绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用

绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用 绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌 的拮抗作用 绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和 尖孢镰刀菌的拮抗作用 高苇李宝聚孙军德石延霞金丹 摘要考察了从平菇栽培料上分离到的污染木霉(Trichodermaspp.)对黄瓜尖孢镰刀茵(Fusariumoxypo— rum)和黄瓜立枯丝核茵(Rhizoctoniasolani)的拮抗作用,并从中筛选出绿色木霉(Trichodermaviride)TH4对这两 种病原茵具有较强的抑制作用.通过显微镜观察证明TH4可以侵入到病原茵的 茵丝内,使病原茵的细胞壁变 薄,消解,最终导致茵丝断裂.通过对扣培养法与圆盘滤膜法证明了TH4的挥发 及非挥发代谢产物都会对病原 菌产生一定的抑制作用. 关键词绿色木霉立枯丝核茵尖孢镰刀菌 土传病害是一类重要的植物病害,主要以土壤 为传播媒介,从植物的根部侵染植株,最后引起植 株整株死亡,给生产上造成巨大的损失.对于土传 病害的防治,主要以杀菌谱广,见效快的化学药剂 防治为主,但由于病原菌极易对其产生抗药性,导 致施用化学农药的剂量不断增加,造成了农药残留 量的增大,土壤生物结构的破坏.因此,相对安 全的生物防治越来越引起人们的关注.木霉属 (Trichoderma)真菌属于半知菌亚门(Deuteromycoti. Ha)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomyce- tales)丛梗孢科(Moniliaceae),是一类在土壤中普遍 存在的真菌.20世纪30年代,Weindling发现木 素木霉(始norum)可以寄生于多种土传病原 菌,从此木霉即作为一种重要的生防因子在国内 外得到广泛研究.据统计,木霉至少对18个属29 种病原真菌在体外或体内表现出拮抗作用J,而且 国外已有商品化的木霉制剂问世.本试验测定了 从被木霉污染的平菇栽培料中分离到的6种绿色 高苇,女,硕士研究生,沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳市东 陵区120号,110161;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 l0oO8l 李宝聚(通讯作者,E—mail:libj@mail.caas.net.cn),石延霞,金丹,中 国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081 孙军德,沈阳农业大学土地与环境学院 收稿日期:2007—12—13;修回日期:2008—03—24 基金项目:”十一五”国家科技支撑计划(2006BAD07B02).公益性行 业(农业)科研专项(nyhyzx07—007),引进国际先进农业科学技 术计划[2006一G13(A)] 木霉对黄瓜立枯病菌和枯萎病菌的拮抗作用,以期 为黄瓜这两种常见土传病害的生物防治提供一定 的参考. l材料与方法 1.1供试菌种 病原菌黄瓜立枯丝核菌,黄瓜尖孢镰刀菌来自 中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综合防治课 题组,均从黄瓜根部分离得到. 1.2木霉菌株的分离鉴定 2006年9月从北京大兴平菇栽培地采集大量 受木霉污染的栽培料,放入4?冰箱中保存备用. 从受污染的培养料上挑取木霉孢子,在PDA培养 ?下培养2d,待长出菌落后立即纯化. 基上于26 将分离到的6种木霉在PDA培养基上培养2 d,还未看到孢子产生时,挑取菌丝丛制片,观察分 ;培养3—5d,菌落上可以看到明 生孢子梗的形态 显的绿色或深绿色孢子时,挑取分生孢子制片,观 察孢子的形态大小.根据Rifai等和Bissett 相继修订的木霉种群分类系统从形态学上对6株 木霉进行鉴定. 1.3木霉拮抗菌株的室内筛选 采用平板对峙培养法.在28?活化3d的黄 瓜立枯丝核菌,黄瓜尖孢镰刀菌和6种木霉的PDA 平板上,挑取直径4mm的菌块.将黄瓜立枯丝核 菌或黄瓜尖孢镰刀菌菌块分别放到新制成的PDA 平板的左侧,距平板边缘2am的位置上,再将木霉 一 9一 中国蔬菜CHINAVEGETABLES 菌块接种到平板右侧与病原菌对应的位置处.以 单独接种病原菌的平板作为对照.每处理3次重 复.在28?恒温培养箱中培养5d,每天记录病原 菌及木霉的生长状况,测量其菌落半径.计算平板 培养第5天时木霉对病原菌的抑制率. 抑制率(%)=[(对照菌落半径一与木霉对峙培养的 菌落半径)/x~照菌落半径]×100 对峙培养中竞争系数分级 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :I,木霉菌 丝占据平板100%;II,木霉菌丝占据平板2/3以 上;III,木霉菌丝占据平板1/3—2/3;IV,木霉菌丝 占据平板1/3以下;V,病原菌菌丝占据平板 100%.记录第5天病原菌和木霉菌落之间的 关系. 1.4木霉拮抗作用机制的观察 从对峙培养平板上病原菌与木霉菌丝交接处 挑取一定的菌丝,制片,在光学显微镜下观察木霉 和病原菌的生长情况. 1.5木霉挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用 采用对扣培养法测定.在直径90mm培养 皿的皿盖和皿底分别倒入一定量的培养基,皿盖的 培养基稍少些.凝固后,在皿盖中心接入直径4 mm的木霉TH4菌块,在皿底中心接入直径4mm 的病原菌菌块.放入28?恒温培养箱中,倒置培 养.以仅接种病原菌的培养皿为对照.每天观察 病原菌及木霉菌丝的生长状况,对扣培养5d后采 用十字交叉法测量病原菌的菌落直径,计算木霉 TH4挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率. 抑制率(%)=(对照病原菌的菌落直径一处理病原菌 的菌落直径)/x~照病原菌的菌落直径×100 1.6木霉非挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用 采用圆盘滤膜法测定”….在直径90mm培养 皿的皿底倒入一定量的培养基,然后在培养基上平 铺两层直径90mm的灭过菌的玻璃纸,将直径4 mm的木霉TH4菌块接种在玻璃纸上,以没有接种 木霉的平板为对照.28恒温培养3d,待木霉菌 丝快要长满时,将双层玻璃纸揭下.在平板的中央 接入直径4mm的病原菌菌块.每天观察病原菌的 生长情况,平板培养5d后采用十字交叉法测量病 原菌菌落直径,按1.5中的公式计算木霉TH4非挥 发性代谢产物对病原菌生长的抑制率. 2结果与分析 2.1木霉菌株的分离鉴定 从平菇的栽培料中分离得到TH1,TI-I2,TH3, 一 l0一 TH4,TH5,TH6木霉菌株.在显微形态上它们具有 一 定的共性:菌丝分枝较多,有横隔,菌丝壁光滑; 孢子梗环状排列,次级分枝单个或以2—3个为一 组,分枝常常弯曲或呈波状;瓶梗对生或轮生,基部 缢缩,中间膨大,顶端变窄,呈葫芦形;分生孢子圆 形或椭圆形,表面粗糙,大小为(2.0—3.2)m× (3.5—4.0)m.根据Rifai等和Bissett.对木 霉形态分类的研究鉴定,这6株木霉均为绿色 木霉. PDA平板培养上,木霉TH1,TH2,TH3,TH4, TH5,TH6的生长速度,产孢时间及孢子颜色存在一 定的差异.TH3,TH5的生长速度较快,达到2l mm?d,,而TH6生长速度最慢,仅为14mm? d,.在产孢时间上,TH5产孢最快,平板培养第3 天就可以看到一层绿色的孢子,TH2产孢较慢,第3 天开始产孢.TH3产生的孢子为深绿色,与其他5 株木霉孢子具有明显的不同.因此,结合显微形态 和菌落形态上的共性与区别,可以确定从平菇栽培 料上分离得到的木霉为绿色木霉,且属于不同的 小种. 2.2木霉对黄瓜立枯丝核菌和黄瓜尖孢镰刀菌的 拮抗作用 从对峙培养的结果中可以看出(表1),木霉 TH3,TH4,TH5菌丝的生长速率较快,Ft平均生长 速率接近或超过20mm,较病原菌具有明显的生长 优势.同时,对峙培养的病原菌菌丝的生长速率明 显低于单独接种的病原菌菌丝的生长速率,说明 TH3,TH4,TH5在生长过程中分泌出的代谢产物抑 表16种木霉对黄瓜立枯丝核茵及黄瓜尖孢镰刀茵 对峙培养结果 制了病原菌菌丝的生长.TH5与病原菌对峙培养 时,无论黄瓜尖孢镰刀菌还是黄瓜立枯丝核菌,其 菌丝生长速率都很低,说明TH5对病原菌的抗生 作用最强.在平板培养第5天时,TH2,TH4,TH5 能够完全寄生于黄瓜立枯丝核菌,将其覆盖,对病 原菌的抑制率达到100%;同样,TH4在平板培养 第5天时,也将黄瓜尖孢镰刀菌完全覆盖,对其抑 制率为100%.TH4与病原菌对峙培养时,不仅 本身生长速度快,而且还可分泌出病原菌抗生物, 对病原菌具有很好的抑制作用,是较好的生防 因子. 2.3木霉拮抗作用机制的观察 从图1,2中可以看出,木霉TH4能够侵入到黄 瓜尖孢镰刀菌和黄瓜立枯丝核菌菌丝内,并在体内 寄生.寄生在病原菌内的木霉会分泌一定的物质, 使病原菌菌丝的细胞壁局部变薄,消解,或细胞内 的内容物浓缩,释放,最终导致病原菌的细胞壁破 裂,菌丝断裂,病原菌消亡. 图1木霉TH4菌丝侵入黄瓜立枯丝核菌菌丝内, 使菌丝发生溶解 注:A一黄瓜立枯丝核菌;B一木霉TH4. 图2木霉TH4菌丝重寄生于黄瓜尖孢镰刀菌菌丝内. 茵丝内容物释放 注:A一黄瓜尖孢镰刀菌;B一木霉TH4;c一内容物释放. 发性代谢产物对黄瓜立枯丝核菌和黄 2.4木霉挥 瓜尖孢镰刀菌的抑制作用 对扣培养5d后,调查木霉TH4挥发性代谢产 物对黄瓜立枯丝核菌及黄瓜尖孢镰刀菌生长的影 响,从调查结果中可以看出(表2),TH4挥发性代 谢产物对两种病原菌均存在一定的抑制作用,抑制 率分别为28.64%和33.54%.证明TH4生长过 程中分泌出一些挥发性的代谢产物如乙醛,挥发性 抗生素等,抑制病原菌菌丝的生长. 表2木霉TH4挥发性代谢产物对黄瓜立枯丝核菌及 黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用 2.5木霉非挥发性代谢产物对黄瓜立枯丝核菌和 黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用 恒温培养5d后,测量病原菌的菌落直径,从测 量结果中可以看出(表3),木霉TH4生长过程中能 够产生非挥发性的代谢产物,对黄瓜立枯丝核菌及 黄瓜尖孢镰刀菌的生长产生一定的抑制作用,抑制 率分别为l6.21%和l9.29%. 表3木霉TH4非挥发性代谢产物对黄瓜立枯丝核菌及 黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用 3结论与讨论 在平菇栽培料上分离到了6种木霉,经鉴定均 为绿色木霉,体外拮抗试验证明了它们对黄瓜尖孢 镰刀菌和黄瓜立枯丝核菌菌丝的生长都有一定的 拮抗作用,且木霉TH4生长速度快,并能产生一定 的代谢产物抑制病原菌的生长,最终完全侵染病原 菌.因此TH4可以作为控制这两种病害的较好的 生防因子,通过显微镜观察到TH4可以侵入病原菌 菌丝内,并在其体内寄生,使病原菌的细胞壁变薄, 消解,导致菌丝断裂,病原菌消亡.利用对扣培养 法与圆盘滤膜法证明,TH4的挥发及非挥发代谢产 物都会对病原菌产生抑制作用,虽然TH4挥发性代 谢产物对两种病原菌的抑制率均高于非挥发性的 代谢产物,但对扣培养时病原菌对TH4的代谢产物 可能存在一定的诱导作用,使得其抑制率高于非挥 发性代谢产物对病原菌的抑制,所以对于非挥发性 代谢产物对病原菌生长的抑制作用还需要进一步 研究. 本试验通过离体培养,研究了6种绿色木霉对 两种主要的土传病害病原菌——黄瓜尖孢镰刀菌 一 11— …………,……………………………一 ?譬 和黄瓜立枯丝核菌的拮抗作用,并筛选到了较理想 的拮抗木霉菌株TH4,为进一步的田间应用奠定了 基础.而对于绿色木霉TH4生长过程中代谢产物 对病原菌的抑制作用及抑制机制,还需要进_步 探讨. 参考文献 [1]王玉梅,祁红英,郭建华.植物土传病害的微生物防治研究 进展[J].世界农业,1995(1):37—39. 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KeywordsTrichodermaviride,Fusariumoxyporum,Rhizoctoniasolani ? 会讯?蔬菜生产 ,质量与力口工标准T匕国际研讨会”通知 蔬菜生产,质量与加工标准化国际研讨会(Vegetables ProductionandQualityandProcessStandardizationinChina:a WorldwidePerspective)由国际园艺学会(ISHS),北京市科学 技术协会等共同主办,经国际园艺学会正式授权,由国家蔬 菜 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术研究中心与北京蔬菜学会承办. 会议时间:2008年10月14,17日 会议地点:北京 会议内容:蔬菜品种多样性(常规育种,生物技术);蔬 菜种植(栽培,植保);蔬菜采后加工;蔬菜质量检测;蔬菜营 养与健康;蔬菜供应链,市场与技术转化;食品安全;蔬菜产 业政策 参会人员:欢迎国内外从事蔬菜研究与生产的人员参加 本次研讨会 论文提交方式:论文摘要请用电子邮件附件形式(Word 文档)投至abstract2008@nercv.corn.摘要限500字以内,截 止日期2008年6月30日.会前将出版论文摘要集.录用 一 12一 的论文全文将在(,ActaHorticuhurae}上发表.论文撰写格式 参照国际园艺学会网站的相关指南(www.ishs.org/acta/ index.htm) 会议语言:英语 参会费用:2008年8月15日前注册缴费:1200元/人 2008年8月16日,10月14日注册缴费:1500元/人 研究生:750人 联系人:国家蔬菜工程技术研究中心 刘伟,电话:+861051503003 传真:+861088446286,E—mail:liuwei@nercv.com 何洪巨,电话:+861051503068 传真:+861088446286,E—mail:hehongju@flcrcv.com 郑淑芳,电话:+861051503052 传真:+861088446286,E—mail:zhengshufang@nercv.corn 详细信息请访问国际会议网站www.bvre.com.cn/ Vege2OOSBeijmg及国际园艺学会网站www.ishs.org/calendar