昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植

昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植 第18卷第1期烟台大学(自然科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 版)vn1.18No.1 2005年1月JournalofYantaiUniversity(NaturalScienceandEngineeringEdition)Jan200 5 文章编号:1004—8820(2005)01—0034—07 昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植 崔龙波,周雪莹,王敏强,黄秀英,孙方臻 (1.烟台大学生物化学系,山东烟台264005;2.中国科学院遗传与发育生物学研究所,北 京100080) 摘要:为探讨细胞核与细胞质调控减数分裂的机制,时昆明白小鼠GV期卵母细胞进行了 GV移植研究.将6,8周龄小鼠GV期卵母细胞分另0与6,8周龄和3月龄小鼠GV期卵 母细胞进行GV互换,所形成的3种GV,胞质体复合体的融合率(85.0%,89.8%)和3 种重组卵母细胞的成熟率(93.9%,96.2%)并不因小鼠年龄的改变而有所变化.经人工 活化后,3种重组卵母细胞形成原核期胚和2一细胞期胚的比率(分 别为80.5%--85.4% 和51.2%--55.4%)也不因不同年龄小鼠卵母细胞所带来的细胞质或细胞核的改变而受 到影响.细胞遗传学分析 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明成熟的重组卵母细胞表现出正常的核型. 关键词卵母细胞;生发泡;核移植 中图分类号:Q419文献标识码:A 生发泡(GV)移植是最近几年才建立起来的一种方法,它对研究减数分裂期间细胞核和 细胞质之间的相互作用非常重要.GV移植主要是指将GV期卵母细胞的GV移植到去核的 GV期卵母细胞透明带下,经融合形成一个重组GV期卵母细胞的过程,另外也包括将GV 期卵母细胞的GV移植到其他受体细胞质(如去核的MII期卵母细胞和受精卵)形成重组 卵的过程,GV移植最早见于1996年…,但有关该技术的详尽报道则见于1999年2~4J.迄今 为止,已对小鼠【I’,人【4],兔【7],牛等动物进行了GV移植研究,并获得了直接由GV 移植的重组卵母细胞发育到期的兔].通过GV移植可用于研究卵母细胞减数分裂异常和 与年龄相关变化之间的关系及细胞质衰老与卵母细胞非整倍性之 间的关系,本研究对我国 最常用的小鼠品系——昆明白小鼠进行了GV移植研究,并在不同年龄小鼠之间进行GV 互换,目的在于通过GV移植所建立起的重组GV期卵母细胞可以提供一个有价值的细胞 模型——研究减数分裂成熟,调控及受精期间细胞核与细胞质之间的相互作用. 1材料与方法 1.1实验小鼠 本实验使用的小鼠均为昆明白品系,由中国科学院遗传与发育生物学研究所实验动物 收稿日期:2004—09—13 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(973 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 )(G1999055902). 作者简介:崔龙波(1962一),男,山东蓬莱人,教授,博士,主要从事发育生物学和细胞生物学方面的研究 第1期崔龙波,等:昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植?35. 中心提供.小鼠分为6,8周龄和3月龄2个年龄段. 1.2GV期卵母细胞收集 每只雌鼠腹腔注射7.5IU的孕马血清促性腺激素(PMSG,中国宁波激素制品厂),46 -- 48h后断颈处死小鼠,取出卵巢,用5F解剖针刺破卵泡,释放出GV期卵母细胞,用内径 与卵母细胞直径相当的玻璃管反复吹打至颗粒细胞从卵母细胞上脱离.卵母细胞的收集均 在M2(Sigma,UsA)培养液中进行. 1.3显微操作 显微操作在室温下进行,所用仪器为Leica显微操作仪.实验所用固定管和移核管系用 毛细玻璃管(ClarkElectromedicaIInstruments,UK)在拉针仪(SutterInstrumentCo.,USA) 上拉制而成,固定管在微锻仪(Narishige,Japan)上于外径8OIn处断开,并将断端烤钝而 成;移核管于内径20m处断开,形成平头移核管;切口针系用直径为1.2nllTl的实心玻璃 棒在拉针仪上直接拉制而成. GV互换过程如下:在显微操作前,GV期卵母细胞于含有10%胎牛血清和50g/mL IBMX(Sigma)的HTF(IrvineScientific.Irvine,USA)培养液中,37?,5%C02培养箱内 孵育2h,从而形成卵周隙.IBMX的作用是抑制生发泡破裂(GVBD).将形成卵周隙的GV 期卵母细胞转入含1O%胎牛血清,50/tg/mLIBMX和25/tg/mL细胞松弛素B(Sigma)的 HEPES缓冲的HTF([rvineScientific.Irvinemin)培养液中室温孵育3Omin.用切口针对卵 母细胞的透明带进行切口,然后用移核管从透明带切口处进入卵周隙并靠近GV,吸取由少 量胞质包裹的GV——GV核体(GVkaryoplast),然后将GV核体转移到另一去除GV的 GV期卵母细胞的卵周隙内,形成GV一胞质体复合体. 用HEPES缓冲的HTF培养液洗涤5次GV,胞质体复合体,转入含1O%胎牛血清的 HTF液中于37?,5%C培养箱内恢复30rain,然后进行细胞融合. 1.4细胞融合 细胞融合在BTX200型电融合仪(GenetronicsInc.,USA)上进行,融合液为M,培养 液,融合参数:电场强度为160v/cm,持续时问为90,1次电脉冲刺激.将单个的GV一胞 质体复合体移入两个微电极之间,用拨针拨动使GV与胞质体之间接触面与电场方向垂直. 电刺激后的GV,胞质体复合体放入M2培养液内,37?培养箱内培养,30min后观察细胞 融合情况. 1.5重组卵母细胞的体外成熟及孤雌活化 融合后的重组卵移入到含10%胎牛血清的HTF培养液中,于37?,5%C培养箱内 培养,17,18h后观察重组卵的成熟情况.取排放出第一极体的重组卯进行后述实验. 成熟的卵母细胞按文献[9]描述的方法进行孤雌活化.将卵母细胞移入含3ttmol/L A23187(Sigma)的磷酸盐缓冲液(PBS)中室温处理5rain,用HEPES缓冲的HTF培养液洗 涤5次,然后转入含lO%胎牛血清和7/tg/mL放线菌酮(Sigma)的HTF培养液中培养6, 7h.3,4h后观察原核的出现与否确定激活情况,2,3d观察发育到2一细胞期胚的情况. 1.6细胞遗传学分析 取排出第一极体的MII期卵母细胞用于进行染色体分析. . 36?烟台大学(自然科学与工程版)第18卷 染色体的制备结合文献[10],[11]描述的方法进行.MII期卵母细胞在0.068mol/L KC1溶液(含1mg/mLBSA)中于45?处理20min至2h,移人一20?预冷的固定液(甲醇 :V乙酸=3:1)中,室温固定30S.然后将卵移到载玻片上,在固定液挥发前,立即滴加甲醇一 75%冰乙酸(体积比为1:1),随后滴加3次固定液,空气干燥,用2%Giemsa(pH6.8)着染 20min. 1.7数据统计分析 采用检验对实验数据进行统计学分析. 2结果 2.1GV期卵母细胞的GV互换 在不同鼠龄GV期卵母细胞之间进行生发泡互换,构成3组不同的GV一胞质复合体:6 , 8周龄的GV与6,8周龄的胞质(6WGV一6W胞质),6,8周龄的GV与3月龄的胞质 (6WGV一3M胞质),以及6,8周龄的胞质与3月龄的GV(6W胞质一3MGV).每组重复 实验5次以上. GV一胞质复合体的融合与体外成熟:经过电融合处理,各种GV一胞质复合体的融合 率在85%以上,每一组内的融合率无显着差异(表1,2).以排放出第一极体作为卵母细胞成 熟的标志,在体外培养17,18h后,重组卵母细胞的成熟率在 93.9%--96.2%之间,每一组 内重组卵母细胞的成熟率之间以及与相应对照卵母细胞的成熟率(90.5%--98.0%)比较均 无显着差异(表1,2). 表16,8周龄小与6,8周龄小鼠(期卵母细胞Gv互换后的细胞融合与体外成熟 Tab.1CellfusionandinvitromaturationafterGVexchangebetweenGVoocyt es of6,8一week-oldmiceandonesof6-8一week—oldmice 注:同一字母之间无显着差异,P>0.05(检验) 表26,8周龄小鼠与3月龄小鼠GV期卵母细胞GV互换后的细胞融合与体外成熟 Tab.2CellfusionandinvitromaturationafterGVexchangebetweenGVoocyt es 0f6,8一week—oldmiceandonesof3一month—oldmice 注:同一字母之间无显着差异,P>0.05(检验) 第1期崔龙波,等:昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植?37? 2.2成熟的重组卵母细胞经孤雌活化后的发育 不同年龄小鼠的GV期卵母细胞GV互换后,取成熟的重组卵母细胞经A23187和放线 菌酮处理,发育到原核期胚和2一细胞期胚的情况见表3和4.由表 3,4可看出,重组卵母细 胞发育到原核期胚的比率在80.5%--85.4%之间,每一组内重组卵母细胞发育到原核期胚 的比率无显着差异,与相应对照卵母细胞(85.3%--92.4%)比较亦无显着差异.重组卵母细 胞发育到2一细胞期胚的比率在51.2%,55.4%之间,每一组内重组卵母细胞发育到2一 细胞期胚的比率无显着差异,与相应对照卵母细胞(54.9%,66.4%)比较亦无显着差异.不 管是实验组还是对照组的卵母细胞只有极少数发育到3一细胞期胚或4一细胞期胚(1.5% , 3.9%),然后停止发育. 表36,8周龄小鼠与6,8周龄小鼠GV期卵母细胞GV互换后 成熟的重组卵母细胞经孤雌活化的发育 Tab.3Developmentofre?nstructedoocytesbyartificialactivationafterGVe xchangebetween GVoocytesof6,8一week—oldmiceandonesof6-8一week—oldmice 注:同一字母之间无显着差异,P>0.05(检验) 表46--8周龄小鼠与3月龄小鼠GV期卵母细胞GV互换后 成熟的重组卵母细胞经孤雌活化的发育 64DevelopmentofreconstructedooeytesbyartificialactivationafterGVexc hangebetween GVoocytesof6,8一week-oldmiceandonesof3-month—oldmice 注:同一字母之间无显着差异,P>0.05(检验) 2.3不同重组的MII期卵母细胞的细胞遗传学 将6,8周龄和3月龄小鼠体外成熟的MII期卵母细胞,以及由6,8周龄小鼠GV期 卵母细胞的GV和6,8周龄小鼠GV期卵母细胞的胞质重组后,6,8周龄小鼠GV期卵母 细胞的GV和3月龄小鼠GV期卵母细胞的胞质重组后,6,8周龄小鼠GV期卵母细胞的 胞质和3月龄小鼠GV期卵母细胞的GV重组后成熟的MII期卵母细胞进行染色体分析. 成功制备出具有确切染色体数目的卵母细胞的染色体分析如表5所示.染色体的数目为 20,19和18条.少数卵母细胞的染色体数少于18条,Martin等认为这些卵母细胞是染色体 人为丢失了而被排除在分析之外_1.由表5可以看出,3种重组卵母细胞成熟后,其单倍染 色体(20条)的比例,3者相互之间以及与2种不同年龄小鼠的MII期卵母细胞比较均无显 ? 38?烟台大学(自然科学与工程版)第18卷 着差异 表5不同重组的MII期卵母细胞的染色体分析 Tab.5ChromosomalanalysisofMIIoocytesfromdifferentreconstructedGV oocytes 注:同一字母之问无显着差异,P>0.05(检验) 3讨论 以前对人和动物卵母细胞进行GV移植的研究表明,GV移植时的每一步成功率,包括 细胞存活,去核,移核和重组,在小鼠超过90%,重组的总有效率为80%[2J;在人超过80%, 总有效率为73%[6].同时,GV移植时GV和受体胞质的完整性未被显微操作和融合处理所 损害,这是因为重组卵母细胞的成熟率与对照卵母细胞的相同,并有正常的核型和减数分裂 纺锤体,证明GV移植后的重组GV期卵母细胞能正常成熟’. 本研究表明,由不同年龄段小鼠制备的3种GV一胞质复合体的融合率均在85%以上, 每一组内的融合率无显着差异;3种重组卵母细胞的成熟率在93.9%,96.2%之间,每一组 内重组卵母细胞的成熟率之间以及与相应2种对照的卵母细胞的成熟率(90.5%,98.0%) 之间比较均无显着差异.表明3种GV一胞质复合体的融合率和3种重组卵母细胞的成熟 率并不因小鼠年龄的改变而有所变化.细胞遗传学分析也表明3种重组卵母细胞呈现与2 种对照卵母细胞相似的正常核型.GV一胞质复合体除少数研究者采用仙台病毒融合外』, 多采用电融合.Takeuchi等2]比较了同一电场条件下电解质液(M液)与3种非电解质液的 融合效果,结果表明液的融合率明显高于3种非电解质液.本实验采用液作为融合 液,亦产生了很高的融合率.同时用手动调节待融合细胞在电场中的方向,通过避免交流电 的作用,可使电融合期间不可预知的有害作用降至最低’. 本研究中,不同年龄段小鼠GV期卵母细胞经GV互换后,成熟的3种重组卵母细胞再 经A23187和放线菌酮处理,发育到原核期和2,细胞期胚的比率分别为80.5%,85.4% 和51.2%,55.4%%,每一组内重组卵母细胞发育到原核期和2一细胞期胚的比率无显着 差异,与相应对照卵母细胞(分别为85.3%,92.4%和54.9%,66.4%)比较亦无显着差 异.正常情况下哺乳动物卵母细胞的活化是由精子穿入启动的,包括 一系列的细胞内事件, 以Ca2释放开始而以第二次减数分裂完成,排出第二极体和形成单倍体雌原核告终.MII 期卵母细胞也可用电脉冲,Ca2载体如A23187,ionomycin,Sr2或乙醇处理,蛋白质合成抑 制剂如放线菌酮处理,或这些方法结合在一起而人工激活.我们结合A23187和放线菌酮处 第1期崔龙波,等:昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植.39. 理,使80%以上的体外成熟的卵母细胞活化,这是通过排出第二极体和形成一个单倍体原 核来判断的.以前的研究表明A23187+放线菌酮连续处理所激活的卵母细胞有能力支持胚 胎发育到期. 本研究表明,在不同年龄段小鼠进行GV互换所形成的3种重组卵母细胞,在经过孤雌 激活后,形成原核期和2一细胞期胚的比率并不因年龄的增长所带来的细胞质或细胞核的 改变而受到影响.然而,我们也注意到,不管是3种重组的卵母细胞还是2种对照的卵母细 胞,发育到2一细胞期胚的比率都很低,且基本停滞于2一细胞期,极少发育到3一细胞或4 一 细胞期胚.在小鼠,未见到由GV移植重组的GV期卵母细胞在体外成熟后经人工激活或 体外受精所形成的原核期胚再直接进一步发育的报道[1’.虽然通过GV移植重组的卵母 细胞可以在体外正常成熟,但人们预计这样的重组卵母细胞在受精后的发育能力会受到伤 害,因为进行GV移植时必须收集和使用GV期卵母细胞,而后重组卵母细胞又只能在体外 成熟,因此GV期卵母细胞就被从尚未受到促性腺激素峰作用之前的成熟卵泡里的正常生 理状态下取出来,被剥夺了促性腺激素直接和间接的作用,而这些作用在正常情况下能启动 卵母细胞最后阶段的成熟.同时,所收集和使用的GV期卵母细胞又必须去掉卵丘细胞以便 GV移植时能见到细胞结构,研究表明卵母细胞一卵丘细胞的连接和相互作用对卵母细胞 发育和功能的多个方面都是重要的?”J,甚至将未成熟的卵母细胞与卵丘细胞共培养也不能 克服成熟前卵丘细胞被去除的作用,人们对第一次减数分裂期间卵母细胞和体细胞之间的 相互关系还需进一步研究. 参考文献: [1JKonoT,ObataY,YoshimzuT,eta1.Epigeneticmodificationsduringoocytegrowthcorrelateswithex— tendedparthenogeneticdevelopmentinthemouse[J].NatureGenet,1996,13:91,94. 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HUANGXiu—ying2, SUNFang—zhen2 (1.DepartmentofBiochemistry,YantaiUniversity,Yantai264005,China;2. InStitute0fDevel鲫朗talBi0】o— gY,ChineseAcademyofScience,Beijing100080,China) Abstract:TofindOUtthecytoplasmicandnuclearmechanismsregulatingmeio~s,er. iGVtransf iscarriedoutinGVcx)cytesofKMmouse.Theelectrofusionrates(85.0%, 89.8%)are equivalentamong3typesofGV—cytoplastcomplexesconstructedbyGVex changebetween6, 8-week—oIdmiceand6,8一week—oldor3-month—oldmice. Thematurationrates(93.9%, 96.2%)arenotdifferentamong3typesofreconstructedGVoocytesbecauseofchangeofma. ternalage.AftermaturationofreconstructedGVoocytes,thepercentagesofpronuclear-stage (80.5%--85.4%)and2一cellembryos(51.2%, 55.4%)developedfrom3typesofn. structedoocytesbyartificialactivationfirenotinfluencedbycytoplasmicornuclearchangesre. suitingfromoocytesofdifferentagegroupsofmice. Cytogeneticanalysisshowsthatthemature reconstructedoocyteshavenormalkaryotype. Keywords:oocyte;germinalvesicle;nucleartransfer (责任编辑周雪莹)