毛细管电泳的历史与发展

毛细管电泳的历史与发展 本文简要的回顾了毛细管电泳的发展历史，对其发展和应用现状进行概述，并对未来的发展提出一些设想，作为我们研究课题的重点，特别对毛细管电泳安培检测技术进行了较为详细的评述。从电导检测、电位检测和安培检测的三种方法用于毛细管电泳这项分离技术的发展过程，到基础理论的研究、检测池的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与改进、电极的改进及其应用的简单介绍到未来的发展动向等方向逐一涉及，一般的药物、氨基酸和糖类的分析到目前应用的热点进行了综述。从毛细管电泳安培检测技术需要进一步完善和发展考虑，提出了本 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 的设想，在毛细管电泳安培检测的方法学研究及其在药物分析中的应用方面做出一些有意义的工作。 鉴于在毛细管电泳安培检测技术中，用于分离的高压电场对安培检测有着严重干扰，影响检测的灵敏度，而且分离毛细管与工作电极对接也存在一定困难等原因，前人已做了大量的研究工作，并提出了种种解决办法，但还存在不尽如人意的地方。在原有的工作基础上，我们进一步进行了毛细管电泳安培检测的研究工作，设计制作了一种高压电场隔离接口和相应的安培检测池，并对工作电极进行了改进，兹将主要研究内容报告如下: 第一部分 概述了毛细管电泳的发展历史，对电导检测、电位检测特别是安培检测的基本原理及其应用工作进行了详细介绍，指出了三种检测技术的优缺点，以及人们为降低噪音、提高检测度方面所做的一些工作，最后还简单介绍了本文的目的、意义和内容。 第二部分 设计制作了一种电场隔离接口和安培检测池，并对检测电极做了进一步改进。对高压电场隔离接口的强度、稳定性、平衡时间、导电效率及隔离电场性能等进行了详细的研究。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:该接口稳定，隔离电场效果好，可以满足实际工作的需要;制作的安培检测池可以解决分离毛细管与工作电极对接困难的问题，其工作电极可以方便的插入分离毛细管而不碰壁。组装了一套毛细管电泳安培检测系统，并利用该系统分离检测了三中种对苯二酚，结果令人满意。此外，我们通过对电极的改进，削弱了在毛细管电泳安培检测中存在的峰扩展现象，进一步提离了分离效率。 第三部分 在自组装的毛细管电泳安培系统上，进行了毛细管电泳安培检测在药物分析中的方法学研究，建立了此种药物的毛细管电泳安培检测方法。 1. 用毛细管电泳安培检测法同时测定了银黄注射液中氯原酸与黄芩苷的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了较优化的实验条件。以直径为100μm的铜微电极为工作电极，于电极电位+0.8V(vs.Ag/AgCI)处，40mmoI/L的NaB0(pH值为13.4)min为缓冲247 溶液时, 氯原酸与黄苓苷在12min内得到良好的分离. 氯原酸与黄苓苷分别在5.0×-3-410~0.5mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好的线性关系, 检测下限分别为1.0×10 -5mg/ml和5.0×10mg/ml。 2. 用毛细管电泳安培检测同时测了复方芦丁片中芦丁和抗坏血酸的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到优化的条件。以直径为50μm的碳纤微电极为工作电极，电极电位在+0.8V(vs.Ag/AgCI), 40mmoI/L的NaB0 HBO (pH值为7.5)为缓冲溶液时, 芦247-33-8丁和维生素C在10min内得到了良好的分离, 芦丁和维生素C分别在5.0×10~5.0×-4-8-410g/mL、8.0×10~5.0×10g/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，其检测 -8-8下限分别为2.0×10g/mL、5.0×10g/mL。 3(用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药连翘中连翘苷与芦丁的含量，研究了各种实验效果的影响，得到了优化的实验程序。以直径50μm的碳纤维微电极为工作为电极，电极电位在+1.2V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的NaB0HBO(pH值为8.4)+40mmoI/LSDS为缓247-33 冲溶液时, 芦丁和连翘中连翘苷在10min内得到了良好的分离. 芦丁和连翘苷分别在为1.0 -3-4×10m g /mL和5.0×10m g /mL. 4、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药槐花中芦丁和槲皮素的含量，研究了各种实 1 验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验步骤。以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极，检测电位为+1.2V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的NaB0(pH值为8.4)+40mmoI/LSDS247--3为缓冲溶液时，芦丁和连翘在10min内得到良好的分离。芦丁和连翘苷分别在5.0×10~0.5m -4g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，检测下限分别为1.0×10m g /mL和 -55.0×10m g /mL. 5 、用毛细管电泳安培检测法同时测定丹参注射液中丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。以直径为50μm的碳纤维电极为工作电极，电极电位+0.8V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的NaB0(pH值为247-8.4)+40mmoI/LSDS为缓冲溶液. 在此条件下, 丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在10min内得到良好的分离。丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在0.01~0.2m g /mL、0.002~0.1m g /mL和0.002~0.1m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系，检测下限分别为0.002、0.001和0.001m g /mL。 6、用毛细管电泳安培法同时测定了中药天麻中天麻素，对羟基苯甲醇和香草醛的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极，电极电位为+1.0V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的NaB0(pH值为247-8.4)+30mmoI/L胆酸钠为缓冲溶液时,天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛在12min内到了良好的分离。天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛分别在0.020~0.5、0.031~0.5和0.025~5.0 m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好线性关系,检测下限分别为0.005、0.01和0.006 m g /mL 。 7、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量，研究了各种实验条件对分离效果的影响，得到了优化的实验条件。以直径50μm的碳纤维微电极为工作电极，电极电位为+0.9V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的NaB0(pH值为8.8)+80mmoI/L SDS247- 为缓冲溶液时, 儿茶素和表儿茶素在10min内得到了良好的分离.儿茶素和表儿茶素分别在 -2-25.0×10~1.0m g /mL和5.0×10~2.0m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好线性关系, 检测下限分别为0.02m g /mL和0.01m g /mL。 通过以上工作，证明所设计的高压电场隔离接口和安培检测池能够满足实际工作需要，希望能对毛细管电泳安培检测方法学的研究起到一定的促进作用，对安培检测技术的发展有一定的帮助。 第一节 毛细管电泳的历史与发展 传统的电泳作为一种分离技术,是根据在电场作用下,不同的溶质由于其不同的迁移速率,以不同的迁移速度向其所带电荷的相反方向移动,从而使得不同的溶质得以分离的方法.而毛细管电泳(CE)又称之为高效毛细管电泳(HPCE),则是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，其迅速发展于二十世纪八十年代后期。CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使得分离分析科学从微升级水平进入到纳升级水平，并使得单细胞的分析，乃至单分子的分析成为可能。与此同时，也使长期困扰我们的生物大分子如糖类、蛋白质等的分离分析，因为CE的产生和迅速发展而有了新的转机。 一(历史的简单回顾 溶液中荷电粒子在电场中的泳动现象，早在19世纪初就已被发现[1]，与色谱工作一开始就作为分析方法来研究不同，电泳在Michaelis[2]关于酶的鉴别工作之前，只是作为一种物理化学现象来研究。在十九世纪中叶，对溶液中荷电离子的电场作用下的泳动现象，Wiedemann和Buff[3，4]开始进行研究，后来在实验的基础上，Kohlrausch[5]导出了离子移动的理论公式，描述了包括区带电泳，等速电泳和移动界面电泳在内的电泳基本理论，电泳 2 在真正意义上进入分析化学是在Sverdberg和Tiselius[6]的开拓性研究之后，他们在1926年提出了移动界面电泳技术。然而，只是在Tiselius[7，8]公布了移动界面电泳技术的细节之后，电泳技术才开始得到较为迅速的发展，并成为生物医学的基础研究手段之一，成功的应用于人血清的分离，获得了血清白蛋白等。 毛细管电泳发展的历史相当悠久，其发展可以追溯到二十世纪六十年代中期，瑞典科学家Hjerten[9]首先用内径为3mm的石英毛细管进行了电泳分离。后来，Mikkers等[10]首先从理论上研究了电场聚焦现象及其对分离区带扩展的影响，随后在实验上用200μm内径的聚四氟乙烯管实现了高效电泳分离，这项研究成为CZE发展史上的第一个重大突破。从二十世纪八十年代初开始，Jorgenson等[11，12]使用更细的毛细管及内径为75μm的熔融石 5英管做CZE，在30kV电压下每米毛细管的效率高达4×10的理论塔板数，这一开创性的成果成为毛细管电泳发展历史上的一个里程碑，从此，毛细管电泳技术开始了突飞猛进的发展。 二(毛细管电泳技术的发展 1(分离模式的发展 传统的电泳模式只能用于荷电离子的分离。1984年，Terabe[13]等在CE电解质溶液中加入离子表面活性剂，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，这种模式称为胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography， MEKC)，此后，又相继发展了环糊精EKC，微乳胶EKC等[14，15]，目前，MEKC已成为应用非常广泛的电泳模式之一。 1983年，Hjerten[16]首先将聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于CE分析，发展了毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis，CGE)。CGE具有极高的分辨本领，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。 此后，随着毛细管电泳研究的深入，其它分离模式如毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing， CIEF) [17]，毛细管等速电泳，毛细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC)[18，19]等分离模式不断引入，极大的拓宽了毛细管电泳技术的应用范围。 2(基础理论的深入研究 CE涉及许多基本的理论问题，如区带展宽，塔板高度，热效应，电渗流，分离度的优化等，深入的对这些问题进入研究，将极大的推进CE技术的进一步提高与应用。 针对这些理论问题，国内外许多学者进行了大量的研究。如Rhodes和Giddings等[20，21]对影响区带展宽因素进行了定量分析;Andreev等[22]提出了一个数学模型，讨论了电渗流对CE效率的影响;林炳承等[23，24]也对CE中各种影响区带展宽的因素进行了定量的分析，得到计算CE区带展宽的数学表达式，用计算机对多肽的CE分析进行了全过程模拟。陈义等[25]比较系统的研究了毛细管电泳中存在的理论问题，讨论了电泳过程中物质传输的各种动力和描述方程、区带的迁移过程及其变化，各种影响分离效率的因素，并对毛细管电泳检测器及进样中的理论问题，进行了研究。以上理论的提出，对毛细管电泳的实际应用具有重要的指导意义。 3(应用领域的不断扩展 与传统电泳一样，CE的主要应用领域是生命科学，分离对象涉及氨基酸，多肽，蛋白质，核酸等生物分子，对蛋白质结构分析具有重要意义的肽图，对人体基因工程具有决定性作用的DNA测序等许多当代生命科学中分离分析难题，CE都已涉及[26，27]。在应用于生命科学的同时，CE近年来已迅速扩展到其它领域，包括食品化学，药物化学，环境化学，毒物学，医学和法医学等，特别是在手性分子和生物大分子的分离方面，CE具有独特的优势[28，29]。 4(仪器的不断完善 3 CE技术走向成熟的标志是其分析仪器的不断完善和商品仪器的出现，自1989年出现商品仪器以来，短短几年间，在世界范围内已推出十几种型号的商品化仪器，包括不少自动化性能指标都较完善的仪器，其检测方法也得到了发展，从广泛使用的紫外可见检测，到二极管阵列检测，激光诱导荧光检测，部分仪器还提供了质谱接口。最近，电化学检测，特别是安培检测方法也得到了广泛的应用。 三(毛细管电泳的特点与应用 由于毛细管具 良好的散热效能，允许在毛细管两端加上高至30kV的电压，分离毛细管的纵向电场强度可达到400V/cm以上，因而分离操作可以在很短的时间内完成，达到非 7常高的分离效率(理论塔板数达到400000/m以上，最高达10/m数量级)。因为毛细管的内径很小(一般<100μm)，对内径50μm，长度为50cm的毛细管，其容积不足1μl，进样 -4体积在nl级，样品浓度可低于10mol/L。因此，毛细管电泳技术达到了仪器分析所要求的高效，快速，样品用量少等最基本和最优异的特点。此外，毛细管电泳技术还有容易自动化，操作简便，容剂消耗少，环境污染小等优点。正是这些特点的存在，使得CE—出现就被引起极大的关注，目前CE的研究已进入了一个重要的发展阶段。 作为一项新型的分离技术，CE的多种分离模式给样品分离提供了不同的选择机会，这对分离来源复杂的生物样品尤其有利。研究表明，小至无机离子，大到整个细胞，都有可能利用毛细管电泳技术进行分离分析。CE从产生到现在，其应用首先集中在氨基酸，糖类，核酸和蛋白质等生物分子的分离分析上，但是，随着此项技术的不断发展和完善，其应用已逐渐的向医药卫生，食品化工，环境等领域渗透。目前，CE的研究热点包括:DNA的高速测序[30]，蛋白质的高效分离[31]，糖类分析[32]，细胞分析，手性拆分[33~35]等等。此外，毛细管电泳还可用于物理化学常数的测定，生产工程控制等。 四(毛细管电泳的未来 从毛细管电泳的发展趋势来看，目前的毛细管电泳越来越侧重于应用研究，特别是与生命科学相关的问题研究。可以预见，随着生命科学研究的推进，毛细管电泳将面临新的机遇和挑战。 随着人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的顺利实施和趋于成功，后基因组计划已经逐步展开，其中蛋白质组成的研究正引起广泛的重视，毛细管电泳作为高效和灵敏的分离分析方法，可能成为蛋白质组成研究的新工具。利用毛细管电泳所进行的单细胞蛋白质组成探索性的研究结果显示，这是一个非常有前途的方向。 单细胞分析必然会快速发展，研究的目标为细胞内部物质。单分子分析可能兴起并受到重视，但能否实现单分子分析是一个挑战性的课题。 此外，毛细管电泳的新原理，新方法也会出现，如何利用和吸收其他学科的原理，方法，技术也是推动毛细管电泳的发展所必须思考的问题。总之，任何一种分离分析测定技术的发展都是朝着简单实用，同时又能解决实际问题的方向前进的。 第二节 毛细管电泳电化学检测的研究 对于毛细管分离技术而言，极细的毛细管孔径虽然给这项技术带来了极高的分离效能，但同时也给检测器的配备带来了极大的困难，由于毛细管本身的内径极小，而被分离各组分又不能有显著的展宽，因此研制高灵敏度的检测器就成为毛细管电泳这项分离技术需要研究的重要方面之一。目前已有许多种检测器被成功的应用于毛细管电泳技术中，但在商品化的仪器中常用的检测其主要是紫外检测器，紫外检测器受毛细管孔径的限制，致使其吸收光程很短，加之毛细管电泳进样量极小，导致紫外可见检测器的灵敏度相对比较低。荧光检测器 4 是另外一种比较常用的检测器，其突出的优点是灵敏度高，选择性好，尤其是激光诱导检测器，是目前最灵敏的检测器之一，但这种检测器仅能适用于具有天然荧光或易于进行荧光衍生的物质。质谱检测法是另外一种灵敏度高，专属性强的检测器，而且能够提供分子结构信息，是毛细管电泳非常理想的一种检测器，但昂贵的价格限制了它的普及。此外，毛细管电泳的检测方法还有化学发光法，拉曼光谱法等。 与上述一些检测方法相比，电化学检测方法已成为毛细电泳分离技术中一种重要的分离分析方法。电化学检测方法包括电导检测，电位检测和安培检测三种，电化学检测特别是安培检测法具有灵敏度高，选择性好，线性范围宽以及设备简单，成本较低等优点，虽然由于其本身也存在一些不足，使其在实用性方面受到一些限制，但由于其具有前述显著的特点，毛细管电泳-电化学检测方法不仅在理论和检测技术方面有了长足的发展，而且已被广泛的应用于生物医学，环境科学，药物学，食品科学等领域中，成为分离分析科学中最具活力，最有发展前景的新的研究领域之一，有关这一方面的研究已有一些综述[36~38]，其中有的侧重于仪器和技术方面，有的侧重于应用方面。下面参照有关文献，对毛细管电泳电化学检测的研究作一综述。 一 毛细管电泳电化学检测(CE-ED)技术 对于毛细管电泳-电化学检测方法而言，其所包括的电导检测、电位检测和安培检测三种方法各有其特点。电导检测虽然灵敏度相对较低，但其通用性好，适用于一般较小的离子的检测;电位检测操作简单，适用于小的阴阳离子检测，但由于其容易致使峰变形，且重现性相对较差，使其在分析中应用较少;安培检测虽然只对那些具有电活性的物质才有检出功能，但因其具备极高的灵敏度而得到了广泛的研究。 1 电导检测 1(1 电导检测原理 将电导检测法应用于毛细管电泳分离技术之中，是由于电导检测一般采用两个相对的金属电极指示电极检测水溶液中离子型溶质的电导，记录电导随时间的变化曲线就可得到电泳的分离谱图。将电解质溶液至于施加有电场的两个电极之间，溶液将会导电，电导值L与电极的表面积A，电极之间的距离1以及溶液中各种离子电导的总和ΣLiλi有如下关系: L=(1/1000)×(A/1)ΣLiλi 电导测量中，A和1是固定的，1/A称之为电导池常数K，这时， L=(1/1000)×(1/K)ΣLiλi 而对于某一离子， L=L0+(1/1000)×(1/K)Liλi 1(2电导检测技术 毛细管电泳电导检测技术由于通用性得到了广泛的应用，尤其对那些不易被UV吸收进行检测的物质。其发展至今有在柱检测，柱端检测，离柱检测三种形式。电导检测应用于毛细管电泳之中，首先由Mikkers等[39]引入，他们在200μm的聚四氟乙烯(PTFE)管中分 --离了16中阴离子。其后，Gebauer等[40]应用相似的系统分离检测了饮用水中NO，Cl，32--6-1SO的含量，获得了10 mol.L的检测限;Firestone等[41]将其用于合成肽的纯度控制研4 究;Avdalovic等[42]设计制作了一种能抑制电泳缓冲溶液背景电导的抑制柱，采用这种方法 -1分析了13种阴离子和16种有机酸，检测限在2~10μg?L。 柱后检测由于采用了接口而容易导致谱峰展宽，Huang等[43，44]开始探索毛细管电泳的在柱电导检测，他们以微机控制的CO激光器在内径为75μm的毛细管壁上钻一个直径2 5 40μm的孔，然后与孔内相对安置一对25μm的铂丝作电极，避免了使用高压电场在两电极间的电位差，减少了背景电化学反应造成的噪音;此外，他们还利用此方法获得了峰面积与保留时间有关系，通过加入内标的方法直接进行定量。 虽然在柱电导检测因没有接口，而具有区带扩散较小，灵敏度较高等优点，但在柱电导检测的电导池制作相当困难，为了使该方法更简便实用，Huang等[45，46]提出了柱端电导检测，此种设计使得检测变得相对简单。运用这种方法可以检测金属离子，尤其是碱金属离子，以及有机胺，低分子量的有机羟酸和少量的氨基酸。 2 电位检测 2(1 电位检测原理 应用于毛细管电泳的电位检测法，其原理是基于电极电位的Nernst公式: ioE=E?RT/ZFlna i iioE= E +Sloga iiii S=?2.303RT/ZiF i 其中，E为电极电位;S为理论响应斜率，实际测量时为实际响应斜率;α为所测离iii子的活度;在实际应用中，涉及到样品浓度与活度的问题，但当维持样品溶液与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 缓冲溶 o液的离子强度相同时，即可以将活度系数合并入E之中，这时上述公式就可以写成: ioE=ESlogc iiii 这里，c代表所测离子的浓度。 i 当电泳组分区带经过电极表面时，将引起电位的变化，记录其随时间的变化曲线即可得到电泳谱图，电位检测简单快速，测量的线性范围宽，但是电位检测法的重现性较差，在较大分子离子的检测上存在一定缺陷。 2(2 电位检测技术 Virtanen[47]首先引入了毛细管电泳的电位检测法，用于检测碱金属离子。Harber等[48]引入了毛细管电泳柱端离子选择微电极电位检测法，将制作好的微电极置于毛细管末端几微 2+米的位置，用于消除毛细管内由于高压电场引起的漂移电位和噪声电位，此方法除了Mg 2+外，对大多数的阳离子均有较好的响应，因此Mg可以作为基体电解质用于碱金属和碱土金属离子的分离检测。 尽管柱端电位检测法操作简单，但由于其受热湍流的影响，电泳峰容易变形，且测定结果的重现性差;为此，Nann等[49]设计了一种在柱电位检测，即采用氢氟酸蚀刻分离毛细管末端的内壁，使其成圆锥形，用于消除管内场强引起的漂移电位和噪声电位。与此同时，他们采用在柱电位检测法，实现了在10μm的毛细管内无机阳离子及有机阳离子的分离检测，且获得了良好的重现性[50]。与分离阳离子相对应，Hanser等[51]用尖端只有3μm的离子选择性微电极，在25μm的毛细管内同时分离测定了多种阴离子。 3 安培检测 3(1 安培检测原理 当被分离的化学物质流经电极表面时，由于溶质与电极之间存在着电位差，使得具有电活性的物质被氧化或还原，这时在溶液和电极之间就会形成电流，该电流符合法拉第定律。电流经过放大检测，记录其随时间的变化曲线即可得到毛细管电泳谱图。 目前用于毛细管电泳安培检测的电极可分为柱状电极和盘状电极两类。对于柱状电极，其尖端可看作是由平面电极和柱面电极组成，总的扩散电流由平面电极扩散电流i和柱面il电极扩散电流i组成[52]。I由下式表示: i2il i=4nrFDC ilii 柱面电极部分可作为薄层处理，扩散电流可表示为: 1/32/3-2/32/3 2/3i=5.00nFCUDr(R-r)Li2ii 6 上述两式中，n为得失电子数，R为毛细管的内半径，r为电极半径，L为电极长度，F为法拉第常数，Ci为被分析物的浓度，Di为扩散系数，U为平均体积流速。总的扩散电流应为两者之和，即 1/32/3-2/32/32/3i=i+i=4nrFDC+5.00nFCiUDr(R-r)L iili2ii 而对于盘状电极，Jin和Chen等[53，54]导出了其电流响应公式: 1/2i=nFCU[1-mexp(-mDA/bU)]rEf[L/4(Dt)] 12im 式中，U为体积流速，A为电极面积，b为电极与毛细管出口之间的距离，L为进样长i度，t为迁移时间，m和m为常数。 m12 3(2 安培检测技术 在毛细管电泳的三种电化学检测方式中，安培检测法是三种模式中最容易实现，也是最普遍应用的一种电化学检测法。在安培检测装置的研究和应用方面，人们作了大量工作，取得了很好的效果。 二 毛细管电泳安培检测研究进展 当安培检测作为毛细管电泳的检测器时，由于用于分离的高压电场作用，分离电流比检测池中测量的电化学电流高几个数量级，它的微小波动都给电化学检测带来非常高的噪声水平(分离毛细管直径大于25μm)，因此，如何有效的消除或降低来自分离电压的噪声是安培型电化学检测器设计的一个重要方面。近来，采用连结器或柱端检测，隔离高电压的干扰，受到很好效果。此外，通过电极设计的改变，亦使检测范围有所扩展。 1 毛细管电泳安培检测装置的研究 围绕如何降低噪声，提高检测限，人们做了大量的工作，提出了许多行之有效的解决办法[55~87]。李关宾等[58]设计了一种新型安培电化学检测器，使用Nafion溶液制作HPCE/ED接口，可有效的隔开电化学系统的干扰，且不引入附加体积，用直径5μm的碳纤维电极作工作电极做到了有机酚类化合物的分离与电化学检测，对苯二酚的检出限为30amol，理论 5塔板数为1.1×10。许丹科等[59]研制了直立型安培电化学检测器，以束状碳纤维盘状电极 5为工作电极，分离并测定了儿茶酚胺类物质，最小检测量达25amol，平均柱效为2.2×10。刘志明等[60]设计了柱端安培检测池，使用这种安培检测装置，可以很容易的将工作电极与分离毛细管口对准，通过对酚和儿茶酚胺测定的重视性、浓度线性和检出限的考察，表明其精密度时可靠的，对苯二酚的检出限是0.5μmol/L。吴性良等[61]在射壁式检测器的基础上，设计了一种用于CE-ED的检测池，巧妙地利用因表面张力现象而留驻液滴的曲面放大作用，直接调整毛细管与电极之间的相对位置无需显微镜、微调节器装置，使用自制碳糊电极，对对、邻、间苯二配件 检出奶分别为0.05、0.05、0.10μmol/L，理论塔板数分别为5210、4395、4426。杨晓云等[62]通过一只内径与毛细管外径相仿的不锈钢针头作分离毛细管与毛细管工作电极的导引管，解决了工作电极与分离毛细管的对接问题，以毛细管碳糊电极位工作电极，在内径为50μm的毛细管上分离检测了几种酚类化合物，得到苯酚的检出限为1×-6510mol/L，理论塔板数为2.2×10。 另外，Niwa[63]等设计了一种体积不足1nL的检测池，并用于单个神经细胞中神经递质的检测，而其它研究工作者通过改进电极性能提高了检测灵敏度和扩大检测范围，如文献[64]使用一种溶胶碳复合电极，进行了多巴胺、儿茶酚、肾上腺素和去甲肾上腺素等神经递质的分离检测，最低检测限小于350amol;文献[65]通过氯化钌铁修饰石墨电极，进行了非电活 +性离子Cs的分离检测。 由于毛细管电泳电化学检测中存在着重现性差，分离毛细管与工作电极对接困难问题，Voegel等[66]设计了一种分离毛细管与工作电极合为一体的检测技术，通过在毛细管末端溅射一层金属薄膜使之成为工作电极，彻底解决了工作电极与分离毛细管的对接问题，并获得了良好的重现性，但只适用于直径小于25μm的毛细管，其它研究工作者[67，68]也进行了 7 类似的应用研究。 随着CE-ED研究的深入，毛细管电泳—电化学安培检测装置逐步向微机化、自动化、商品化方向发展，胡深等[69]自行组装了一套毛细管电泳终柱微机化安培检测系统，用微机直接控制检测电位，并对信号进行采样，实现了毛细管电泳分离的安培法自动化检测，分离 55并检测了去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和儿茶酚，理论塔板数分别为1.1×10、1.8×10、 52.2×10，检出限分别为30amol、50amol和21amol，结果良好，Kappes等[70]组装了一台便携式的安培检测系统，并用于氨基酸的测定。Huang等[71]组装了具有紫外及安培检测功能的毛细管电泳仪，可用于电活性物质和非电活性物质的同时测定。于爱民等[72]将电化学检测用于毛细管电泳均相在线分析，即电泳中介微分析，该技术把反应、分离、检测集于毛细管内一次完成，操作简便、快速，具有极高的检测灵敏度。他们以LDH催化L-乳酸和 +NAD反应生成丙酮酸和NADH为基础，研究了超微量LDH的毛细管电泳在线反应EC检测方法，并首次导出了该平台宽度和高度的理论表达式。 最近，毛细管电泳芯片的研究得到了长足的发展，该项技术以晶体硅、玻璃、塑料、陶瓷和硅橡胶等为基体材料，借助毛细管电泳技术，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的高效、快速、试样用量少的微型实验室技术，目前，电泳芯片主要针对人类基因组计划，用于DNA片断分离，DNA测序，国内金亚等[72]已作过综述报道。电化学检测由于具有较高的检测灵敏度，加上超微电极的广泛使用，使得芯片与电化学检测器联用后，可望得到一个灵敏且真正集成化和微型化的装置，文献[73~77]进行了毛细管电泳芯片安培检测的有关研究，其中Wooley等[73]在芯片上集成了三电极体系的电化学检测系统，实验中10μm的铂工作电极用溅射的方法制作在分离管道出口一端附近，处于突然扩大的检测池中，用此装置对500μg/L的DNA限制酶消化片段进行了分离检测。 近年来，围绕如何有效的提高检测信号的信噪比，CE的研究者们除对仪器做进一步改进外，还使用其它的数据处理技术，如小波变换及傅立叶变换技术[91，92]，对检测信号进行滤噪处理，从而达到提高信噪比，降低检测限的目的。 2 毛细管电泳安培检测中电极的设计与改进 由于在毛细管电泳安培检测中，常用碳基电极或金属电极作为检测电极，而在此类电极上具有电活性的物质相对较少，要想进一步扩大安培检测的应用性和检测范围，就需要对电极的性能做进一步的改进，一般采用电极修饰的方法。 化学修饰电极是通过化学修饰的方法在电极表面连接上所选择的化学功能团，赋予电极某种特定的性质，以便高选择性的进行所选择的反应，可有效的提高检测灵敏度。目前用于毛细管安培检测中的修饰电极主要有以下几种: 2(1 Hg修饰微电极 1993年O’Shea等[93]在CE系统中首次采用Hg修饰Au电极，分析了鼠脑组织中的谷胱甘肽，以pH5.5，10mmol/L的2-(N-吗啉)-乙基磺酸为缓冲溶液，在0.15V(vs Ag/AgCl)电位下，谷胱甘肽的检测限为0.53fmol/L(21nmol/L)，20次进样的检测结果标准偏差为2.1%;Hg修饰微电极已用于人的血液、血浆和尿液中半胱氨酸以及血液和红血球中半胱甘肽的毛细管电泳安培检测[94，95];由于Hg修饰微电极可与巯基化合物发生如下反应: +Hg+2RSH Hg(SR)+2H 2 从而为一些重要的巯基类生物分子的毛细管电泳安培检测提供了极为灵敏的检测手段。 由于Hg膜表面能接受更高浓度的还原离子，测定时表面性质不发生显著变化，与一般金属电极相比，检测效果更好。另外，Hg膜电极还具有比铂、金、银、碳纤维更负的工作电位，表面易更新，因此，还适用于金属离子的毛细管电泳安培检测。 Hg修饰微电极的制备方法主要有两种:一种是将Au丝先后三次浸入经蒸馏纯化的汞 2+中，15秒便可获得Hg膜;另一种是在0.1~3mmol/L Hg溶液中电沉积Hg。前者较为简便， 8 后者则则利于电极的现场制备和更新。 2(2 化学修饰碳糊微电极 O’Shea[96]成功的将钴酞菁修饰碳糊电极和葡萄糖氧化酶、1，1-二甲基二茂铁修饰碳糊电极应用于毛细管电泳安培检测。前者对硫醇基半谷胱甘肽和谷胱甘肽的检出限分别达到31和300nmol/L，这种电极还可用于肼、巯基鸟嘌呤和抗坏血酸的分析。经葡萄糖氧化酶修饰的碳糊电极可用于葡萄糖的分离检测。两种电极均表现出良好的稳定性和重现性。Zhou Jianxun等[97]还研制出了氨基酸修饰碳糊电极，该电极对脯氨酸、苯胺、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸的检测限分别为0.35、1.1、5.6、10、2.3、4.4μmol/L，与间接荧光检测技术接近。一些氧化物修饰碳糊电极也可用于安培检测，Huang Xinjian等[98]利用CuO修饰碳糊电极，分离检测了丙三醇、甘露醇、半乳糖、阿茂糖、木糖、半乳糖醛酸等，检出限1~2μmol/L。 此类电极具有很好的电催化性能，不仅可降低被测物质的过电位，扩大被测物质的种类，而且可较大程度的提高灵敏度，并且有较强的稳定性和重现性。电极修饰方法比较简单，将一定比例的修饰物和碳粉及适当溶剂混合调制即可获得。 2(3 微金属颗粒修饰微电极 金属微粒修饰电极制作方便，比表面积大，选择范围广。Colon[99]报道了铜修饰碳纤维电极的制作方法及其在安培检测中的应用。汪尔康等[100，101]报道了Pt、Pd微粒修饰碳纤维电极用于安培检测的技术，Pt微粒修饰微电极的制备方法为:将碳纤维电极置于 2-2.5mmol/LKPtCl、0.1mmol/LKSO溶液中，在0.3至1.3V(vs Ag/AgCl)渐进行循环扫2424 描，PtCl在碳纤维表面吸附氧的作用下，转化为Pt(IV)的配合物，再将电极放入4 0.1mmol/LHSO中，在-0.2至1.45V间扫描，Pt(IV)的配合物还原为微细的Pt颗粒。采24 用类似的方法可制得Pd微粒修饰碳纤维电极。经Pt修饰后的碳纤维电极对肼有很好的催化活性，氧化电流大大提高，可用于硫酸肼、1，2-二甲基肼的分析;经Pd修饰后的碳纤维电极，可用于羟胺的分析。 2(4 表面分子膜修饰微电极 Zhou Jianxun等[102]采用电沉积方法，在直径33μm的碳纤维表面修饰一层Ru(CN)薄膜，此修饰电极对硫基谷胱甘肽、胱氨酸和高胱氨酸有强而稳定的电化学响应，3种物质的检测限分别为2.5、1.3、1.1 fmol，已用于肾结石病人的尿样分析。Pingang 等[103]运用自组装膜技术，在金微电极表面形成一层环糊精衍生物单分子膜，用于脱氢胆酸、乌索脱氧胆酸的分析，取得良好的效果。金文睿等[104]利用吸附法，在Au电极表面修饰一层L-胱氨酸分子，用于毛细管电泳，测定了猪肝中的细胞色素。 在毛细管电泳安培检测中，为扩大检测范围和提高灵敏度，人们除了在电极的改造及选择方面做了大量工作以外，还就电极的安置技术做了研究，主要的工作集中在检测电极和分离毛细管的一体化设计方面，有关这方面工作的详细进展，可参看安培检测装置部分。 3 毛细管电泳安培检测中相关理论研究 尽管电化学安培检测系统在毛细管电泳中得到了广泛的应用，但有关电化学安培检测的理论研究并不多见，其中傅崇岗等[105]从理论上分析了影响毛细管电泳 柱端盘状电极安培检测区带展宽的诸因素，给出了区带展宽的模拟公式: 22222222224σ=2Dt+(dη/Dt)(1/λn)(IV/4π)+μVt/1 l+v/πr calmappinjinj 式中和分别为组分的扩散系数和进样时的表现电泳淌度，D和μapp分别为电泳液的粘度和热导系数，η和λ分别为组分的迁移时间和进样时间，V和Vinj分别为分离电压和进样电压，I为电泳电流，T为电泳液的温度。通过实验考察了进样量、分离电压、检测器死体积对区带展宽的影响并并验证了模拟公式。 Jin等[106]测定了毛细管区带电泳电化学安培检测中的库仑效率η和稳态电流Is，分别 9 表示为: η=1-mexp(-mDA/Vb) 12 I=nFcV[1-mexp(-mDA/Vb)] s122-123-1式中D(cms)表示所测物质的扩散系数，A(cm)表示电极面积，V(cms)表示 -3平均体积速度，b(cm)表示电极与分离毛细管出口之间的距离，c(mol cm)表示被测物质的浓度，n和F是常数，m1和m2由实验测定，两个方程都得到了实验验证。 李关宾等[107]推导了高效毛细管电泳碳柱电极电化学安培检测的检测电流表达式，并以自制毛细管电泳/电化学检测系统对其进行了验证，对给定直径的工作电极，检测电流正比于碳柱工作电极插入检测毛细管长度的2/3次方，也正比于液体电渗平均体积流速的1/3次方。实验结果与公式吻合很好，说明了检测电流表达式的正确性。 以上的理论研究成果对电化学安培检测装置的设计及优化检测方法具有重要的指导意义。 第三节 毛细管电泳安培检测技术的应用 毛细管电泳的分离效率高，速度快，样品用量少，在生命科学、药物学、环境科学、临床医学等领域都得到了广泛的应用，从小的无机离子到生物大分子，从荷电粒子到中性分子均能用毛细管电泳技术进行分离分析。尤其是对样品珍贵，取样极少的生物大分子，毛细管电泳技术具有独特的优势。毛细管电泳的检测方式有紫外、荧光、安培检测等，与其它检测方式相比，安培检测灵敏度高，价格便宜，对一些紫外吸收小，而又没有荧光发色团的物质来说，电化学安培检测有着独特的优势，毛细管电泳安培检测已成为一项很有前途的新技术，有关毛细管电泳-安培检测的研究已有不少，其应用范围涉及到社会生活的各个方面，在这里，我们对毛细管电泳安培检测技术的应用做一综述。 一 氨基酸的分离分析 作为组成生命的最小单元，十多年来，氨基酸一直是CE-ED普遍研究的领域之一。由于氨基酸不易在普通的碳电极上进行氧化还原，通常被认为是非电活性的，但膈氨酸和色氨酸由于它们在碳电极上或其他电极上可以被氧化是例外。尽管如此，我们仍然可以通过间接检测，或通过电活性衍生直接检测，或者通过被检测物质在金属电极上的催化氧化进行直接检测。文献[108~113]分离测定了氨基酸。其中叶建农等[108]用自制的毛细管电泳一电化学安培检测装置，在中性磷酸体系缓冲溶液中，对四种羟胺和巯基类化合物的混合物进行了分 -6-5离和测定，检测下限羟胺类化合物为5.0×10mol/L，巯基类化合物为1.0×10mol/L，并对实际尿样中的半胱氨酸进行了检测。Ye等[109]还首次将平行和串列二电极用于毛细管电泳安培检测，并将之应用于糖类和氨基酸的分离测定，在平行二电极安培检测系统中，两个直径为100μm的铜圆盘电极肩并肩作为工作电极连续测定了糖类和氨基酸。在串列二电极安培检测系统中，两个工作电极以盘-环的形式串列在一起用于半胱氨酸、胱氨酸的连续测定，其中盘电极作为上行电极，钴钛菁碳糊修饰环电极作为下行电极。 朱珠等[110]用萘-2，3-二羟醛将氨基酸衍生为电活性物质，用碳纤维电极分离测定了谷 -7-7氨酸、甘氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸，检出限分别为2.5×10mol/L、2.5×10mol/L、5×-8-710mol/L、2.5×10mol/L。Labuda[111]等研究了金属氧化物碳糊修饰电极对氨基酸的响应，发现CuO就NiO是最有效的电催化剂，并用25%的CuO碳糊修饰电极进行了氨基酸的分离测定。 二 核酸的分离分析 核酸含有生物遗传信息，是一类重要的生物分子，人类基因工程研究，导致了核酸分析的迅速发展，而毛细管电泳由于具有高分辨率高灵敏分析生物大分子的特点，很快用于核酸的分析。文献[114~120]等分离测定了核酸。其中Hua等[114]用直径为200μm的铜圆盘电 10 极，在强碱性缓冲溶液体系中建立了腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、脲酸、腺苷、鸟苷的分离测定方法，检测限均小于9fmol/L，并将之应用于人血浆样品中此类化合物的分离分析测定。许丹科等[115]用微型碳糊电极分离检测了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，在Ph7.5的磷酸盐缓冲体系中，标准工作曲线的线性范围为1.0~100μmol/L，最低检测浓度为0.60μmol/L。此外，Xu等[116]还以碳纤维电极为工作电极，使用直立型安培检测器实现了腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和脲酸的分离检测，并将之应用到了鲑鱼精DNA和人血浆中此类物质的测定，获得较好的结果。 宋立楠等[117]研究了稀土金属离子对腺嘌呤单核苷酸的水解作用，取得了满意的结果，也为人工合成具有水解核酸作用的金属酶，提供了一种有效的分析方法。 三 蛋白质的分离分析 Jin等[122]用碳纤维工作电极在0.025M KH2PO4-0.02M NaOH的缓冲体系中测定了牛血清白蛋白，检测限为0.7fmol并将之成功的应用于牛血清中白蛋白的检测。此外，他们还测定了人尿中的肌红蛋白[123]。 Li等[124]使用一种新的阳离子表面活性剂三甲基溴化铵以铜电极为工作电极测定了氨基酸、肽及蛋白质，其中对两种蛋白质苹果酸脱氢酶和葡萄糖氧化酶的检出限分别达到了 -19-181.8×10mol/L 和1.8×10mol/L。 四 对映体分离分析 对映体或手性分子，是组成相同，结构上互成镜像的一对分子，构像上的差异，导致对映体分子具有不同的生物物理效应。组成相同，化学性质相近的对映体分子的分离时对分析化学的一大挑战，要求分离技术具有高灵敏度、高选择性及高分辨效率。 方晓明等[125]首次用毛细管电泳安培电化学检测法在碱性介质中添加β-环糊精(β-CD)，以220μm铜圆盘电极为工作电极，对外消旋氯霉素前体(苏式-2-氨基-1-对硝基苯基-1，3-丙二醇)进行了拆分研究，同时对其拆分机制进行了探讨。此外Fang等[126]还以铜圆盘电极为工作电极，使用β-CD作手性分离剂，分离了两种氨基酸衍生物对映体。 五 糖类化合物的分离分析 对糖类的分析是生物分析领域中的又一挑战性课题。糖类作为一组重要的的化合物，由于没有明显的生色基团或荧光基团，要用毛细管紫外检测或荧光检测对其进行分离分析就显得非常困难;而金属电极毛细管电泳安培检测的开发和应用，使得它们可以在较低的电位下直接被氧化，从而达到目的。由于糖类在碳电极上不呈现电活性，因此，对此类物质的分析一般都选用如金、铜、铂和镍等金属作为电极材料，这些金属基质电极的共同特征是他们只有在强碱性溶液中才会对糖类表现出良好的响应。文献[127~132]等分离测定了糖类化合物。其中Fermier等[127]用Ni微电极做工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在pH>11的碱性条件下，实现了糖类的分离与检测，并将之应用于尿及酒类饮料中糖的测定。而Goto等[128]则用铜圆盘电极作工作电极，在强碱性条件下分离并检测了糖类化合物，当加入阳离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化氨后，其氧化峰电流比未加时提高两倍，检出限达到了2.5fmol。 朱叔韬等[129]以直径为200μm的铜电极为工作电极，采用直立式安培电化学检测装置分离和测定了岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖和果糖，实验中以戊五醇为 -6内标，最低检测限平均为1.6×10mol/L，检测单糖的重现性在5%以内，将之应用于人血浆中葡萄糖的测定，测得浓度为4.4mmol/L。 叶建农等用直径为300μm的铜电极为工作电极，除对两种蜂蜜样品中的蔗糖、葡萄糖和果糖进行了测定[130]以外，还对蔗糖水解反应速率常数的测定方法进行了研究[131]，直接测定了蔗糖及其水解产物的浓度随时间变化的规律，在HCl催化下，对不同温度时蔗糖的水解反应速率常数进行了测定，并求得反应活化能Ea为109.8kJ/mol。 许丹科等[132]还以麦芽寡糖为研究对象，研究了离子流体动力学半径在分离中的作用 11 和规律，提出了麦芽寡糖的迁移时间淌度与其所含糖基数目的线性关系，并在不同体系与操作电压下得到了验证，同时也为利用毛细管电泳技术估算麦芽寡糖所含糖基数提供了简易途径。 六 中药有效成分的分离分析 随着毛细管电泳安培检测的进一步发展，其在中药有效成分的分析中也得到了应用，安培检测可有效的检测到那些具有电活性基团的物质如多糖及其甙类，黄酮类及有机酸类物质，文献[133~142]用毛细管电泳安培检测法分离测定了中药及其制剂中的有效成分，取得了很好的效果。 Lin Hua等[133]以凝胶碳复合电极为工作电极，以+0.8V为检测电位，在pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，分离测定了四种山柰酚及其衍生物，其中山柰酚的检测限达到了4.8μM，并测定了实际样品中此四种物质的含量。Gang Chen等[134]用直径为300μm的碳圆盘电极为工作电极，在pH为9.0的硼酸盐缓冲溶液中，分离测定了中药葛根中的三种黄酮类化合物葛根黄素，大豆黄素和芦丁，此三种物质在12分内得到了良好的分离，检测限在0.241~0.511m mol/L之间，并测定了实际样品中该三种物质的含量。此外，Gang Chen 等[135，136]还使用毛细管电泳安培检测法分别测定了中药黄芪及黄芩中有效成分的含量。 Cao Yuhua等[137]用直径为300μm的碳圆盘电极为工作电极，在50mmol/L的硼砂溶液中检测电位为0.95V时分离测定了中药满山红中的杜鹃素、槲皮素、丁香酸、香草酸、对羟基 -7-6苯甲酸和原儿茶酸，线性范围为9.0×10mol/L~3.0×10mol/L，另外，他们还测定了天麻 -7-6中的天麻素、香兰醇、对羟基苯甲醛等化合物，线性范围在3.0×10mol/L~1.8×10mol/L之间。 Xinhua Sun 等[138]在pH为9.7的磷酸盐缓冲溶液中检测电位为1.20V时分离测定了中 -8-4药姜黄中的姜黄素，检测限达到了5.0×10mol/L，线性范围在5.0×10mol/L~7.0×-610mol/L。 此外，文献[139~142]也报道了毛细管电泳安培检测在中药有效成分分离分析中的应用。 七 其它无机及有机化合物的分离分析 在毛细管电泳安培电化学检测的应用研究中，有相当一部分是有关胺类等神经递质和酚类等化合物的分析的[58~62，100，143~145]。其中Chen等[144]使用聚组氨酸化学修饰电极，极大的提高了电极对酚类化合物的电流响应，并将之应用于毛细管电泳安培检测系统。 此外，文献[146~176]也进行了大量的其它无机及有机化合物的分离检测，如 Chen等[146]用Ni微电极做工作电极，分离测定了糠醇和乙醇，检测限达到了0.1fmol，理论塔板 4数1.21×10，并对两种酒类饮料中糠醇和乙醇的含量进行了测定。Lai等[147]分离测定了2+2+Hg和CHHg，检测限分别达到了0.2ng/mL和3ng/Ml，有望用于环境样品中汞含量的测3---定。Chen。等[148]用铂电极分离检测了几种无机阴离子，对I、NO和SCN的检测限分别2-7-7-6达到了1×10、1×10和1×10mol/L。 李关宾等[149]以碳纤维电极为工作电极，在NH3-NH4Cl缓冲溶液中，分离检测了维生素C、维生素B1和维生素B6，其中对维生素C的分离效率达46880理论塔板数。曹志广等[150]以碳圆盘电极为工作电极，在PH=8.0的NaHPO-NaBO缓冲溶液中，对两种多维24247 片中水溶性维生素的分离检测进行了研究，各组分峰电流的相对标准偏差(RSD)<3.0%， -7检出限可达5.0×10mol/L。 需要特别指出的是，常见的安培检测方法都是检测被测定物质的氧化电流，其检测电位一般为正电位，而文献[177~180]则检测了被测定物质的还原电流，检测电位为负电位。如Smith等[179]在负电位分离测定了奎宁的对映体，Jin等[180]在负电位测定了氯霉素。 12 第四节 毛细管电泳时间性化学检测技术的发展趋势及本论文的意义 毛细管电泳作为一种新型的分离分析技术，一直是人们研究的热点。毛细管电泳技术的研究主要包括理论、分离模式和检测器三个方面。就分离模式和检测方式而言，各种分离模式有其不同的特点，分别侧重于不同的分析领域和对象。而在检测方面，目前有紫外可见，荧光，质谱和电化学等检测方法，紫外可见虽然有通用性强的特点，但由于其本身固有的弱点，使得检测的灵敏度受到了限制;荧光检测尽管有很高的灵敏度，却因多数化合物在通常情况下不产生荧光，使其应用范围显得非常有限;质谱检测具有较高的灵敏度，且能够提供可能的结构信息，而使其具有许多优点，可是昂贵的价格限制了它的广泛使用。电化学检测由于具有比较高的灵敏度，价格便宜，对于有电化学活性的物质来说，有着独特的优势，因此，在各个领域都得到了广泛的应用。 一 毛细管电泳电化学检测的发展趋势 与一些成熟的分离技术相比较，毛细管电泳电化学检测技术的研究中有十余年的发展时间，其技术本身仍处于发展完善的阶段，其应用领域也正在不断的扩展深入。但由于其具有高效、快速、灵敏以及消耗少等优点，使其根据发展潜力和应用价值。与此同时，由于电化学检测本身固有的弱点，如稳定性和重现性相对较差、操作具有一定的难度，使得其至今仍然主要被电化学专家所掌握，而很少应用到常规分析中去。 针对电化学检测存在的这些弱点，多年来人们一直在进行着不懈的努力，在保持优点的基础上，试图通过电化学检测技术的发展完善来克服，为此人们发展了扫描伏安、脉冲安培和微电极阵列等多种电化学检测方法。此外，检测电极与毛细管接口的改进、检测电解池设 计的合理性以及检测电极材料的多样性，都将是检测方法不断完善的努力方向。 随着细管电泳电化学检测技术的不断发展，其应用范围也越来越广泛。 首先，由于药物和生物医学在维持人类健康方面的重要地位，作为具有良好分离分析性能的CE-ED方法，在药物和生物医学方面将发挥积极的作用。其次，对氨基酸、糖类、蛋白质、甚至DNA片段进行序列分析，也将是CE-ED应用的一个重要发展方向。第三，环境污染的日益严重，食品及饮料的日益丰富以及人们对绿色食品的渴求，使得CE-ED在环境和食品分析方面的应用也将越来越广泛。第四，CE-ED除了在上述各个领域的应用研究不断的向着深度和广度延伸外，还将于其他学科交叉，在发挥本身优势的同时，也为其他学科的发展起到积极作用。 二 本论文的研究内容、目的及意义 1(在总结毛细管电泳电化学检测方法发展的基础之上，针对毛细管电泳电化学检测存在的不足及其自身所具有的优势，改进了高压电场隔离接口，降低了来自高压电源的噪声影响;自行设计了一种安培检测池，克服了毛细管电泳安培检测中存在的分离毛细管与电极对接困难的问题，并对其实用性进行了验证，得出一些有用的结论。 2(中药是中医在长期的防病治病实践中，久经验证、优选出来的精华，是国家的医学宝库，日益受到国际医学界的重视。但由于中药品种繁多，成分复杂，不同品种间活性成分的含量相差悬殊，其成分分析有着特殊的复杂性，缺乏统一的质量控制指标，因此，建立一套行之有效的质量控制体系必要的。本文用毛细管电泳安培检测法测定了几种中药中有效成分的含量，进行了这几种中药中有效成分含量测定的方法学研究。 第二章 毛细管电泳安培检测装置的研制 第一节 毛细管电泳安培检测池的研制 13 一 引言 从1987年Ewing[1]首次将电化学检测技术用于高效毛细管电泳后，电化学检测特别是安培检测法已成为高效毛细管电泳中高效和富有吸引力的检测技术，受到了广泛的重视。但由于高压电场的作用，分离电流比检测池中测量的电化学电流高几个数量级，它的微小波动都会给电化学检测带来非常高的噪声水平(分离毛细管直径大于25μm)，因此，如何有效的消除或降低来自分离电压的噪声干扰是安培型电化学检测器设计的一个重要方面。 近年来，围绕如何降低来自分离电压的噪声影响，人们设计了多种检测系统[2~9]，各有其优缺点。柱端检测系统虽然可有效的降低噪声，但灵敏度大大降低;而在柱检测系统则在提高灵敏度的同时，其噪声水平亦有大幅度的提高。本文设计了一种高效毛细管电泳柱上安培检测系统，既可有效的降低噪声，又提高了灵敏度，结果比较满意。 二 实验部分 1 仪器与试剂 自组装毛细管电泳检测系统[10](中国科学院研究生院应用化学研究所);ACS-2000安培检测器(中国科学院研究生院应用化学研究所);CHI660A电化学系统(CH Instruments， U.S.A.); 未涂层弹性融硅毛细管柱(50μmID，总长62cm，有效长度60cm，河北永年光导纤维厂);PH-HJ90B型便携式酸度计(上海雷磁仪器厂);电化学测量采用三电极系统，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极为工作电极。 对、邻、间苯二酚、十二烷基硫酸钠、β-环糊精、磷酸氢二钾、氢氧化钠等试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2 安培检测装置的制作 用有机玻璃制成如图1所示的安培检测装置，由高压电场隔离接口池和检测池两部分组成，四周的螺丝可自由拆装。有机玻璃的大小为3.5cm×2cm×1.5cm，四周螺丝的直径为0.6cm，螺孔的直径为0.4mm，中央椭圆形池的深度为1.2cm，池壁以抛光处理。从接口池侧壁引出的铂丝，可作为电泳的阴极。从检测池两侧可分别引出铂丝和银丝作为对电极及参比电极。工作电极安装在正对分离毛细管一端的螺丝上，实验过程中可自由更换。 图1 安培检测装置示意图 Fig.1 The scheme of capillary-amperometric detection System 1(高压负极;2. 参比电极;3 . 工作电极; 4. 辅助电极; 5. 高压电声隔离接口; 6. 分离毛细管 3 碳纤维微电极的制作 将几束长约6cm，直径为5μm的碳纤维束，分别用丙酮、去离子水洗涤，自然晾干后，将其约5cm紧紧缠绕在一根长约10cm直径为0.2mm的银丝上，然后穿入直径为0.25mm的毛细管内，碳纤维伸出毛细管约1cm，银丝从毛细管另一端伸出，毛细管两端用环氧树脂密封，固化后即成一根碳纤维微电极。微电极的尺寸可根据需要截取，实验过程中长约0.1cm。每次使用前在0~1.0V范围内，循环扫描4~5次。 14 4 安培检测装置的安装 将带有高压电场隔离接口的分离毛细管固定在高压电场隔离池上，使其被HF酸腐蚀的开口端伸入检测池内。工作电极从另一端伸入，尖端插入分离毛细管约0.05cm。由于固定分离毛细管及工作电极的螺丝小孔处在同一条直线上，所以碳纤维工作电极可以很方便的插入分离毛细管而不碰壁。 5 实验方法 毛细管在每次使用前依次用0.1mol/LNaOH、二次蒸馏水及缓冲溶液冲洗，高压电场隔离接口池及安培检测池均用缓冲溶液充满。 电泳工作条件:20mmol/LKHPO-NaOH(pH=12.0)-25mmol/L SDS-10mmol/L β-环糊24 精，带有高压电场隔离接口的毛细管(50μm×60cm);分离电压15kV;采样电压15kV;采样时间8秒;Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极为工作电极，检测电压1.0V。所有溶液使用前均用孔径为0.45μm的滤膜过滤。 三 结果与讨论 1 工作电极插入毛细管长度对检测灵敏度的影响 随着工作电极插入分离毛细管内长度的增加，检测灵敏度随之增大，但基线噪声亦随之增大，试验过程中工作电极插入分离毛细管内约0.05cm。 2 噪声水平 在上述实验条件下，使用带有高压电场隔离接口的毛细管运行，其噪声水平小于0.1nA。 图2 对七二酚异构体的毛细管电泳分离图 Fig.2 The electropherograms of Hydroquinone、Resorcinol and Catechol 实验条件:20mmol/LKHPO-NaOH(Ph=12.0)-25mmol/LSDS-mmol/Lβ-CD. 24 1(对苯二酚(10mg/L);2.邻苯二酚(10mg/L);3.间苯二酚(30mg/L) 3 对苯二酚异构体毛细管电泳柱上安培检测 在20mmol/LKHPO-NaOH-25mmol/L SDS-10m mol/L β-环糊精(PH=12.0)的缓冲24 溶液中，使用未涂渍带接口石英毛细管(50μm×60cm)为分离毛细管，在15kV电压下电迁移进样8秒，分离电压15kV;以Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为辅助电极，自制碳纤维微电极为工作电极，检测电压1.0V。对苯二酚的三种异构体在15分钟内达到了完全分离，图2为对苯干杯人异构体的毛细管电泳分离图。 4 对苯二酚异构体的工作曲线及检测限 配制不同浓度的对苯二酚异构体溶液，测其峰电流与浓度的关系，其工作曲线及检测限(S/N=3)列于表1: 表1 邻、间、对苯二酚的工作曲线及检测限(n=5) Tab.1 The working equation and detectio, limit of Hydroquinone、Resorcinol and Catechol 化合物 线性范围(mg/L) 工作曲线 相关系数(r) 检测限(mg/L) (Compound) (Liner ranger) (Working equation) (Relative coefficient) (Detection limit) 邻苯二酚 0.5~100 Y=0.32X+0.25 0.9982 0.2 间苯二酚 0.2~100 Y=0.26X+0.31 0.9975 0.1 对苯二酚 0.5~100 Y=0.43X+0.10 0.9994 0.1 四 结论 用自己设计制作的安培检测系统，分离检测了对苯二酚的三种异构体，最低检测限分别达到了邻苯二酚:0.2mg/L;间苯二酚:0.1mg/L;对苯二酚:0.1mg/L。工作电极是碳纤维 15 微电极，制作简单，寿命长，易于更换。考察了仪器的性能，表明完全可以胜任研究工作的需要。 第二节 毛细管电泳与安培检测联用系统中高压电场隔离 接口的研制及电极的改进 一 引言 正如前面所述，毛细管电泳(CE)因其具有进样量少、分离效率高和检测灵敏的特点，已经发展成为一种极具潜力的液相分离技术。但影响CE发展的瓶颈之一是其缺乏实用的检测方法，在现有的检测方法中，紫外可见检测器最为通用，但由于其自身的缺点，检测灵敏度较低;激光诱导荧光检测器具有高的检测灵敏度，但因其价格昂贵而限制了它的进一步应用和推广;电化学安培检测器(ED)以其较高的检测灵敏度、便宜的价格而受到了人们的重视。然而，在毛细管电泳安培检测(CE-ED)中，CE的分离电场会对安培检测的检测电流产生严重的噪音干扰，较大的噪音限制了安培检测的灵敏度。为了解决高压电场的干扰问题，人们设计了多种高压电场隔离接口来消除来自分离电场的噪声干扰，如石墨管[1]、Nafion管[2]、醋酸纤维素膜[3]、多孔玻璃接口[4]等，上述接口在一定程度上减少了高压电场对安培检测电流的影响，但存在着接口体积大、制作重复性差、强度低等缺点，我们实验室曾经采用激光烧蚀HF腐蚀的方法制作了小体积、高强度、性能优良的高压电场隔离接口[5]，但在实际使用过程中，我们发现此种接口容易导致毛细管堵塞，特别是在分离电压较高的情况下，推测可能是在高压电场的作用下，用于封堵的粘接剂发生了变化。 在使用毛细管电泳安培检测的过程中，我们发现，在同等情况下，安培检测的峰要比紫外检测的峰宽许多，从而降低了此种方法的分离效率。这一方面可能与所使用检测器检测方式的不同有关，另一方面也与安培检测所使用的电极有关。 考虑到以上问题，我们设计了一种新的高压电场隔离接口，并对该接口的强度、平衡时间、导电效率、隔离电场性能等进行了研究，表明该接口制作简单，死体积小，使用寿命长，可用于毛细管电泳安培检测系统中，另外，为克服安培检测中存在的峰展宽问题，我们使用直径相同的带有绝缘漆的铜导线替代裸的铜导线，发现其峰宽减小，分离效率提高。尽管在检测过程中，其峰高有所降低，但由于噪声也随之降低，信噪比并未发生变化，因此对检测灵敏度的影响不是很大。 二 实验部分 1 仪器与试剂 ACS-2000毛细管电泳仪(中国科学院研究生院应用化学研究所);ACS-2000安培检测器(中国科学研究生院应用化学研究所);未涂层弹性融硅毛细管柱(50μmID，河北永年光导纤维厂);PH-HJ90B型便携式酸度计(上海雷磁仪器厂);Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制铜电极为工作电极。 所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2 高压电场隔离接口的制作 高压电场隔离接口的制作大致分为几个步骤:(1)用手术刀片在距分离毛细管出口端约2cm处轻轻划一刻痕;(2)两手握住刻痕两端，轻折使其出现裂缝而不断裂;(3)将溶有醋酸纤维素的丙酮溶液滴在裂口处，自然晾干;(4)将HY-914胶A和B按A:B=5:1的体积比在干净的玻璃板上混匀，放置约20分钟预固化;(5)将混匀的粘接剂轻轻涂在毛细管小孔处，并涂绕毛细管一周，室温固化。 3 电极的制作 16 将所需的铜导一插入内径为150μm的毛细管中，两端用胶密封，其中一端伸出毛细管约2mm，作为检测电极。 4 高压电场隔离接口的评价 采用自组装的毛细管电泳安培检测系统[6]，就接口的平衡时间、稳定性及接口对基线噪音和漂移的影响进行考察。 5 安培检测装置的安装 将带有高压电场隔离接口的分离毛细管固定在高压电场隔离池上，使其被HF酸腐蚀的开口端伸入检测池内。工作电极从另一端伸入，尖端插入分离毛细管约0.05cm。 6 实验方法 毛细管在每次使用前依次用0.1mol/LNaOH、二次蒸馏水及缓冲溶液冲洗，高压电场隔离接口池及安培检测池均用缓冲溶液充满。 电泳工作条件:20mmol/LKHPO-NaOH(PH=12.0)，带有高压电场隔离接口的毛细管24 (50μm×50cm);分离电压18kV;采样电压18kV;采样时间5秒;Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，自制铜微电极为工作电极，检测电压1.0V。所有溶液使用前均用孔径为0.45μm的滤膜过滤。 三 结果与讨论 1 高压电场隔离接口的强度 接口的强度是评价接口性能的重要指标。用双手握住带有高压电场隔离挡口的毛细管两端，自然弯曲，以检验接口的强度。结果表明，用上述方法制作的高压电场隔离接口，自然弯曲多次，接口未发生断裂，表明接口的强度较好，可以满足实际需要。 2 接口的平衡时间和导电效率 接口的导电性能好坏可以用新制接口在电泳介质中毛细管电泳电流达到稳态值(稳态电流I)的时间、初始导电效率(D)和稳态导电效率(D)来表示。达到稳态电流的时间称sis 接口的平衡时间t，D可以用稳态电流I与无接口时相同长度分离毛细管的毛细管电泳电流sss I的比值来表示，D可以用初始电泳电流I与I的比值来表示，即， oiio D=(I/I)×100% iio Ds=(I/I)×100% so 接口平衡时间的测定步骤是:(1)将毛细管充满电泳缓冲液;(2)将接口置于毛细管电泳系统的接口池内;(3)将接口池充满电泳缓冲液，立即接通高压电源，每隔2分钟纪录电泳电流随时间的变化数据。 我们对50μm的毛细管接口的平衡时间和导电效率进行了测定，结果见表1。表1表明，接口的平衡时间不大于30分钟，初始导电效率在40%左右，而稳态导电效率大于97%，说明接口的导电性能良好。 表1接口的平衡时间和导电效率 毛细管规格 时间(min) 电泳电流(μA) D(%) D(%) is 42cm×50μmi.d 158 (40+2)cm×50μmi.d 0 60 39.7% 97.5% 2 79 4 90 6 102 8 114 10 125 17 12 138 14 147 16 151 18 153 20 154 22 154 3 接口隔离高压电场的性能 使用高压电场隔离接口后，由于部分排除了高压电场对安培检测器的干扰，使柱上安培检测成为可能。接口隔离高压电场的性能可直观地用接口使用前后基线噪音和漂移变化来表示(表2)。表2表明，高压电场隔离接口的使用，使得基线噪音和漂移都得到了显著的改善。 表2 使用接口前后基线噪音和漂移的变化* 毛细管规格 噪音 漂移 42cm×50μmi.d. 621nA 1138Na (40+2)cm×50μmi.d 12nA 96Na *注: 工作电极为直径10μm碳纤维电极 4 电极的改进 图1 样品在分离毛细管中运动示意图 在外加电场的作用下，样品溶液在毛细管中呈带状向负极移动(图1)，当样口到达分离毛细管出口端时，与检测电极反应，在电泳采集曲线上表现为一个电泳峰，若此时电极为柱电极，则样品溶液在移动的过程中，不断与电极发生反应，反应时间延长，从而导致峰扩展;若电极为盘电极，则由于反应只在电极的横截面上发生，反应时间变短，检测峰变窄。因此，我们以便于制作的铜电极为例，比较了相同直径的带有绝缘漆的铜导线与裸的铜导线做电极时的半峰宽、信噪比及分离效率，结果列于表3: 表3两种电极性能对比* 电极 基线噪音 基线漂移 信噪比 半峰宽(min) 塔板数 3裸铜电极 16nA 740nA 23.9 0.65 2.2×10 4 漆包线电极 0.6nA 27nA 12.5 0.21 2.1×10 由表3可以看出，改进后的电极其半峰宽大为减小，尽管其灵敏度有所减小，信噪比下降了大约一半，但分离效率大大提高，理论塔板数与改进前相比，大约提高了10倍。 四 结论 实验结果表明，自行设计的高压电场隔离接口呆有效的隔离来自高压电场的噪音干扰，可以满足研究工作的需要;改进后的电极检测峰宽度变窄，分离效率的到了有效提高。 18 19