实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
【实验目的】
熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】
当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时,用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞,细胞膨胀成球形,可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态(感受态),处于此状态的细胞称为感受态细胞(competent cells)。此时,若在感受态细胞中加入质粒,则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞
表
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面,经过42℃短暂的热激处理后,DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞,在不含抗生素的培养基中短暂培养,使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达,在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌(含质粒)与未转化细菌分开,转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落,而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】
1.实验仪器培养箱,恒温摇床,超净工作台,低温台式离心机,分光光度计,水浴锅,高压灭菌锅,微孔滤器(含0.22μm滤膜),酒精灯
2.实验试剂氯化钠(AR),无水氯化钙(AR),蛋白胨,酵母提取物,1.0 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,琼脂粉,LB液体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,800 mL 蒸馏水溶解后,用NaOH溶液调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min; LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,800 mL蒸馏水溶解后,用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,然后加入琼脂粉15 g,121℃高压灭菌20min,分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基,当温度降至60℃左右时,加入1 mL氨苄青霉素溶液(100mg/mL),混匀,分别倒入无菌培养皿;CaCl2溶液:准确称取无水氯化钙11.1 g,用双蒸水溶解,并定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min,4℃保存;氨苄青霉素钠溶液:准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后,分装于Eppendorf管中,-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α,Pet-15b质粒
【实验步骤】
1.接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中,37℃振荡(约250r/min)培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中,37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4(约2 h)。
3.取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中,冰浴放置10~30 min,4℃,10000rpm离心30秒,弃上清。
4.沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮,冰浴放置15 min,4℃,10000rpm离心30秒,弃上清。
5.沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮,放置在冰浴中,制成大肠杆菌感受态细胞。
6. 取5 μL p-ET15b质粒(不超过10 ng),加入制好的感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30 min。
7. 42℃热激90 s后,迅速置于冰浴5 min。
8. 加入800 μL培养基,37℃振荡(100 r/min)温育1 h,使Pet-15b上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。
9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠(100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h,再倒置培养过夜至菌落清晰,统计菌落数量。
【注意事项】
1.应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞,OD600最好不超过0.4。
2.整个实验最好在低温环境下进行,以获得较高的转化效率。
3.每次悬浮沉淀细胞要轻缓,避免剧烈振荡。
【实验作业】
根据质粒的用量,计算本实验制备感受态的转化率(cfu/μg DNA)。
参考文献
1.卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社,1993. 287~289
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3.Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic
transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110 4. 魏群.分子生物学实验指导.北京:高等教育出版社,1999.53~55
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