水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法

水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法 报 西 南 农 业 大 学 学 第 21 卷第 4 期 V o l. 21, N o. 4 1999 年 8 月J o u rn a l o f So u thw e s t A g r icu ltu ra l U n ive r s ity A u g. 1999 () 文章编号: 1000- 2642 199904- 0324- 04 α 水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法 黄爱缨, 吴珍龄 () 西南农业大学 农学系, 重庆 400716 (摘要: 以水稻幼苗的叶片为材料, 用 0. 2 的磷酸缓冲液 含 1 6. 2 ƒƒm o lL pH mm o l () ) 22, 5% 的水溶性 作为谷胱甘肽过氧化物酶 2的提取介 L ED TA N aPV P GSH P x () 质, 偏磷酸为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 二硫代对二硝基苯甲酸 与 D TN B GSH 显色反应 3 , 在 412 测定酶管和非酶管的 值, 以测定谷胱甘肽过氧化m in nm OD 物酶的活性。 关 键 词: 稻苗; 2酶活性; GSH P x+ 文献标识码: A 中图分类号: 554. 6 Q D E T ERM IN A T IO N O F GL U TA T H IO N E P ERO X IDA SE IN R IC E SE EDL IN GS HUA NG A i- y in g, W U Zhen - l in g (, D ep a r tm en t o f A g ro nom ySo u thw e st A g r icu ltu ra l ), 400716, U n ive r sityC ho n gq in g C h in a ()6. 2 0. 2 1 22 A bstra c t: In th e p re sen t exp e r im en t, M PB S pHco n ta in in g mM ED TA N a5% 2 an d PV P w a s show n to b e su itab le fo r th e ex t rac t io n o f GSH P x in th e leave s o f r ice , . seed lin g san d H PO 3 w a s a goo d p ro te in p rec ip itan t in en zym e reac t io n sT h e ac t iv ity o f () 22GSH P x co u ld b e ca lcu la ted b y de te rm in in g th e op t ica l den sity OD o f th e en zym etu b e 2412 5 an d th e no n en zym etu b e a t nm o f w ave len g th af te r GSH h ad reac ted w ith D TN B fo r .m in u te s : ; 2, Key word sr ice seed lin g sGSH P x en zym e ac t ir ity ) (是 等 1957 年在动物细胞中发现 1. 11. 1. 9谷胱甘肽过氧化物酶 2, M ills GSH P x EC 的, 是一种自由基捕获剂。人们普遍认为它是哺乳动物体内的含硒酶, 对动物中 2研 GSH P x 究较多而对植物体中的 2研究甚少。虽然近年来已有人从部分植物中 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到该酶的 GSH P x 活性, 但对植物 2的提取和测定方法尚未见报道。该文以稻苗为材料, 对 2的GSH P x GSH P x α 收稿日期: 1998- 09- 14 ( ) 作者简介: 黄爱缨 1970- , 女, 四川成都人, 西南农业大学讲师, 从事生物化学研究。 提取和测定方法进行了探索。 材料和方法1 以水稻品种花213 催芽后 7 天的幼苗叶片为试材, 参照北京军事医学科学院提供的 1, 2 2测定试剂盒和荣征星等的直接测定法, 结合植物材料的特点作适当改变。GSH P x 1. 1 测定原理 (() ) 谷胱甘肽过氧化物酶 2可使过氧化物 如 , 等还原为相应的氧化 GSH P x H 2O 2 ROO H 物: 2GSH P x 2O 2 + H 2 GSH GSSG+ 2 H 2O 2 GSH P x 2 GSH + ROO H GSSG + RO H + H 2O 2的活力可用单位时间内催化 氧化的减少量表示。 可和二硫代对二 GSH P x GSH GSH () 硝基苯甲酸 反应生成黄色的 52硫2222 硝基苯甲酸阴离子, 在 412 处有最大光吸 D TN B nm 收, 测定该离子的浓度, 即可计算出 减少的量。GSH COO H - COO H COO H S N O 2 + +H + GSH + GSS N O 2 N O 2 - S S N O 2 COO H ()52硫222硝基苯甲酸阴离子 黄色 D TN B 由于上述反应在非酶条件下仍能进行, 故计算酶活力时, 必须扣除非酶反应所引起的 减少量。GSH 1. 2 试剂的配制 () 迭氮钠2磷酸缓冲液 2ƒ, 0. 2 ƒ2 . , 2. 5 7. 0: N aN a3 PB SpHmm o lL N aN 3 mm o lL ED TA 2N a, 0. 2 m o lL N a2H PO 4 和 0. 2 m o lL N aH 2 PO 4。 ƒƒ 偏磷酸沉淀液: 含 1. 67% 3 , 0. 05% 22, 28% 。 b. H PO ED TA N aN aC l. () c0. 61 ƒ三氯乙酸 。m o lL T CA . d0. 32 。ƒm o lL N a2H PO 4 . () e1. 0 溶液 当日配制: 3. 07 用 2溶解至 10 。ƒmm o lL GSH m g GSH N aN 3 PB S m l.f () 1. 5 当日配制: 取 30% 15 以双蒸水定容至 100 。ƒ, mm o lL H 2O 2 H 2O 2 Λlm l () g. 显色液 冰箱中可保存一月: 20 加 1% 柠檬酸三钠 50 溶解。D TN B D TN B m g m l 1. 3 GSH 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的制作 表 1 标准液的配制 GSH ()GSH Λm o lL ƒ ()试剂 m l0 20 40 60 80 100 0 0. 05 0. 1 0. 15 0. 2 0. 25 1. 0 mm o lL GSH ƒ 1. 67% 偏磷酸沉淀液 2. 0 2. 0 2. 0 2. 0 2. 0 2. 0 双蒸水 0. 5 0. 45 0. 4 0. 35 0. 3 0. 25 取上述标液 1. 6 m l, 加 0. 32 m o lƒL N a2H PO 4 2. 0 m l 和 D TN B 0. 4 m l, 显色 5 m in , 于 412 比色, 同双蒸水调零。 以 值为纵坐标, 浓度为横坐标, 制标准曲线。nm OD GSH 1. 4 酶液的提取 ( 取新鲜水稻幼苗叶片 1 , 加入 0. 2 磷酸缓冲液 含 1 22, 5%ƒƒgm o lL mm o lL ED TA N a ) 冰浴中研磨成匀浆, 4000 离心 10 , 取上清液于 6. 210 , ƒ的 水溶性 PV P , pH m lrm in m in 12000 rm in 离心 5 m in , 取上清液供酶活力测定用。 ƒ 1. 5 酶活力测定 取上述酶液各 0. 4 , 分别注于酶管和非酶管中, 并将非酶管加热使酶失活, 分别加入m l 1. 0 和经 37?预热的 1. 5 0. 2 , 立即于 37?下反应 3 ƒ0. 4 ƒmm o lL GSH m l mm o lL H 2O 2 m l , 再在 2 支试管中加入 1. 67% 的偏磷酸沉淀液 4. 0 , 2000 离心 10 , 保留上ƒm in m lrm in m in 清液。另取 2 支试管分别加入上述清液 2. 0 ; 再取 1 支试管加双蒸水 0. 4 和 1. 67% 的 m lm l 偏磷酸沉淀液 1. 6 作为空白管, 并在这 3 支试管中各加入 0. 32 2. 5 ƒm l m o lL N a2H PO 4 m l 和 反应 5 , 在 412 处比色读取 值。0. 5 , D TN B m lm in nm OD 按下式进行计算: ( ) 非酶管 O D 412 - 酶管 O D 412 ×A ×6. 25() 组织 2活力 = GSH P x U () ()5 m in ×1 m l 样液中蛋白质 m g () ) (A = 标准 GSH Λm 标准 GSH OD 412 , 即标准曲线的斜率 ƒ () 酶活力单位 , 1= 1 ƒ蛋白质?。U U GSH Λm o lm g m in 2 结果与讨论 2. 1 提取介质的选择 植物细胞中往往含有一些金属离子和酚类物质, 故在缓冲液中加入螯合剂 22ED TA N a 和以降低 和 除 去 金 属 和 酚 类 对 酶 促 反 应 的 影 响。试 验 中 选 择 了 含 有 和 不 含2PV P ED TA 2N a 及 PV P 的磷酸缓冲液, 并在不同的 pH 条件下进行测定。结果表明, 两种不同成分的缓 时, 酶活性最高, 在不同成分的缓冲液中, 又以含有 6. 2 冲液均为 pH 5. 8, 6. 7 尤其是 pH 22和 的 磷 酸 缓 冲 液 的 2活 性 更 高, 故 以 含 22和 水 溶 性 ED TA N a PV P GSH P x ED TA N a () , 6. 2 的 0. 2 ƒ磷酸缓冲液 为酶的提取介质。PV P pH m o lL PB S 2. 2 蛋白质沉淀剂的选择 () 测定 2活性常用偏磷酸 作为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 其配制较为复 GSH P x H PO 3 2 () 杂, 荣征星等人曾采用三氯乙酸 代替 。 该试验对两种沉淀剂进行了比较, 表T CA H PO 3 () 明在相同条件下, 采用 3 作沉淀剂的酶活性比 高 19%, 53% 图 2。故选用 3H PO T CA H PO 作沉淀剂。 测定波长的选择2. 3 1, 2 前人报道, 选择了 400 nm , 412 nm , 420 nm , 423 nm , 430 nm 进行比色测定表明, 非 酶管和酶管 2的 值分别为 0. 325,GSH P x OD 0. 328 和 0. 185, 0. 198, 其波长均可作为适宜 波长。其中, 412 处测定酶管和非酶管的nm OD 值都最大, 分别为 0. 201 和 0. 340, 故以 412 nm 为测定波长。 2. 4 显色时间的选择 阴离子显色不仅与反应体 系 中 的D TN B + 浓度有关, 还受反 应 时 间 限 制。 该 试 验 对H 412 处, 每隔 1 酶管和非酶管的 值 nm m in OD 测定表明, 3, 6 内的 值较高, 其中显m in OD 值 下 色 5 m in 后 OD 值 最 高, 6 m in 以 后 OD 降。 参考文献: 1 徐辉碧. 生物微量元素—— 硒 [M . 武汉: 华中工学院出版社, 1983. 100, 102. 生物化学与生物物理 2 荣征星, 刘慧中, 鲍景奇等. 小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶的微量测定法 [.J () 进展, 1994, 21 4: 362, 366.