阿托伐他汀的降血压作用及其机制实验研究

· 882· 生堡全 医堂 旦笙 鲞箜_9 chinese Journal of General Practice，September 2008，Vo1．6，No．9 阿托伐他汀的降血压作用及其机制实验研究 谢晓竞，杨解人 ，王安才 【全科基础研究】 【摘 要1 目的 观察阿托伐他汀对自发性高血压大鼠(SHR)血压的影响，并通过其对血管紧张素Ⅱl型(AT )受体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响探讨其调节血压的机制。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 将 24只16周雄性 SHR随机分为4组：SHR对照组，阿托伐他汀50 mg剂量 组[50 mg／(kg·d)]，阿托伐他汀 l0 mg剂量组[10 mg／(kg·d)]，缬沙坦组[20 mg／(kg·d)]，灌 胃给药共6周。在给 药前和给药后，每2周采用尾袖法测量大鼠尾动脉收缩压(SBP)，化学比色法检测大鼠主动脉活性氧(ROS)浓度；免疫 组织化学法和原位杂交法检测 AT 受体蛋白和 mRNA表达。结果 实验前 SHR各组 SBP无差异，但显著高于 WKY组 (P<0．o1)；给药后 4，6周，50 mg剂量组 SBP明显下降(P<0．01)，10 mg剂量组 SBP无明显变化；自给药后2周缬沙坦 组SBP逐渐下降(P<0．o1)。SHR对照组血清 ROS水平显著高于 WKY组(P<0．o1)；用药6周后 ，50 mg剂量组血清 ROS水平明显降低(P<0．05)。SHR对照组心肌 AT 受体蛋白阳性表达明显高于 WKY组(P<0．o1)，50 mg剂量组 AT 受体蛋白阳性表达明显减少，平均光密度值显著降低(P<0．01)。SHR对照组AT 受体mRNA表达明显高于WKY 组(P<0．o1)，50 mg剂量组 AT 受体 mRNA表达下调，平均光密度值显著降低(P<0．o1)：结论 阿托伐他汀可降低 SHR的血压，下调 SHR心肌细胞 AT 受体表达，减少ROS生成，改善血管内皮功能而发挥降低血压的作用。 【关键词1 阿托伐他汀；自发性高血压大鼠；血压；血管紧张素 l型受体；活性氧 【中图分类号1 R972．6 R544．1 【文献标识码1 A 【文章编号1 1672—1764(2008)0943882433 Effect of Atrovastatin on Blood Pressure by Regulating Expression of ATl Receptor in Spontaneously Hypertension Rats X／E Xiao—Jing，YANG e—Fen，WANGAn—cai．Department ofEndocrinology，the First Hospital ofNanjing，Affiliate to Nan— ring Medicaf University．Jiangsu 210006， ina 【Abstract】Objective To investigate the effect of atorvastatin on blood pressure in spontaneously hypertensive rats(SHR)and to explore its potential mechanism via the effects of atorvastatin on expression of angiotensin type 1(AT】)receptor．Methods Sixteen—week old male SHR(n=24)were randomly divided into four groups(n=6，each)：(1)SHR control group；(2)50 mg atorvastatin group[50 ms／(kg·d)]；(3110 mg atorvastatin group[10 mg／(kg·d)]；(4)valsartan group[20 m (kg·d)]． Systolic blood pressure(SBP)was assessed with the tail—cuff method before and 6 weeks after treatment with atorvastatin，blood samples were taken for the determination of reactive oxygen species(ROS)levels in serum by chemistry．colorimetry．The loealiza— tion of AT】receptor protein in myocardium was investigated by immunohistochemistric assays．The level of AT】receptor mRNA expression was detected by in situ hybridization．Results SBP was significantly decreased in 50 mg atorvastatin group at 4 weeks and 6 weeks(P<0．01)and was not influenced in 10 mg atorvastatin group．Serum ROS level in SHR control group was signifi— cantly higher than that in WKY group(P<0．o1)．There was a significantly reduction in serum ROS level in 50 mg atorvastatin group after 6 weeks(P<0．05)．The expression of ATl receptor protein in 50 mg atorvastatin group was significantly decreased and average light density value was diminished too(P<0．o1)．The result showed that both the expression of AT receptor mRNA and average light density value were diminished in 50 mg atorvastatin group(P<0．01)．Conclusions Atorvastatin caused a sig— nificant reduction of blood pressure in SHR．It down—regulates AT】receptor expression of myocardium cell that leads to reduced production of ROS．It is infered that the reduction of blood pressure with atorvastatin be caused by downregulation of AT1 receptor expression and improvement of endothelial dysfunction． 【Key words】 Atorvastatin；Spontaneously hypertensive rats；Blood pressure；Angiotensin type 1 receptor 他汀类药物不仅具有调脂作用，近年来临床观察发现，伴 有高血压的高胆固醇血症患者经他汀类药物治疗后，患者的血 压均有一定幅度下降，其降压机制众说纷云，如调脂作用、内皮 稳定功能、抗氧化作用等，但其调节血压的细胞分子机制不 作者单位：210006江苏省南京医科大学附属南京第一医院内分泌科(谢 晓竞)；241000安徽省芜湖市皖南医学院药理学系 (杨解 人)；241001皖南医学院附属弋矶山医院心内科(王安才) 详。为了排除血脂异常对血压的影响，本研究选择 自发性高血 压大 鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)，一 种无脂 质紊乱 的高血压动物模型作为研究对象，观察阿托伐他汀对 SHR血压 的影响，通过检测它对AT 受体表达的影响，探讨阿托伐他汀 调节血压的可能机制。 1 资料与方法 1．1 药物、试剂与仪器 阿托伐他汀(Atorvastatin)片剂(辉瑞 院、美国的新港安宁院、中国上海的南汇护理院、中国北京市松 堂关怀院等。这些医院都有比较完善的医疗护理设施，人员配 备齐全，照护技术专业化、规范化，组织管理科学，能行使其独 立的职能。 3．2．2 普通医院内的临终关怀病 区或病房 有条件的综合十牛 医院、肿瘤医院或老年病院内建立的临终关怀病区或病房，配 备必要的设施和固定的专业工作人员，专门为癌症晚期、疾病 末期及衰老病危的老年人提供临终关怀服务，如台北荣民总医 院和天津第二医院开设的“安宁病房”等。 3．2．3 居家临终关怀服务 以社区为基础 ，以家庭为单位开 展的临终关怀服务。可以由临终关怀的学术组织(如基金会、 防癌协会等)联合医院、社区卫生保健机构共同协作提供；也可 由社区保健网络和各医院的临终关怀组织独立推出“居家服 务”。服务内容包括：医生和护士的巡诊、治疗、护理、心理支持 以及自愿者给予的生活照料等。(待续 2008年第6卷第 10 期 ) ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华全科医学 2008年 9月第 6卷 第 9期 Chinese Jouma!of General Practice，September 2008，Vo1．6，No．9 制药有限公司惠赠)，缬沙坦(Valsartan)胶囊(诺华制药有限公 司生产)。活性氧检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，即 用型免疫组化染色试剂盒，兔抗 AT。受体蛋白，生物素化山羊 抗兔 IgG，链霉亲和素 一生物素 一过氧化物酶复合物(SABC)和 抗原修复液；原位杂交试剂盒，预杂交液，A Tl寡核苷酸探针杂 交液，封闭液，生物素化鼠抗地高辛和 DAB显色试剂盒(武汉 博士德生物工程公司)。 1．2 实验动 物、分 组及 处 理 SHR和 Wistar—Kyoto大 鼠 (WKY)均 16周龄、雄性 、体重(293±20)g(购自中科院上海实 验动物中心)。SHR 24只，随机分为4组：阿托伐他汀50 mg剂 量组[50 mg／(kg·d)]、10 mg剂量组[10 mg／(kg·d)]、缬沙 坦组[20 mg／(kg·d)]和SHR对照组。另选同周龄雄性 WKY 大鼠6只作为正常血压对照组。药物充分研碎，用 0．5％阿拉 伯胶浆溶解混匀，按 10 ml／kg(1．0 ml／lO0 g)容量灌 胃给药 ，1 次／d，连续给药6周。取左心室游离壁心肌组织 2 mm ，10％福 尔马林固定，用于免疫组化检测；浸入 4％多聚甲醛(含 1／1 000 DEPC水)，用于原位杂交检测。 1．3 血压测量及血清活性氧 (reactive oxygen species，ROS)检 测 分别于给药前及给药后 2，4，6周采用尾袖法测量大 鼠安 静清醒状态下尾动脉收缩压，每只鼠连续测量收缩压 3次 ，取 其平均值。给药 6周后 ，25％乌拉坦(1．0 g／kg)腹腔注射麻醉， 腹主动脉取血，用化学比色法检测 ROS活性。 1．4 免疫组化法检测心肌细胞 A Tl受体蛋白表达，原位杂交 法检测心肌细胞 AT 受体mRNA表达 按试剂盒说明操作 ，免 疫组化结果判定：正常心肌细胞呈淡蓝色，呈黄至棕黄色为阳 性结果；原位杂交结果判定 ：心肌细胞胞浆内出现黄至棕黄色 颗粒为阳性。半定量分析 ：运用显微计算机图象分析系统对心 肌细胞A Tl受体染色强度进行分析，200倍视野下观察 100个 细胞，检测积分光密度值 ，取其平均值作统计学分析。 1．5 统计学处理 采用 SPSS 10．0软件包进行统计学分析，计 量资料以( ±s)表示，采用单因素方差分析，多均数间两两 比 较用 q检验。 2 结果 2．1 阿托伐他汀对 SHR收缩压的影响 SHR组血压显著高 于 WKY组(P<0．O1)。与 SHR对照组相 比，50 mg剂量组在 4，6周SBP明显下降(P<0．O1)，10 mg剂量组 SBP无明显改变 (P>0．05)，两剂量组之间差异有统计学意义(P<0．05，P< 0．O1)；缬沙坦组在给药后 2，4，6周 SBP均 明显下 降 (P< 0．O1)，见表 1。 表 l 阿托伐他汀对 SHR收缩压的影响(x-I-s，n：6) 注：与WKY组比较， P<0．0l；与 SHR对照组比较， P<0．01；与 50 mg剂量组 比较， P<0．01， P<0．05；与缬沙坦组 比较，‘P< 0．01；与治疗前(0周)比较 ，0P<0．0l，口0P<0．05，1 mm Hg=0．133 kPa。 2．2 阿托伐他汀对 SHR血清 ROS水平的影响 SHR对照组 血清ROS活性显著高于WKY组[(566．73±85．14)U／ml vs (158．58±51．6o)U／ml，P<0．01]。与SHR对照组相比，50 mg 剂量组[(386．98±136．4)U／ml VS(566．73±85．14)U／ml，P · 883· <0．05]和缬沙坦组[(320．87±90．64)U／ml vs(566．73± 85．14)U／ml，P<0．01]，血清 ROS水平明显降低，10 mg剂量 组血清 ROS水平虽有下降，但差异无统计学意义[(486．64± 117．12)U／ml vs(566．73±85．14)U／ml，P>0．05]。血清 ROS水平在50 mg剂量组和缬沙坦组间差异无统计学意义(P >0．05)。 2．3 阿托伐他汀对 SHR AT 受体蛋白表达的影响 SHR对照 组棕黄色颗粒密布于胞浆 内，染色较深 ，阳性表达部分融合成 片(图1，见封三)；50 mg剂量组阳性表达明显减少，染色略浅 (图 2，见封三)；缬沙坦组 阳性表达散在分布 (图 3，见封三)。 半定量分析结果显示 ：SHR对照组 AT 受体平均光密度值显著 高于 WKY组 (P<0．01)。与 SHR对照组相比，50 mg剂量组和 缬沙坦组 AT 受体平均光密度值下降显著(P<0．01)，尤以缬 沙坦组下降明显，见表 2。 表 2 阿托伐他汀对 AT。受体表达的影响( -I-s，n=6) 组别 ATl受体蛋白表达(0D) ATl受体mRNA表达(0D) 注：与 WKY组比较， P<0．01；与 SHR对照组比较， P<0．0l；与 50 mg剂量组比较， P<0．0l；与缬沙坦组比较，‘P<0．01。 2．4 阿托伐他汀对 SHR AT 受体 mRNA表达的影响 SHR 对照组染色较深，阳性表达弥漫分布(图 4，见封三)；50 mg剂 量组阳性表达明显减少 ，染色变浅，较稀疏 (图 5，见封三)；缬 沙坦组阳性表达范围局限，染色浅而稀疏 (图 6，见封三)。半 定量分析结果示：SHR对照组 AT mRNA平均光密度值显著高 于 WKY组(P<0．01)；50 mg剂量组和缬沙坦组 AT 受体 mR． NA平均光密度值明显降低(P<0．01)，其中缬沙坦组降低尤其 明显，与50 mg剂量组比较，差异有统计学意义 (P<0．01)；阿 托伐他汀两剂量组间比较，差异有统计学意义(P<0．01)，见表 2。 3 讨论 本实验首先观察阿托伐他汀降压效果，实验结果显示：阿 托伐他汀治疗第2周后即见收缩压下降，第4和第 6周收缩压 进一步下降，与SHR对照组相比，差异有统计学意义，说明阿托 伐他汀在无血脂异常的大鼠中确实有降压作用；缬沙坦是 AT． 受体拮抗剂，以此药作为阳性对照，实验显示缬沙坦可显著降 低 SHR的血压，心肌 AT 受体表达显著下调，且较阿托伐他汀 组显著。 高血压发病机制复杂多样，有血脂异常、血管内皮功能紊 乱 渖p经内分泌系统的紊乱 和肾素血管紧张素系统异常等。 1980年，Alexander等 发现血管紧张素 Ⅱ引起血管收缩有可 变性，进一步的研究发现 AT 受体的激活受到血管紧张素Ⅱ负 反馈调节。在动物实验中，低密度脂蛋白可显著上调 AT，受体 mRNA和蛋白质表达水平 ；高脂饮食所致的动脉粥样硬化大 鼠以及遗传性高脂血症大鼠其 A Tl受体表达量增加2倍 ]， 血管壁对血管紧张素Ⅱ的敏感性增强，动脉壁超氧化物生成增 加，而且这些异常都可通过阻断 A Tl受体而得以纠正；同样在 高脂血症患者的心肌细胞中也发现A Tl受体表达量增加2—3 倍 ，血管紧张素Ⅱ和血管紧张素转化酶(angiotensin conveting enzyme，ACE)也升高 ，他汀类药物治疗 6周后其表达量下 调，而血脂水平并未见降低。AT。受体拮抗剂可改善内皮功能， 维普资讯 http://www.cqvip.com · 884· 中华全科医学 2008年 9月第 6卷 第 9期 Chinese Joumal of General Practice，September 2008。Vo1．6，No．9 活性氧减少，以上实验结果也在非血脂紊乱的自发性高血压大 鼠和体外培养的血管平滑肌细胞中得到证实 ，很显然，他 汀类药物具有多种药物作用机制，AT 受体可能是诸多因素共 同作用的分子开关。 AT受体主要有 AT 和 AT 两种亚型，大多数血管紧张素 Ⅱ效应都是通过作用于 AT 受体来实现的，因此 AT 受体数 目 决定了血管紧张素 Ⅱ的生物学效应，AT 受体调节方式有4种： 第 ，血管紧张素 Ⅱ激活受体诱导受体结合蛋白的内在化，并 减少细胞表面的受体数；第二，血管紧张素 Ⅱ的刺激时问延长 可通过蛋白激酶 c依赖性通道减少血管紧张素Ⅱ量，此称为脱 敏；第三．AT 受体 mRNA的不同剪切方式影响 AT 受体蛋 白 的翻译 ；第四，最重要的调节机制是基因表达的调节。Ichiki 等 ” 发现西立伐他汀和氟伐他汀可下调血管平滑肌细胞(vas． cular smooth muscle cells，VSMC)中 ATI mRNA表达量，而普伐 他汀无此作用。Wassmann等 的实验结果显示，阿托伐他汀 可呈时间和浓度依赖方式下调 AT mRNA表达水平。本研究 分别采用免疫组化和原位杂交方法在基因转录水平和蛋 白质 表达水平上对 AT 受体进行了深入研究，结果显示：阿托伐他 汀下调 AT 受体 mRNA和蛋白质表达。 近年研究显示，ROS合成释放增加和／或清除减少在高血 压和动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要作用，尤其是 血管紧张素 Ⅱ诱导的高血压 几乎都 依赖于 ROS生成 和释 放⋯ 。血管紧张素 Ⅱ通过激活 AT 受体引起 ROS生成增多， 导致 NO生物利用度下降，这不仅促使血管内皮功能失调的发 展 ，而且加速 VSMC的生长，促进血管收缩及损害，最终促使高 血压的发生和发展 。Wassmann等 研究表明阿托伐他汀 在降低 AT 受体 mRNA水平的同时，抑制了血管紧张素 Ⅱ介导 的ROS的生成，本实验观察到 SHR对照组血清 ROS水平明显 高于 WKY组 ，阿托伐他汀可明显降低 SHR血清 ROS水平。 总之 ，本实验显示阿托伐他汀可下调 AT 受体表达 减少 ROS生成，降低 Ang I1生物学效应而发挥降低血压作用。 参考文献 [1] Gunther S，Gimbrone MA Jr，Alexander RW．Regulation by angiotensin Ⅱ0f its receptors in resistance blood vessels[J]．Nature，1980，287： 230．232． [2] Nickenig G，Sachinidis A，Michhelsen F，et a1．Upregulation of vascular angiotensin II receptor gene expression by low-density lipoprotein in vascular smooth muscle cells[J]．Circulation，1997，95：473-478． [3] Nickenig G，Jung O，Strehlow K，et a1．Hyperch0lestemlemia is associ- ated with enhanced angiotensin ATl—receptor expression[J]．Am J Ph ． vsiol，1997，272：2701-2707． [4] Warnhohz A，Nickenig G，Schulz E，et a1．Increased NADH．oxidase mediated superoxide production in the early stages of atherosclemsis： evidence for involvement of the renin 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中华护理学会山西分会主办。在职称晋升中属省级刊物。连续两年被评定为山西省一级(优秀)期刊，被中国核心期刊(遴选)数 据库、中国生物医学期刊文献数据库收录。主要栏目：论著、综述、基础护理、临床护理、护理改革、继续教育等栏目，欢迎广大护理 工作者踊跃投稿。 投稿方式：1．启用稿件远程处理系统，网址：wg,q,v．suo1．cn凡网上投稿者，首先登录本网站，注册登陆，按照提示即可完成投稿过程。 2．E-mail：jiatinghushi@vip．163．con 3．来稿请寄：山西省太原市广场收投分局 1号信箱《家庭护士》编辑部收 邮编：030001 电话 ：0351—7230748(注：每周二、四下午为电话查询稿件时间)。 《家庭护士》杂志推出继续医学教育园地，完成 2008年全年继续教育园地答 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，可获得 2类继续教育学分 10分(从邮局订阅杂 志的订户需交纳工本费30元)-。(上甸 30元，中旬 30元，下旬 30元) 《家庭护士》杂志为旬刊，每期定价7．00元 ，上、下旬版通过邮局订阅，邮发代号：22—118(原邮发代号 22—229)，全国各地邮 局均可订阅，中旬版可直接从编辑部订购(免邮费)。 家庭护士杂志意见建议热线：0351—6685858 维普资讯 http://www.cqvip.com (见 正 文 883 页 ) 鬻 图 1 S H R 对照 组 A T l受体蛋 白表达 ( X 200 ) 图4 S H R 对 照组 A T l受体m R N A 表 达 ( × 200 ) (见 正 文 9 07 页 ) 图 1 胃体 内的打火机 { 0 。 。 j： ≯ ∥ ’ ∥ t ‘ 鳓渤夕莲獬锡’ 图5 阿托伐他~ - J - 50 mg剂量 组 A T l 受体m R N A 表达 ( X 200 ) 图2 取 出后 的打火机 E t4 取 出后 的扁 平 骨 ， 边缘锋利 E 15 食道 中段竹 筷 (见 正 文 9 7 2页 ) ． 图 1 肠 系膜淋 巴 结肿大 警 # ， # j ， t 《 々 _ X ‘ ? ‘ 【 1． ’ I． ’ j 。、：● 0 《 0 图3 缬沙坦 组 A T l受体蛋 白表达 ( x 200 ) 图6 缬沙坦 组 A T I 受体 m R NA 表达 ( X 200 ) 图3 食道 中段嵌顿的扁平骨 ， 边缘锋利 图6 取 出食道后 的竹筷 图2 肠幂膜肿大淋 巴 结的cD F I声像 图 ， 其 内可 见 少量 血 流信 号 ? 维普资讯 http://www.cqvip.com