围。配制C18:19t标准系列浓度为0.05、0.10、0.40、0.80、1.00、1.20mg/mL的标准溶液。经验证符合比尔定律。标准系列浓度测定结果及线性回归方程及相关系数见下表。峰面积间回归方程与相关系数反式脂肪酸浓度0.050.10.40.81.01.2峰面积3246102438487061657316回归方程Y=6110.5x-5.1107相关系数ｒｒ＝0.99995.8最低检测限根据GB/T5009.1-2003色谱法公式计算检出限：最低响应值S检出限＝=bb式中：b－标准曲线回归方程中的斜率。S－仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。结果：确认检出限为：3mg/100g.5.9准确度为了确定本方法的准确度,根据GB/T5009.1-2003，在本单位的实验室做如下试验：分别选择六个奶粉和米粉样品，分别加入不同水平的反式脂肪酸(C18:1)标准品，同时测定样品和加标样品，比较添加量和实测值，计算回收率和相对偏差。表2四个水平的样品反式脂肪酸回收率测试结果样品号水平本底值（mg/100g）添加量（mg/100g）实测值（mg/100g）回收率（％）1水平1345.799.896.796.9水平2205.1192.693.9水平3302.3278.592.1水平4398.2368.592.52水平1330.199.195.696.5水平2204.293.492.5水平3302.8285.394.2水平4398.1374.194.03水平1328.599.393.093.7水平2202.4190.294.0水平3298.4270.390.6水平4397.1369.293.04水平1339.699.294.694.8水平2199.0182.991.9水平3302.6275.891.1水平4401.9372.692.75水平1340.9101.093.492.5水平2205.0186.390.9水平3298.6280.794.0水平4395.6381.296.46水平1335.7100.395.995.6水平2203.6185.391.0水平3303.2280.292.4水平4396.4372.193.96家实验室的添加回收平均数据添加水平添加量平均回收率199.895.02203.292.43301.392.54397.993.8总平均回收率%93.45.10精密度由我中心统一制备样品，同时发送到4个参加方法验证的实验室进行精密度测定。每个样品共测定8次，并计算相对偏差及CV%值。结果见表3。5.10.1方法的实验室内精密度国家乳制品质量监督检验中心实验室内精密度见下表重复次数水平1水平2水平31318.0852.3501.32312.3889.1532.03320.5879.6524.74328.6866.5518.95309.2886.7521.06313.9876.0517.57320.5865.4528.18325.1881.2509.8平均值318.51874.60519.16标准偏差6.545512.39089.9159相对标准偏差（CV％）2.05501.41671.9100黑龙江省农垦乳品检测中心重复次数水平1水平2水平31310.9875.8504.92311.1881.8507.93304.1855.8511.04309.7875.3504.35305.6882.9503.36302.6895.9517.87305.0873.7500.68311.7875.8507.9平均值307.61877.12507.21标准偏差3.660811.21885.3485相对标准偏差(CV％)1.19011.27901.0545.圣元食品营养有限公司重复次数水平1水平2水平31313.8841.8488.32301.3861.0503.93331.1852.3496.04312.5859.4493.55320.3846.7501.36329.4854.6489.37317.6856.2497.28325.1850.7495.9平均值318.89852.84495.68标准偏差9.84096.41945.3657相对标准偏差（CV％）3.08600.75271.0825内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司：重复次数水平1水平2水平31310.4839.1518.32304.1815.6524.13319.9826.7496.94315.8832.1503.75309.9809.9515.26305.8817.5498.27314.6835.4492.68307.2829.6511.7平均值310.96826.99507.59标准偏差5.42309.520311.3664相对标准偏差（CV％）1.74391.15122.2393结论：各验证单位的室内相对标准偏差（CV％）分别为样品中反式脂肪酸含量水平1时：1.1901％～3.0860％；样品中反式脂肪酸含量水平2时：0.7527％～1.4167％；样品中反式脂肪酸含量水平3时：1.0545％～2.2393％.5.10.2方法的实验室间精密度6家验证单位实验室间精密度如下表实验室水平1（mg/100g）水平2（mg/100g）水平3（mg/100g）1318.51874.60519.162307.61877.12507.123318.89852.84495.684310.96826.99507.59平均值313.993857.888507.410标准偏差5.607323.30479.5869相对标准偏差（CV/%）1.792.721.89结论：各验证单位的实验室间相对标准偏差（CV％）分别为样品中反式脂肪酸含量水平1时：1.79％；样品中反式脂肪酸含量水平2时：2.72％；样品中反式脂肪酸含量水平3时：1.89％.9参考文献[1]GB/T5413.3-1997婴幼儿配方食品和乳粉脂肪的测定[2]GB/T5009.6－2003食品中脂肪的测定[3]GBT6379.2-2004《测量方法与结果的准确度》附1：反式脂肪酸测定结果的重现性、复现性限的计算（依据GBT6379.2-2004《测量方法与结果的准确度第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》计算表1原始 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 ：反式脂肪酸测定结果（mg/100g）实验室i重复次数水平1水平2水平31（国家乳制品质量监督检验中心）1318.0852.3501.32312.3889.1532.03320.5879.6524.74328.6866.5518.95309.2886.7521.06313.9876.0517.57320.5865.4528.18325.1881.2509.82（完1310.9875.8504.92311.1881.8507.93304.1855.8511.04309.7875.3504.35305.6882.9503.36302.6895.9517.87305.0873.7500.68311.7875.8507.93（圣元食品营养有限公司）1313.8841.8488.32301.3861.0503.93331.1852.3496.04312.5859.4493.55320.3846.7501.36329.4854.6489.37317.6856.2497.28325.1850.7495.94（蒙牛1310.4839.1518.32304.1815.6524.13319.9826.7496.94315.8832.1503.75309.9809.9515.26305.8817.5498.27314.6835.4492.68307.2829.6511.7表2反式脂肪酸含量的单元平均值（mg/100g）实验室i水平j123yijnijyijnijyijnij1318.518874.608519.1682307.618877.128507.1283318.898852.848495.6884310.968826.998507.598表3反式脂肪酸含量的标准差实验室i水平j123sijnijsijnijsijnij16.5455812.390889.9159823.6608811.218885.3485833.086086.419485.3657845.423089.5203811.33648一致性和离群值的检查格拉布斯检验应用于标准差，分别对三个水平的四个实验室的标准差进行格拉布斯检验。结果表明没有离群值和歧离值。如表4表4对标准差的格拉布斯检验水平单个低值单个高值检验类型11.0001.1721格拉布斯检验统计量21.33610.968030.85291.0835判断是否歧离值1.4811.481格拉布斯检验临界值1.4961.496再将格拉布斯检验应用于单元平均值，如表5表5对单元平均值的格拉布斯检验水平单个低值单个高值检验类型11.13820.8734格拉布斯检验统计量21.32580.825331.22351.2256判断是否歧离值1.4811.481格拉布斯检验临界值1.4961.496这表明以上各单元均没有岐离值，离群值。所有结果参与后续计算。二、mj,srj和sRj的计算根据GB/T6379.2-2004中7.4.4和7.4.5中所定义的诸方差计算水平1：实验室数p=4，n=8T1=Σniyi=10047.76T2=Σni(y)2=3155676.0T3=Σni=32T4=Σni2=256T5=Σ(ni-1)st2=666.2415T5sr2=————=23.79434T3-pT2T3-T12T3(p-1)sL2=[————-sr2][————]=280.0027T3(p-1)T32-T4sR2=sL2+sr2=303.7971T1mj=——=313.992T3同理，分别计算水平2、3、的：mjsR2sr2列于表5表5反式脂肪酸的mjsrjsRj计算值水平jPjmjsrjsRj14313.9924.877917.429824857.88810.139570.554634507.4108.439829.8246精密度与m的关系根据表5，随着m值的加大显然标准差也在增加，所以可能建立他们之间的某种关系，其精密度可能依赖水平m的。根据GB/T6379.2-2004中7.5中所定义，按=1\*ROMANI:sr=bm拟合他们的关系式:Wj=1/(srj)2水平1：Wj=1/(srj)2=0.04203水平2：Wj=1/(srj)2=0.009727水平3：Wj=1/(srj)2=0.01404T1=ΣWj=0.065794T2=ΣWjm=28.6645T3=ΣWjm2=14916.8T4=ΣWjsrj=0.42212T5=ΣWjmsrj=209.1008则：b=T5/T3=0.01402重现性限为：=1\*ROMANI：sr=0.01402m=3.8956=0.03238Ⅱ：sr=1.8956+0.03238m同理 :水平1：Wj=1/(sRj)2=0.03292水平2：Wj=1/(sRj)2=0.0002009水平3：Wj=1/(sRj)2=0.001124T1=ΣWj=0.004617T2=ΣWjm=1.77634T3=ΣWjm2=761.8233T4=ΣWjsRj=0.105076T5=ΣWjmsRj=47.1871则：b=T5/T3=0.06194再现性限为：Ⅰ :SR=0.06194m=-10.4229=0.08624Ⅱ：sR=-10.4229+0.08624m按Ⅲ：拟合：Sr计算:=8.13571=2.34382=2.62058=7.17559=0.8830=-0.00349lgsr=0.8830-0.00349gmSR计算 :=8.13571=2.34382=4.56439=12.5112=1.5398=-0.000674LgsR=1.5398-0.000674gm经对上述三个关系式采用GBT6379.2-2004方法检查后，确定最适宜的关系式。即：重复性为：sr=3.8956+0.03238m再现性限为：SR=0.06194m9