罗氏地高辛说明书

罗氏地高辛 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标 记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交 1 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需 要准备的设备概要。 2 3 2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 应用 地高辛标记DNA探针可以用于:所有类型的滤膜杂交 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者DNA 超螺旋的DNA 实验时间 4 检测数量 一个试剂盒足够用于: 25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg; 并可以检测50张10×10cm2 的杂交膜。 质量控制 根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色显影检测。 试剂盒的储存和稳定性 未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15?到-25?(保质期印在标 签上)。在干冰中运输。 一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。 采用southern杂交从1μg人胎盘 DNA(经Bgl ?或EcoR?酶切)中检测到单拷贝基因。 5 3( 实验步骤和所需材料 3.1 在你开始前 主要的操作要求 此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示: 3.3 地高辛标记DNA 介绍 随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5×浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。 6 附加设备和所需试剂 水浴 冰水混合物 此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。 模板DNA:模板DNA所需特征: 如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。 为了从凝胶中分离DNA,你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒(the Agarose 7 Gel DNA Extraction Kit)进行大小在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。 这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的PCR产物纯化试剂盒(High Pure PCR Product Purification Kit)进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。 步骤 此步骤用于标记10ng-3μg DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA(最高达10μg)。 8 标记反应的产量 表1: 此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1μg DNA 作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。 1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实 (10个独立标记实验的平均值)。 3.4 标记效率的确定 介绍 地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。 实验原则 检测标记探针质量的好方法是直接检测法。 9 所需附加溶液的制备 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。 试剂盒工作溶液的制备 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法: 10 稀释系列 根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA(Vial 4)应该稀释到1ng/μL。利用第3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。 注意:表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。 按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。 11 操作步骤 下面的步骤描述的是直接检测。 注意:在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。 结果分析 比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA的量。如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照DNA的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。 3.5 DNA的转移和固定 转移方法和膜 凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验; 在实验中，在20×SSC中采用毛细管转移的方法将DNA转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。 12 注意:碱性转移(如在0.4M NaOH中)不适用于地高辛标记分子量marker的转移。 固定操作 将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作: 膜的储存 请根据下表选择膜的储存方法。 3.6杂交 需要的附加设备 DIG EASY Hyb 冰水浴 震荡水浴 或杂交炉 耐高温的塑料或者玻璃盒，培养皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋 注意:不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液 13 杂交温度 适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下: Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -(20,25?) 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25?。Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt(大约每1%的错配要降低1.4?)，同时相应的调整严谨洗涤步骤(即提高SSC浓度和降低洗涤温度)。 操作步骤 请参照下表进行实验。 杂交液的储存 含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25?，可以反复使用几次，在每次使用前需要68?新鲜变性10分钟。 14 注意:不可以将杂交液煮沸。 严谨洗涤 对于大部分DNA:DNA应用,用0.5×SSC进行严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说，正 确的洗涤条件应该依据经验来确定。 对于人基因组DNA，采用的条件是0.5×SSC，65?。 探针长度大于150bp且GC含量高时，应在68?下进行洗涤。 对于长度为100bp或更短的探针，洗涤温度应该降低。 此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。 3.7 免疫检测 需要附加的试剂 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲 液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。 试剂盒工作溶液的制备 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法: 15 操作步骤 此表描述了完成一张100cm2膜的免疫检测方法。 注意:所有的孵育均是在15-25?下，振荡完成的。如果膜还需要再次与探针杂交，那么 任何时候都不要让膜干。 16 3.8 DNA印记的洗脱和再次探针杂交 主要信息 印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP 能够更容易更有效的被洗 脱，以用于再一次的杂交实验。 所需附加的仪器和试剂 DMF 2×SSC 0.2N NaOH, 0.1% SDS 操作步骤 此操作描述的是膜的洗脱。 注意:如果 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。 洗脱后的膜需要的储存条件 一旦膜被洗脱，可以将膜放在马来酸缓冲液中或者2×SSC中准备再用。 5 附录 7.0，用水补足体积至1L。 17 18