新生物能源的挑战_有关镍铁氢化酶研究的新进展

新生物能源的挑战_有关镍铁氢化酶研究的新进展 新生物能源的挑战 ———有关镍铁氢化酶研究的新进展 3 张 岐廖代正王耕霖 ( )南开大学化学系 ,天津 300071 . 3 联系人 摘要 氢化酶是可逆分裂重组氢分子的一类酶. 由于在燃料细胞和新能源方面具有诱人的应用前景 ,成为当今自然界向能源 、化学学科挑战课题之一. 目前发现的 4 种氢化酶中 ,镍铁氢化酶的存在最为普遍 ,研究也 最为深入. 但在活性中心结构组成和催化机理方面一直存在着不同观点和争论 ,引起许多国家学者的极大关 注. 关键词 镍铁氢化酶 活性中心结构 催化机理 功能配合物 氢能源 燃料细胞 生存在地球上的人类时刻都离不开能源. 因此在合理使用现有能源 ,治理污染的同时 ,也在积极探索各种新型能源. 随着本世纪后半叶生物学的飞速发展 ,利用微生物来产生廉价 、绿 ( ) 色能源的设想极富吸引力. 氢化酶 Hydrogenases , 简称为 Hases是存在于厌氧微生物中的一 + - 1 , 2 ( ) 类酶 ,其催化作用是可逆分裂重组氢分子 反应为 : H2 H + 2e . 这一发现自 70 2 年代末以来就引起生物化学和生物无机化学专家的高度重视 ,这些研究寄希望于得到燃料细 3 ,4 胞 ,或利用类似结构的模拟功能配合物通过光作用产生氢能源. 因此 ,对这类酶的活性中 心结构 、催化机理方面的研究一开始就引起广泛关注. 早期波谱研究结果普遍认为该酶的活 5 ,7 性中心仅含单核金属镍. 8 1995 年 Volbeda 等人在 Nat ure 上发表的关于 D . gi gas Ni Fe 氢化酶单晶解析向早期的 研究结果提出了挑战 ,从而引起了学术上的论争. 1996 年 Volbeda 等人再次发表了该酶的更 9 9 ,10 高分辨率的单晶解析结果,对活性中心结构的组成又提出了新模型, 使得人们不得不 回头重新审视以往的研究方法和结论. 有关镍铁氢化酶活性中心结构的论争成为当今新热 点 ,据能查阅到的仅 1996,1998 年 1 月 Nat ure ,J Am Chem Soc 等国际权威杂志上涉及此领 3 ,9 ,31 域的论文已近 30 篇. 本文将在文献跟踪的基础上就酶活性中心结构的论争要点及目 前尚存在的问题进行研究分析与探讨 ,以引起我国学者在这方面的研究兴趣 ,促进这一领域的 发展. 1 早期推论的 NiFe 氢化酶活性中心结构 自 70 年代末发现氢化酶以来 ,对其结构表征及催化机理进行了大量的研究 ,至 1995 年前 ( ) 普遍认为镍铁氢化酶 Ni Fe Hases 的活性中心仅含单核镍原子 ,这期间采用的研究方法主要 ( ) ( ) 有电核双共振 ENDO R、电子顺磁共振 EPR、X ( ) ( ) 射线吸收光谱 XA S、穆斯堡尔谱 Mssbauer ö 等. 研究认为 Ni Fe 氢化酶中除一些[ x Fe2 y S 原 5 ,7 子簇外 , 还含有单核金属 Ni 作为活性中心 () 见图 1. 酶的活性正是由于蛋白中络合 Ni 的不同氧 图 1 最初推测的模型结构示意图 化态之间循环完成的 ,在此基础上提出了一些催 化机理. 关于以 Ni 为活性中心的模型配合物研究报道相继出现 ,有些已达到氧化还原过程中 32 4 ) ( 与酶各状态相吻合的程度. 当然也存在着少数不同的看法 ,如 Maro ney 等人认为 : ? ) ) ( ( 从 Ni ?到 Ni ?的氧还电对必须压缩在 - 400, - 100 mV 的 300 mV 宽的电势范围内 ,这 ) ( 在单个 Ni 配合物中是没有先例的 ; ?采用 XA S 谱方法对 Ni 中心还原活性进行研究表明 , 若氧化酶是以 Ni 为中心的话 ,其还原反应对于每一种氧化态的改变将在边带能谱上呈现出约 33 2 eV 位移 ,但在对 T . roseope rsici n a 菌氢化酶的检测中没有发现明显的移动,这个结果与 ) ( 采用 EXA FS 分析的结果一致 ,即 Ni 位置没明显的结构变化 ; ?位于 S 上的电子也可表现 ) ( ) ( 出足够的自旋2轨道耦合导致观测到的 EPR 谱中的 g 值. 因此认为基于Ni ?,Ni ?氧化 4 态变化的机理是不可靠的. 但对酶中只有单核镍的观点没有异议. 2 单晶解析结果 9 1995 年 Volbeda 等人对 D . gi gas 菌的 Ni Fe 氢化酶 01285 nm 单晶解析为全面认识 Ni Fe 氢化酶带来了突破性的进展 ,使人们第 1 次对该酶的整体结构有了清晰的了解 ,同时活 性中心结构的结果也向早期结构模型提出了挑战 ,引起了结构上的争议. 解析结果表明该 Ni Fe 氢化酶为异二聚酶 ,两个亚基紧密相联形成了一个近乎于球形的分 () ( ) 子 ,Ni 中心在酶的大亚基上 60 ku,所有 Fe/ S 簇都束缚在小亚基上 28 ku. 小亚基上含有2 个4 Fe 24 S 簇和 1 个3 Fe 24 S 簇 ,并且这 3 个 Fe/ S 簇几乎按线型排列 , 3 Fe 24 S 簇在中间. 大亚基上 Ni 的位置与小亚基上一端的4 Fe 24 S 簇靠近. 小亚基上远端的4 Fe 24 S 簇与另两 个 Fe/ S 簇的不同在于 Fe 的 1 个配体是组氨酸的咪唑基团 ,而不是半胱氨酸的 S 配体. 这个 组氨酸残基是溶剂可接近的 ,这样就为从其它还原蛋白得到或输送电子提供了 1 个可能的通 道. 结构数据还可分辨出 1 个用于质子通入或离开镍中心的可能通道 ,4 个组氨酸和一个谷 氨酸残基位于活性中心和蛋白表面之间. (结果还表明 Ni 附近 0127 nm 处还有一个未知金属 推 ) ( ) 测为 Fe 原子存在 见图 2. 结构可描述为 : 活性中心由 Ni 和另一个金属中心 Fe 组成异双核原子簇 ,配位环境仅 含 4 个内源的配体 ,即 4 个在大亚基中存在的半胱氨酸残 基 ,2 个半胱氨酸残基 S 作为端基与 Ni 配位 ,余下的 2 个半 胱氨酸残基 S 除与 Ni 配位外同时与 Fe 中心形成桥连. Fe ( 图 2 01285 nm D . gi gas Ni Fe Hase周围不再有其他蛋白质 , Fe 与保留的 3 个配体 当时认为 单晶结构) 是水或其派生物形成了五配位构型. Ni 中心的配位环境活性中心示意图 可大致描述为四配位的三方锥构型. 这样使得这个生物酶 的活性中心为 1 个二硫桥的原子簇形式 ,Ni2Fe 之间距离约 0127 nm ,镍铁金属二硫桥形成的 两面角为 96?. 3 争论要点 争论的要点是 : Ni 附近未知金属是否为 Fe ,若是 Fe 则外来配体不可能是水或其派生物. 正是由于 Ni 附近有 Fe 存在的结论向早期推论的 Ni Fe 氢化酶活性中心结构模型提出了挑战 , (引起从事这方面研究者的哗然 尽管很早也曾怀疑过 Ni 附近有 Fe 存在 ,但谱学研究并没有明 2 ,34 ) 显的特征予以证实. 这次解析结果给出了酶的整体轮廓的同时 ,在对活性中心组成的 ) ( 认定上也确实有不能令人信服之处 : ?如果 Ni- Fe 组成双核中心 ,给出的 Fe 配位环境不可 ) ( 能在不同酶状态时始终保持两价低自旋 ,并以此来解释不同酶状态的 EPR 谱 ; ?未另加营 57 养型和Fe 同位素标记的 D . gi gas 氢化酶的研究认为活性中心仅含有单核 Ni , 没有其他 32 EPR 活性金属中心在其附近 ,其他谱学研究也得到相同的结论. 很明显 ,要么第 2 个金属 4 不是 Fe , 这将引起不完整的配位环境 ;要么外来的 3 个配体不是水或其派生物. Mascharak 32 4 13 等人认为这种结构不可能存在, Maro ney和 Mo ura 也发表了同样的看法,并希望有更 高分辨率的解析结果. 4 更高分辨率单晶解析结果及 NiFe( CO) ( CN) 结构模型的提出 2 9 时隔一年 ,Volbeda 小组又报道了 01254 nm 单晶解析,这次结果首先确认第 2 个金属 - 就是 Fe ; 其二 ,认为与 Fe 配位的 3 个非内源性分子为三键的双原子分子 ,最可能是 CO ,CN - ) (和 NO 后通过其他分析方法认为这 3 个双分子为 1 个 CO ,2 个 CN ;其三 ,除 2 个内源性半 ( ) 胱氨酸残基 S 与 Ni , Fe 形成桥键外 ,还有 1 个 O 氧的类型还不能肯定也参与成桥 ,这样 Ni - () 为五配位的四方锥构型 见图 3 和图 4 所示;而 Fe 为六配位八面体构型 ,两个 S 与 2 个 CN 在赤道平面上 ,CO 和 O 占两极 ,认为 Fe 周围的强配场可导致 Fe 保持低自旋. 图 3 01254 nm D . gi gas Ni Fe Hase 图 4 01254 nm D . gi gas Ni Fe Hase 9异双核活性中心示意图 活性中心单晶结构图 ( ) Albrackt 等人也曾在研究 Ch rom at i u m v i nos u m 菌氢化酶后认为该酶存在着 FeCO CN 23 的配位结构,指出从完全还原状态的 Ch rom at i u m v i nos u m 酶 Mössbauer 谱观察到的孤立低 9 ,10 自旋铁离子信号来自于活性中心的铁原子. Volbeda 小组又兼用 F T IR 光谱与 EPR 光谱 方法对 D . gi gas 酶的各个状态进行了详细的研究 ,从酶状态变化时对应的 IR 谱旧峰逐渐消 失和新峰逐渐形成过程等 ,发现了 2 个 EPR 无法显示的新状态 ,由此认为在酶工作时存在 7 10 3 ,9 ,10 () ) ) ( ( 种状态包括 Fe ?至 Fe ?的价态变化. 在此基础上得出一个重要结论: 2 个 - ( ) CN 和 1 个 CO 也是活性中心必不可少的组成部分 ,并确定了 Ni FeCO CN的新型模型. 至 2 此镍铁氢化酶活性中心存在着 Ni Fe 异双核原子簇构型的观点得到了认同. 28 基于这种模型的模拟配合物的研究报道也相继出现 , 如 Darensbo urg 等人合成了 5η) ( ) () (( ) ) ( K - CHFe CNCO]模型化合物 见图 5,研究表明 Fe ?在以乙腈作溶剂时红外光 5 5 2 29 谱数据与酶的相关数据极为接近 ,为结构模型的成立提供了证据. Hsu 等人报道了第 1 种 - ?2 - ) ( ) ( ) ( ) ( ( ) 带有 CN 和 CO 配体的 Fe ?含硫配合物Fe PS3COCN ]见图 6在溶液中可逆 - 1 ) ( 氧化为 Fe ?的行为 , IR 表明经化学氧化后 CO 伸缩振动在 2 006 cm 处 ,而 CN 在 2 108 - 1- 1 ( cm 处 ,再经还原可引起 CO 伸缩振动有 102 cm 的变化 ; 然而 ,酶中状态变化时 Fo r m A , 9 , 10 - 1 ) Fo r m C , Fo r m R对应的 CO 变化仅为 50 cm ,因此 ,他们认为如果在酶中 Fe 发生了氧 化还原状态变化 , 应该在 IR 中显示出来. Mo ura 小组采用改进的 ENDO R 谱学方法对 27 ??D . gi gas Ni Fe 氢化酶进行了研究,结果发现只有 Ni2A 状态时存在Ni - Fe ] 的超精细耦 26 ( ) 合 ,而 Ni-B , Ni- C 则不存在. Pavlov 等人也采用 D F T densit y f unctio nal t heo ry量子化学方 法对 Ni Fe 氢化酶的可能作用机理进行了探讨. 528?2 - 29η) ( ) ( ) (K - CHFe CNCO]分子结构图 ( ) ( ) ( ) 图 55 5 2 图 6 Fe PS3COCN]分子结构图 5 有待进一步解决的问题 尽管已对 D . gi gas Ni Fe 氢化酶的活性中心结构下了初步的结论 ,但还面对着许多有待进 一步解释清楚的问题 ,归纳起来大致如下 : () ( ) 1这种模型必须要对早期的光谱学研究结果 包括 EPR , ENDO R , XA S , EXA FS 等有 个圆满的解释 ; - () 2CO ,CN 这些对细胞有毒的小分子为什么会在酶中存在 ,是原生的 、后期进入的 、还 是催化中的副产物 ; () 3为什么 Ni2A 状态有 Ni- Fe 的耦合作用 ,而 Ni-B , Ni- C 状态没有 ; () 4既然活性中心选择了 Ni Fe 异双核结构 , Fe 在氧还过程中又没有明显的价态变化 ,是 否测量手段方面存在问题 ; () 5 最 初 曾 认 为 D . gi gas , T . roseope rsici n a 等 与 Ni Fe Hases 和 D . bacul at us , D . des ul f u rica ns , C. v i nos u m 等 Ni FeSe Hases都 只 含 有 单 核 Ni 活 性 中 心 , 但 实 际 上 D . gi gas和 C . v i nos u m Ni Fe Hase的活性中心为异双核原子簇. 那么其他 Ni FeSe Hases ( ) 和Ni Fe Hases 是否也具有 Ni Fe 异双核原子簇的活性中心构型呢 ? 即 Ni FeCO CN 模型在 2 镍铁氢化酶活性中心结构是否普遍存在. 随着研究的深入 ,相信这些问题终将会得到解决 ,同时也将对吸收和放出 H机理 、控制 2 因素等有深入的了解 ,当然还需要生物和化学工作者的继续努力. 从目前发表的文章可见 ,还 没有与单晶解析结构活性中心部分完全吻合的模型化合物 ,这对我国从事生物无机 、配位化学 研究人员来说是个难得的机遇. 参 考 文 献 1 Adams M W W. The st ruct ure and mechanism of iro n- hydrogenases. Biochim Biop hys Acta , 1990 , 1020 : 115,1452 Albracht S P J . Intimate relatio nship s of t he large and t he small subunit s of all nickel hydrogenases wit h t wo unclear- enco ded subunit s of mitocho ndrial NAD H : U biquino ne o xido reductase . Biochim Biop hys Acta , 1993 , 1144 : 221,224 Hppe R P , Ro seboo m W , Plerlk A J , et al . Biological activit y of hydrogen . Nat ure , 1997 , 385 : 126 3 Maro ney M J . The role of nickel in hydrogenases : implicatio n fo r a hetero dinuclear active site . Co mment s Ino rg Chem , 1995 , 4 17 : 347,375 Adams M W W. The metabolism of hydrogen by ext remely t her mop hilic , sulf ur- dependent bacteria . F EMS Micro biol Rev , 5 1990 , 75 : 219,237 Co mmack R , Rao K K , Serra J , et al . The redo x p roperties of t he iro n- sulf ur cluster in hydrogenase f ro m Ch rom at i u m v i2 6 nos u m , St rain D. Biochimie , 1986 , 68 : 93,96 Cammack R. Nickel in metallop roteins. Adv Ino rg Chem , 1988 , 32 : 297,333 7 Volbeda A , Charo n M- H , Piras C , et al . , Crystal st ruct ure of t he nickel- Iro n hydrogenase f ro m Des ul tov i brio gi gas . Nat ure , 8 1995 , 373 : 580,587 Volbeda A , Garcin E , Piras C , et al . St ruct ure of t he Ni Fe h ydrogenase active site : evidence fo r biologically unco mmo n Fe ligands. J Am Chem Soc , 1996 , 118 : 12 989,12 996 9 de L acey A L , Hatchikian E C , Volbeda A , et al . Inf rared- spect roelect rochemical characterizatio n of t he Ni Fe h ydrogenase of Des ul f ov i brio gi gas . J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 7 181,7 189 10 Fo ntecilla- Camp s J C. The active site of Ni- Fe hydrogenases : mo del chemist ry and crystallograp hic result s. J Biol Ino rg Chem , 1996 , 1 : 91,98 11 Van der Spek T M , Arendsen A F , Happe R P , et al . Similarities in t he architect ure of t he active sites of Ni- hydrogenases and Fe- hydrogenases detected by means of inf rared spect ro scop y. Eur J Biochem , 1996 , 237 : 629,634 12 Gu Z , Do ng J , Allo m L B , et al . St rucut re of t he Ni sites in hydrogenase by X- ray abso rptio n spect ro scop y species variatio n and t he effect s of redo x poise . J Am Chem Soc , 1996 , 118 : 11 155,11 165 13 Davo ust C E , Doan P E , Hoff man B M . Q- band p ulsed elect ro n spin- echo spect ro meter and it s applicatio n to ENDOR and ES2 EEM . J Magn Reso n , 1996 , A119 : 38,44 14 ( ) J ames T L , Cai L , Muet terties M C , et al . Dihydrogen evolutio n by p roto natio n reactio ns of Nickel ?. Ino rg Chem , 1996 , 35 : 4 148,4 161 ( ) ( )L ai C H , Reibenspies J H , Darensbo urg M Y. Thiolate bridged nickel- iro n co mplexes co ntaining bot h iro n 0and iro n ? 15 carbo nyls. Angew Chem Int Ed Engle , 1996 , 35 : 2 390,2 393 ?/ ?Musie G , Far mer P J , Tunt ulani T , et al . Influence of sulf ur metalatio n o n t he accessibilit y of t he Ni co uple in N , N ′2 16 17 ) ( ) ( Bis 2- mrcaptoet hyl- 1 , 5- diazacyclo-octanato nickel ?: Insight into t he redo x p roperties of Ni Fe - h ydrogenase . Ino rgChem , 1996 , 35 : 2 176,2 183 ( ) ( ) Nguyen D H , Hsu H F , Millar M , et al . Nickel ?tiolate co mplex wit h carbo n mo no xide and it s Fe ?analo g : synt hetic 18 mo dels fo r CO adduct s of nickel- iro n- co ntaining enzymes. J Am Chem Soc , 1996 , 118 : 8 963,8 964 Hembere R T , Scot t McQueen J , Day V W. Co upling H2 to elect ro n t ransfer wit h a 17- elect ro n hetero bimetallic hydride : A 19 “Redo x Switch”mo del fo r t he H2- activating center of hydrogenase . J Am chem Soc , 1996 , 118 : 798,803 Hu Z G , Spangler E. Nat ure of t he C- Cluster in Ni- co ntaining carbo n mo no xide dehydrogenases. J Am Chem Soc , 1996 , 20 118 : 830,845 ( ) Miedaner A , Curtis C J , Wander S A , et al . Dicatio nic nickel ?carbo nyl co mplexes co ntaining tet radentate ligands. Organo metallics , 1996 , 15 : 5 185,5 190 21 Belinsky M . Hyperfine evidence of st ro ng do uble exchange in multimetallic { Fe S- Fe} active center of Escherichi a coli sul2 4 4 fite reductates. J Biol Ino rg Chem , 1996 , 1 : 186,188 22 Osterlo h F , Saak W , Haase D , et al . Synt hesis , X- ray st ruct ure and elect rochemical characterisatio n of a binuclear t hiolate bridged Ni- Fe- nit ro syl co mplex , related to t he active site of Ni Fe hydrogenase . J Chem Soc , Chem Co mmun , 1997 : 779 , 23 780 ?5n + (η) ( ) ( ) Delville- Desbois M H , Mro ss S , Ast ruc D , et al . 17- and 19- Elect ro n co mplexes Fe - CRSCNMeL n = 1 , 0: 5 522?5(η) ( ) elect ro nic st ruct ure and substit utio n and redo x chemist ry. fo r matio n of Fe - CRdtcand characterizatio n of bot h 5 52 24 17e and 19e states of a t ransitio n- metal co mplex . J Am Chem Soc , 1996 , 118 : 4 133,4 147 ( ) Goldman C M , Olmstead M M , Mascharak P K. Discrete mo no nuclear and dinuclear nickel ?co mplexes of alkane- and ( ( ( ) ) ) ( ) ( ) areneselenolates : synt heses , st ruct ures , and p roperties of Et N Ni Se CHSe , PhP Ni Se Ph , and 42 2 2 33 4 2 4 25 ( (μ( ( ) ) ( ) ) PhPNi 22 , 4 , 6- MeCHSe 2 , 4 , 6- MeCHSe] ?8CHCN . Ino rg Chem , 1996 , 35 : 2 752,2 757 4 2 2 36 22 36 24 3 Pavolv M , Siegbahn P E M , Blo mberg M R A , et al . Mecahanism of H- H activatio n by nickel- iro n hydrogenase . J Am Chem Soc , 1998 , 120 : 548,555 57 Huyet t J E , Carepo M , Pamplo na A , et al . Fe Q- band p ulsed ENDOR of t he hetero- dinuclear site of nickel hydrogenase : 26 co mpariso n of t he NiA , NiB , and NiC states. J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 9 291,9 292 Darensbo urg D J , Reibenspies J H , Chia- Huei L ai , et al . Analysis of an o rgano metallic iro n site mo del fo r t he hetero dimetallic 27 unit of Ni Fe h ydrogenase . J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 7 903,7 904 - Hua- Fen Hsu , Koch S A , Popescu C V , et al . Chemist ry of iro n t hiolate co mplexes wit h CN and CO . mo dels fo r t he 28 ( ) ( ) Fe COCN] st ruct ural unit in Ni- Fe hydrogenase enzymes. J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 8 371,8 372 2 ( ) Wen- Feng Liaw , Yih- Chern Ho rng , Der- Shiaw Ou , et al . Disto rted square planar Ni ?2chalcogenolate carbo nyl co mplexes 29 - ( ) ( ) ( ) ( ) Ni COSPhSe Ph] n = 0 , 1 , 2: relevance to t he nickel site in CO dehydrogenases and Ni FeSe H ydrogenase . n 3 - n J Am Chem Soc , 1997 , 119 : 9 299,9 300 30 Dunbar K R , Heintz R A. Chemist ry of t ransitio n metal cyanide co mpo unds : mo dern perspectives. Prog Ino rg Chem , 1997 , 45 : 283,391 31 ( ) Goldman C M , Mascharak P K. Reactio ns of Hwit h t he nickel site sof t he FeNi and FeNiSe h 32 ydrogenases : what do 2 t he mo del co mplexes suggest ? Co mment s Ino rg Chme , 1995 , 18 : 1,25 Bagyinka C , Whitehead J P , Maro ney M J . An X- ray abso rptio n spect ro scopic st udy of nickel redo x chemist ry in hydroge2 33 nase . J Am Chem Soc , 1993 , 115 : 3 576,3 585 Maro ney M J , Colpas G J , Bagyinka C , et al . EXA FS investigatio ns of t he Ni site in t hiocap sa ro seopersicina hydrogenase : 34 evidence fo r a novel Ni , Fe , S cluster . J Am Chem Soc , 1991 , 113 : 3 962,3 972 ( )1997212230 收稿 ,1998203220 收修改稿