【doc】解淀粉芽孢杆菌BF7658中性蛋白酶的生理作用
解淀粉芽孢杆菌BF7658中性蛋白酶的生理
作用
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一一析叶磕
解淀粉芽孢杆菌BF7658中性
蛋白酶的生理作用
耿运琪蒋如璋——一———一
(南开大学生物系,天津)-?7
ThePhysiologicalRoleofNeutralProtease inB.amyloliquefaciensBF7658
GengYunqi,JiangRuzhang
(Department0fBiology.NankaiUnvlersity,Tianjin) Ab$tract
Aneutralproteasedefectivestrain(Npr一),B.amyloliquefaciensBF7658npr:: Tn917,wasanisogeneicstrainofB.amyloliquefaclensBF7658(Npr),anoverpro—
ducerof一amylase.TheproductivityofNpr—stralnwasonlyonethirdofNpr strain.whentheyweregrowninthemediuminwhichthenativeproteinmaterial
(suchassoybeancakepowderortryptone)wasusedasnitrogensource.Buttwo
strainsproducethesameamountof一amylaseaftersoybeancakepowderwas partiallysubstitutedbycasaminoacid.Thisresultsuggestedthattheroleofneutral
proteasebeonlyasascavenger.
B.amyloliquefaciens能产生两种主要
的胞外蛋白酶——中性蛋白酶(Npr)和碱性
蛋白酶(Apr).长期以来对它们的生理功能
看法不一.有人认为与芽孢形成有关,
因为一些芽孢形成突变型往往同时也表现为
蛋白酶缺陷型.然而近年来通过基因
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
方
法由B.amyloliquefaciens得到的实验结 果,表明这两种胞外蛋白酶的主要功能与芽 孢形成无关.
一
0一
B.amyloliquefaciensBF7658是我国 工业上生产一淀粉酶的菌种,具有利用天然 有机氨源过量产生oz一淀粉酶的能力,因而是 检验其胞外蛋白酶生理功能的理想菌株.本 文报道了利用转座予Tn917插入诱变方法 获得的B.amyloliquefaciensBF7658中性 蛋白酶缺陷型菌株研究中性蛋白酶的作用, 结果表明该酶对细菌利用天然有机氮源过量 产生一淀粉酶是必需的.
材料和方法
一
,菌探,质粒和噬菌体
B.amyloliquefaciensBF7658由天津 酶制剂厂提供|B.amyloliquefaciensBF
7658npr::Tn917系本实验所分离的中性蛋 白酶缺陷型菌株|携带转座子Tn917的质粒 pTV32由南开大学分子生物研究所马生 武提供,噬菌体PBS1由中科院遗传研究所 提供.
二,培养基及其他试剂
PB培养基…用于噬菌体裂解液制备及 质粒转导j含4脱脂鲜牛奶的LB培养基… 用于蛋白酶缺陷型菌株的筛选,一淀粉酶发
酵基本堵养基成分为.豆饼粉4%,玉米粉 7%,Na2HPO4-12H2O0_8,(NH4)2SO4
0.4,CaCI20.2,pH自然.
蛋白胨为日本多胨j酪蛋白氮基酸 (Casaminoacid)和酪胨(Casitone)购自 美国Difco公司,胰胨(Tryptone)为英国 产品.
三,供体裂解液的{钶备和质粒转导 按Brainucci【及笔者改进的方法is 进行.
四,插入突变型的分离
按Youngman【.方法进行.
五,蛋白酶和一淀粉酶活力测定
按文献方法进行.
结果
一
,转座子Tng17的转座作用
有关pTV32通过噬菌体PBS1转导引入 B.amyloliquefaciensBF7658及转座作用, 另文发表I.随机挑取经温度诱导后得到的 500个红霉素抗性(Em)菌落点接合Cm (Sug/m1)的LB平板,其中493个菌落表型 为cm,对其中3个cmEm菌落进行质粒 检测【",均束发现质粒带,而在以同样方法 检测对照菌株时质粒带清晰可见(资料未列 出).这表明大约98的菌落的质粒已被消 除,转座子Tn917已整台到宿主染色体上. 转座频率约为l0,.
二,中性蛋白酶缺陷型的分离和鉴定
1.蛋白酶缺艏型的分离
将2140个高温诱导后产生的Em菌落 点接到含脱*鲜牛奶的LB平板上,37.C堵 养一定时问后观察蛋白水解圄.在培养l0小 时后观察,发现其中一个菌落周圄无水解圈. 继续培养至20zb时,该菌落周围亦出现小的 水解圈,而其他菌落则产生犬的水解圈.推 测该菌落为二种蛋白酶之一的缺陷型菌株. 2.蛋白酶缺陷型的鉴定
将蛋白酶缺陷型菌株接种LB液体培养 基,37.C摇床培养40/b时,离心,取上清液, 分别在加有中性蛋白酶抑制剂(EDTA)和碱 性蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的条 件下测定蛋白酶活力结果见表1. 表l蛋白酶缺陷型菌株的鉴定
中性蛋白酶活力碱性蛋白酵活力菌 株总酶括(u/m1)(u/m1)(u/m1) (PMSF)?(EDTA)@
?lPMSF终浓度为5raM.
?EDTA终浓度为50raM.
上述结果表明,蛋白酶缺陷型菌株为中 性蛋白酶缺陷型(Npr一),定名为amyloli— q~efacienaBF7658npr:;Tn917由于完全 无中性蛋白酶活性,而且碱性蛋白酶的活性 也只有野生型菌株的大约1/3,因而预期会 影响该菌株对天然有机氮源的利用而在表现 型上与野生型有区别.
三,不同有机氮源对B.amylolique—
faciensBF7658npr::Tn917一淀粉酶发 酵的影响
分别将B.amy1o1iquefaciensBF7658
的等基因菌株Npr和Npr一接种不同有机 氮源发酵培养基,37.c往复摇床培养52小时, 测定一淀粉酶活力,结果见表2.
表2B.amyloliquefaciensBF7658等基最菌株Npr和Npr一
在不同有机氮源条件下一淀粉酶的发酵水平 l豆饼粉4288lO3
2豆饼粉2
酪胨(Casitone)2288l64 328895豆饼粉2
胰胨(Tryptone)2
4288288豆饼粉2
酪蛋白氮基酸(Casaminoacid)2 ?除有机氮诱【外基础培养基成分相同. @t表中数据为两次重复结果.
结果表明,当以豆饼粉为有机氨源或以 豆饼粉加骧胨为混合氮源时Npr一菌株的一 淀粉酶产量只有Npr菌株的J/3,但Npr- 菌株的一淀粉酶产量下降并不是一因多效现 象.因为当以酪蛋白氨基酸代替部分豆饼粉 作为有机氮源时,Npr一菌株的产酶能力便 与Npr菌株无区别.而酪蛋白氮基酸正是 酪蛋白的完全水解产物.由此可见,在发酵 中期以前胞外蛋白酶对菌体正常生长是很重 要的.只有在细菌细胞能有效地分解和利用 天然有机氨源并生长正常的情况下,一淀粉
酶的发酵过程才能正常.
讨论
B.amylollquefaciensBF7658能产生
中性蛋白酶和碱性蛋白酶并分泌到胞外.前 者主要是在营养生长期产生的,因而使我们 一
8一
有可能在乎板上分离得到Npr一单一蛋白酶 缺陷型菌株
B.amyloliqueiaclensBF7658nprl:
Tn917是非渗漏型中性蛋白酶缺路型菌株. 有趣的是该菌株碱性蛋白酶水平也同时下降 了74.这应当是一种一因多效现象据文 献报道碱性蛋白酶基因表达是由a37因子促 成的[11,因而应在芽孢形成期开始表达.而 由牛奶平板上蛋白质水解圈出现的时间判 断,中性蛋白酶属于营养期表达的胞外酶. 由此看来,如果确有多教性的话,那/厶它必 定是由一种未知的中间因子介导实现的. 如果两种胞外蛋白酶都与细胞形态和孢 子形成无关】,那么它们的生理功能就只 能是起水解胞外多肽类物质为菌体生长提供 营养的作用.本研究为这一推测提供了证 据.Npr,菌体尽管能产生碱性蛋白酶,但 因其合成时间太晚不能及时为菌体生长提供
营养,最终影响了一淀粉酶的产量.酪蛋白 氮基酸的作用就在于补充了生长中前期可利 用氮源的不足,弥补了中性蛋白酶缺陷而使
发酵趋于正常本文结果至少说明在以天然
有机氮源作培养基时,Npr一菌株不能作为
一
淀粉酶生产菌,至于NprApr一菌株能否
有效地利用有机氮源,有待于实验证明.
参考文献
[1]Hoch,J-.eta1.IAdv.Genet,,18l69 ——
98(1976)
[2]PJggot.P.J,
——
962(1976)
[3]Yang.M.Y
一
2l(1984)
etal,;Bact.Rev..40I908
[4]KawKmura.F.andDoi.R.H.,J.Bact. ,/,
甚i蚺如4
i消息}}'
160I442——44{(1g84)
[5]Perkins,J.B,andP.J.Youngman Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A..83l140 ——
144(1986)
[6]Bramucci.M,G,eta1}J.Bact.,127t 829——831(1976)
7]Maniatis,T,eta1.1MolecularCloning, ALaboratoryManfl~ll,,?oldSpringHarbor Laboratory.(1982)
[8]耿运琪等.南开大学(自然科学版),3tg5 ——
99(19g0)
[e]Y~ungmKa,P.J,eta1.;Proc.Nail?
Acad.Sci,U,S.A.,80I2305——2309
(1983)
[1O]张树政;酶制剂工业,科学出版社(1984) [11]Wong,S.L.eta1.:Proc.Nat1.Acad-
Sci.U.S.A..81l1184——1188(1984) 大型牧场粪便处理和沼气集中供气工程通过验收 由上海市工业微生物研究所提供技术工 艺,负责调试,上海市农场局建筑设计所负 责工程设计的国内最大的大型奶牛场粪便处 理和沼气集中供气工程,于1992年9月29日 在上海星火农场,通过由市农委主持的工程 验收.
工程占地226亩,厌氧塔总容积2700m., 单体窑积450m.(为上海之最).工程采用了 先进的二步发酵工艺,厌氧发酵塔内配有良 好的滥流,排污及防堵塞系统,运行稳定, 安全,可靠.日处理2000余头奶牛粪便约90 吨,经30N35.C中温发释,产气率高达1.5m /m..d月平均达1.2m./m.d以上.较普通
厌氧装置提高产气率一倍以上.所产沼气已 供2800余户居民的生活用气.各项技术,工 程,经济指标均达到或超过了设计要求. 针对沼气废液造成的二次污染,工程增
加了独特的后处理工艺装置,经离心分离的 稆渣制成人工土壤介质,用于花术,果蔬的
种植,清液经过l8亩水生植物的漫流处理, COD可在350mg/L以下,最低为58mg/L, 达到排放
标准
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.(李是)
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