实验七、转基因植物中报告基因

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实验七实验七转基因植物中报告基因转基因植物中报告基因实验七、实验七、转基因植物中报告基因转基因植物中报告基因 GUSGUS组织化学定位检测组织化学定位检测原理原理 GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β 葡萄糖苷酸酶是个水解酶以β 葡萄糖苷酸酯β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择种检测方法组织化学法分光光度可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法其中最为常用的是组织化学法。 • 组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷织化学法检测以溴氯吲哚 β 葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基底物的缓冲液浸若织细胞被转了基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将 X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧水解成产物是其初始产物氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到部位或位点现蓝色用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官组织，甚至单个细胞内的表达情况。本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱克隆拟南芥中的AK12基因的启动子插入到载体基因的上游的克隆位点（具体PBI101载体GUS基因的上游的克隆位点（具体图示如下）农杆菌转化转化拟南芥 AK12-pro RB LBNPT П GUS NOS-terNOS-ter35S-proRB LBNPT П GUS NOS-terNOS-ter35S-proRB LBNPT П GUS NOS-terNOS-ter35S-proRB LBNPT П GUS NOS-terNOS-ter35S-pro pBI101pBI101pBI101 本实验基本流程本实验基本流程拟南芥AK12-pro 种子萌发，长成幼苗取幼苗组织化学检测 -- GUS检测报告基因GUS的表达的检测报告基因GUS的表达的检测  材料：拟南芥AK12-pro 材料：拟南芥AK12 pro  试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7 0），加水至500ml，铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc，再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备用。  组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中； 3. 37℃浸泡过夜（或2-5h）；（晚上6：30继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；换一次75%乙醇脱色；肉眼或在解剖镜下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色出现蓝色。实验报告实验报告完成四次实验报告完成四次实验报告第5周： DNA浓度和纯度检测、 PCR产物和质粒的凝胶电泳检测（实验报告1）检测（实验报告1）第6周：质粒DNA的酶切及凝胶电泳检测 DNA片段的连接及凝胶电泳检测（实验报告2）第7周：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（实验报告3）第7周：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（实验报告3）第8、9周：Gus染色（实验报告4）

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