【doc】人输卵管细胞对精子存活的影响

【doc】人输卵管细胞对精子存活的影响 人输卵管细胞对精子存活的影响 ? 222?生殖医学杂志2002年8月第11卷第4期 人输卵管细胞对精子存活的影响 周寒鹰.,姚元庆,尹国武,黄飞,杨瑛,罗亚宁 (1.第四军医大学唐都医院妇产科,西安710038;2.陕西省妇幼保健院,西安710003) 【摘要】目的:研究人输卵管细胞对精子存活的影响.方法:人精子与人输卵管细胞 进行体外共培养,并以Earle’S平衡盐液培养的精子作为对照.每日观察精子存活情况,并 以伊红染色 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 精子的存活率.结果:在共培养组,人精子存活时间明显高于对照组(P< 0.01).共培养组精子在9,24,48h的存活率分别为(90.82?1.94)oA,(71.46?6.19), (46.64?5.59);高于对照组相应时间的存活率 (83.554-_5.36),(46.464-_4.59), (18.36?4.11),差异显着(P均<O.01).结论:人输卵管细胞及其培养液能延长精子的 存活时间. 【关键词】人输卵管细胞;精子;共培养;存活率 【中图分类号]R321.2【文献标识码】A【文章编号】 3845(2002)04—0222—04 1004— Effectofhumanoviductalcellsonspermviability ZHOUtJan—ying,YAOYuan—qing-YINGUO—WU HUANGFei,YANGYing,LUOYa—ning Department(}Obstettics.@necology,7angduHospital, ‘heFourthMilitaryMedicalUniversity.Xi’an710038 [Abstract] Objective:Toinvestigatetheeffectofhumanoviductalcellsonviabilityofhu man spermatozoainvitro. Methods:HumanspermswereCO—culturedwithhumanoviductalcellsinvitro.HU— manspermatozoaculturedwithEarle’Smediumwereusedascontro1.Spermviability wasobserveddailyandevaluatedbyEosinstaining. Results:Co—culturedspermssurvivedfor(7.33?1.86)days.Thespermatozoal survivaldurationinCO—culturedgroupswassignificantlylongerthanthatincontrol groups(P<0.01).TheviabilitypercentagesinCO—culturedgroupswere( 90.82-+- 1.94),(71.46?6.19),and(46.64?5.59)at9,24,48hrsrespectively.Thecot一 【收稿日期12002—02—18;【修同日期12002—03—18 【作者简介】周寒鹰(197o,),女,重庆市人,硕士,主治医师,从事妇产 科及生殖医学专业 生殖医学杂志2002年8月第11卷第4期 在NSL动物,输卵管是配子输送,储存,受 精及早期胚胎发育的微环境.精子可以在输卵 管内存活数小时到几天,_1j.在这一期间,输卵 管细胞和精子可能互相作用,从而影响精子的 授精功能.研究发现,动物输卵管细胞对精子的 存活,获能,运动,顶体反应,精卵融 合等功能有影响.有关人输卵管细胞对精子 及早期胚胎发育的影响的研究较少一.本实验 通过建立人输卵管细胞与精子体外共培养模 型,观察人输卵管细胞对精子存活的影响. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 一 ,人输卵管细胞的培养 在输卵管结扎术或全子宫切除术时取部分 正常输卵管,解剖显微镜下纵向切开,撕下粘膜 上皮,磷酸缓冲液(PBS)冲洗,剪碎,移人离心 管.加入5ml0.05胰蛋白酶/0.53mmol/L 二乙烯四乙酸二钠(EDTA)混合液(美国GIb— CO公司),37C振荡消化45min.PBS液离心冲 洗两遍终止胰蛋白酶的作用后,加入5ml培养 液.培养液为DMEM/F12(美国Gibco公司), 外加碳酸氢钠1.2g/L,青霉素G0.006g/L, 链霉素0.0075g/L,及15胎牛血清(FBS). 接种于四孔培养板(丹麦Nunc公司),37C, 5CO孵箱中培养.24h观察细胞贴壁情况, 每48h更换培养液.待细胞汇合生长达70% 时,即可进行共培养实验. 二,精子的采集和处理 精液标本来源于我院不育症门诊就诊患者 的丈夫,手淫取精,符合世界卫生组织正常 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的精液].精液完全液化后,通过上游法或Per— eoll法分离精浆和精子.获得的精子用改良的 Earle’S平衡盐液离心洗涤两遍待用.其改良的 平衡盐液为:Earle’S平衡盐溶液(EBSS,Sigma 公司)外加牛血清白蛋白(BSA)0.3g/L(华美 公司),丙酮酸钠0.0033g/I,青霉素G0.006 g/L,链霉素0.0075g/1,碳酸氢钠0.22g/I (Sigma公司).本研究共采集13份精液标本, 经处理后与人输卵管细胞进行共培养. 三,输卵管细胞与精子共培养 四孔培养板内的人输卵管细胞在37C, 5CO:孵箱中培养达到70汇合时,用 EBSS/BSA洗两遍.每孔加入3×10精子和1 m1EBSS/BSA共培养.共培养9,24,48h后, 将含精子的培养液轻轻吹打使之混匀,分别移 入离心管,加入新鲜的EBSS/BSA清洗后重新 悬浮,待检.对照组为无输卵管细胞的四孔培养 板内加入3×10精子和1mlEBSS/BSA进行 培养. 四,精子存活检测 1.精子最长存活时间:每日取出培养皿, 相差显微镜下观察精子的运动,判断精子的存 活情况.当95精子死亡时停止观察. 2.精子存活染色:取201精子悬液滴于 载玻片上,加20ffl0.5伊红充分混匀,盖上 盖玻片,显微镜下观察并计数. 五,统计学方法 结果以均数?标准差(?), 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示采用t 检验和方差 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 . 结果 95的精子死亡在共培养组为(7.33? 1.86)d,而对照组为(3.O0?1.27)d,两组比 较有明显差异(P<0.01).其中共培养组精子 存活最长时间为10d,对照组则仅为5d.精子 与人输卵管细胞共培养或在EBSS/BSA中培 养9,24,48h后的存活率如表1所示,随着培 养时间的增加,两组的精子存活率均逐渐下降. 但在上述各时点,共培养组精子存活率显着高 于对照组(P<0.01). 讨论 在哺乳动物,输卵管为配子输送,储存,受 精及早期胚胎发育提供了微环境.受精过程包 括了精子的获能,运动,顶体反应,精子透明带 结合,精卵融合.上述过程都发生在输卵管内. 生殖医学杂志2002年8月第l1卷第4期 表1精子与人输卵管细胞共培养后不同时点精子存活率(?) 注:与对照组比较,P<O.O1 研究输卵管对精子影响,对于理解受精及体内 微环境对受精的影响具有一定的理论意义,对 于体外受精和胚胎早期培养则有潜在的应用价 值. 以往动物实验发现,输卵管细胞能延长精 子的存活时间l2],诱导精子获能和顶体反 应],增强精子运动],促进精子透明带附着 和精卵结合].本研究结果显示,人输卵管细胞 在体外可延长人精子的存活.我们发现,与输卵 管共培养的精子在48h内的存活率明显高于 普通培养液培养的精子.此外,共培养精子 959/6死亡时间平均为(7.33?1.86)d,最长存活 时间为10d.而对照组精子959/6死亡时间仅为 (3.O0?1.27)d,最长存活时间也只有5d,均 较共培养组短.文献[1叩报道,排卵前6d的精子 仍可导致怀孕.这一临床观察与我们的实验研 究结果相符. 输卵管细胞体外培养的建立使精子与输卵 管的相互作用的研究成为可能l1”].在有或无 共培养时可直接比较精子功能.采用体外共培 养方法避免了人输卵管生殖生理研究的伦理问 题.我们通过这一个体外模型的研究结果可以 推测实际的生殖生理过程.当然,由于是体外实 验,对结果的分析仍须十分谨慎.在以往的研究 中,输卵管单细胞层培养,组织培养和细胞悬液 都已用作共培养研究.我们认为,单细胞层培养 比其他方法具有方法简单,细胞可低温保存,减 少其他类型细胞影响等优点.因此,本实验采用 了输卵管单细胞层共培养研究人输卵管细胞对 精子存活的影响. 输卵管有可能通过两种机制影响精子存 活:细胞间粘附和细胞分泌.扫描电镜研究显 示,精子通过顶体周围的细胞膜粘附于输卵管 细胞u.这种粘附由糖基,岩藻糖及精子质膜 的一些成分调节[1.动物实验表明,动物精子 可以在输卵管内存活12,26h,精子通过与输 卵管上皮的粘附来延长存活时间.观察发现,在 输卵管腔内有2,22的精子存活,与输卵 管内膜表面粘附的精子有16,37存活,粘 附于输卵管内膜皱襞里的精子有51%,69% 存活.还有研究显示,分离出来的动物输卵管细 胞膜可以延长精子存活达48h.但精子与 兔肾脏细胞膜共培养12h后,精子存活明显下 降].这意味着膜接触在维持精子存活上的重 要性,而输卵管细胞膜的这种作用似乎是有细 胞类型特异性的.在人类,Bongso等[1.报道, 精子疏松地附着于体外培养的输卵管细胞. Pacey等u则观察到人精子粘附于人输卵管培 养组织. 除精子粘附外,输卵管细胞通过分泌输卵 管素(oviductin)作用于精子,延长精子存活时 间,这一作用呈剂量依赖性.Oviductin是输 卵管上皮细胞合成和分泌的一种输卵管特异性 的高度糖酰化的高分子量糖蛋白到.已在仓 鼠,小鼠,大鼠,兔,羊,猪,牛,狒狒及人输卵管 内发现了这种蛋白质的存在[2,曾被命名为雌 激素依赖性糖蛋白,雌激素相关糖蛋白或输卵 管特异性糖蛋白等.为简化命名,目前统称为输 卵管素.从cDNA估计输卵管素核心蛋白的 分子量约60,70×10.(kD).近年的研究发 现,输卵管素影响精子的获能,运动,顶体反应, 透明带附着及体外受精等. 【参考文献】 [1]HunterRHF(ed).Thefallopiantubes[M].Springer Berlin.1988.65—73. 生殖医学杂志2002年8月第11卷第4期 [2]SmithTT,NothnickWB.Roleofdirectcontactbe— tweenspermatozoaandoviductalepithelialcellsin [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] [11] [12] [13] [14] [15] [16] maintainingrabbitspermviability[J].BiolReprod, 1997,56(4):83—89. LefebvreR,SuarezSS.Effectofcapacitationonbull spermbindingtohomologousoviductalepitheliuml,J]. BiolReprod,1996,54(3):575—582. ChianRC,SirardMA.Fertilizingabilityofbovine spermatozoacocuhuredwithoviductepithelialcells _J].BiolReprod,1995,52(1):156—162. 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