家蚕性连锁平衡致死系ZW易位染色体片段的定位及功能基因的分析

家蚕性连锁平衡致死系ZW易位染色体片段的定位及功能基因的分析 家蚕性连锁平衡致死系ZW易位染色体片段的定位及功 能基因的分析 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 家蚕性连锁平衡致死系Z^W易位染色 体片段的定位及功能基因的分析 指导教师姓名、职称: 耋蟹痘硒究旦一 申请学位级别: .亟?硒塞生 学科专业: 动堑堂 培养单位: 逝堑垣菹太堂丝堂皇生金型堂堂院 论文提交时间: 2Q!!:垒:2.论文答辩时间: 2Q!!:?:12 学位授予单位与日期:???? 答辩委员会主席: 论文评阅人:一 ????一?? 一 0 l???r‘?,r, l DissertationforMaster MAPPINGOFZ^WTRANSLOCATIONHROMOSOME FRAGMENTANDANALYSIS0FUNCTIoNALGE ES INTHESEX.LINKEDBALANCEDLETHAL SILKWORMST AIN April2011 Candidate:ZhuangLi Supervisor:Pro.MengZhiqi Discipline:Zoology CollegeofChemistry&LifeScience, ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004 摘要 家蚕性连锁平衡致死系Z“W易位染色体片段的定位及功能基因的 分析 摘 要 家蚕性连锁平衡致死系是前苏联科学家Strunnikov院士等利用辐照诱变 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 育成 的。其特点是:雄蚕的两个Z染色体上各诱导一个非等位又紧密连锁的致死基因lz1ethal gene1,Ii或乃1ethalgene2,乃。雌蚕的W染色体上有两个易位片段,一个是来自 10号常染色体的片段,其中含有显性卵色基因+w2,可以掩盖10号染色体上的卵色突 变基因142,雌卵为黑色,而雄卵为白色。另一个是来自Z染色体的带有+OS显性性状 的片段,可掩盖致死基因,j的致死作用,在品系内自交时,雌、雄各有一半致 死。根据 上述特点,本课题利用SSR分子标记对家蚕性连锁平衡致死系Z“W易位片段进行研究 分析,为揭示家蚕性连锁平衡致死系分子调控机理提供理论依据。 本研究的内容与结果:根据家蚕P50Z染色体OS标记附近的基因组序列,共设计 563对特异性SSR引物,以家蚕平衡致死系2品系雌母本和野蚕品系雄父本为 亲本,进行分子标记筛选,结果共获得124对多态性标记;通过对杂交Fl代雌虫检测, 初步筛选到26个标记在Fl代雌虫表现为双带。再通过对回交BCl代包括雄蛾和雌蛾 进行遗传验证,发现其中的5个标记表现限性遗传特性,与W染色体连锁,说明这些 位于家蚕Z染色体末端的标记易位到了W染色体上,它们是Bmscar72.2、 Bm?scar72-32、Bm?scaf72?37、Bm?scaf72-45、Bm?scaf72?55。Bm?scar72?2至0 Bmscar72.55区域位于Z染色体末端,长约0.48Mb。经验证,我们发现Bmscar72.87 标记不具易位特点,推测Bmscaf72.87标记后没有发生易位。易位位点可能位于 Bmscar72.55与Bmscar72?87之间长约0.32Mb的范围内。为了全面分析易 位片段相 关基因,我们将标记Bmscar72.55到Bmscaf72.87也纳入候选基因分析区域。 进一步,应用生物信息学方法,对Bmscar72.2到Bmscar72.87间长约O.8Mb的 区域中的功能基因进行分析。此区域中可能包含G蛋白转导因子、周期调节 因子、免 摘 要 疫相关的OCIAD蛋白、PAR结构域蛋白、氨基酸转运蛋白、嗅觉感受器受体 蛋白、氯 离子通道蛋白、H.ATP合酶以及苯丙氨酸羟化酶等功能蛋白,这些蛋白对家 蚕生命体活 动起着关键的作用。 关键词:生物信息学,家蚕,SSR标记,z染色体 脚PINGOFZ“WTRANSLOCATIONCHR MOSOME FRAGMENTANDANALYSISOFFUNCTIONALGE ESINTHE SEX?LINKEDBALANCEDLETHALSILKWORMST AIN ABSTRACT Sex?linkedbalancedl thalSLBLsilkwormstrainwasbredbyStnmnikovwith irradiationin1975.ThemalesoftheSLBLstrainhastwonon.allelicrecessi vegen s1ethaI gene1,liandlethalgene2, 易.ThetwogenesarelocatedontwodifferentZcllromosomes andcaused athatembryostage.Thereartwotranslocatedfragmentso theWchromosome. OnefragmentwasfromlOthchromosomecontainingtheggcolourgene+w2,whichcaIl coverupthewhiteeggcolourmutationw2.TheotherWasonefromtheZchromosome. whichonteinsthe+OSgenethatcallcompensatetheOS1arvalskintranslucentmutationand rescuethelethaleffectofIiontheZChromosome.InthSLBLstrain,thefemaleeggsill"e blackandthemaleeggsarewhite,whichcouldhelpUStodistinguishthesexofsilkwom duringtheggstage.Halfofthemaleandfemaleembyroeswilldieduringthembyrostage duetotheIiand易,respectively.Inpr sentresearch,thesimplesequencerepeatsSSRwere employedasatooltoanalyzetheZ“Wtranslocationfragmentstoprovideatheoreticalbasis formolecularregulationmechanismsintheSLBLstrain. Theresultsareasfollows:563pairofSSRprimersweredesignedbasedonthe conservedsequenceofZchromosomeneartoosofP50strain,andusetodetectinghe polymorphicmarkersbetweentheSLBLstrainfemaleparent,P1andthewildsiu、?om strainmaleparent,P2.124markersshowedpolymorphicbetweentheparents.TheFland BC1 generationweremadeusingPi asfemaleparentandP2asmaleparent.Thefemalemo吐lS ofFlandbothfemaleandmalemothsofBClwereusedforselectingheW-linkedmarkers. 26SSRmarkerswereamplifiedw thdouble-bandsamongthefemalemothsofFlgeneration III 摘要 andwereusedforselectinghesex-limitedinh ritantmarkersintheBC,.5SSRpolymorphic lociwerelinkedwithWc11romosomeincludingBm_scaf72?2,Bm_scaf72-32,Bm_scaf72?37, Bmscaf72.45andBmscaf72.55 ItindicateSthatthesemarkerSwerelocatedontheZ“W translocationsegmem.ThelengthbetweenBm?scar72-2andBm?scaf72?55isabout0.48Mb. WhileBm?scar72-87markerhasnosex-limitedinh ritedcharacterinF1 andBCI generation. Thetranslocationsitewaslocatedb tweenBm?scaf72-55andBm?scaf72-87about0.32Mb. ThefunctionofthegenesinthetranslocationrangebetweemBm?scar72?2and Bm?scaf72?87wereanalyzedbybioinformaticsethods.Andthelengthbetween Bm?scar72?2andBm?scar72-87isaboutO.8Mb.Theresultsshowedthatsomeimportant genesplayingthekeyroleinbiologicalactivitywerecontainedamongtheseregions, includingG-proteinsignalingmodulator,cyclelikefa tor,ociadprotein,PAR-domainprotein, aminoacidtransporter,olfactoryreceptor-likeeceptor,cl?channelprotein,I-i+transporting ATPsynthase,andphe ylalaninehydroxylases. KEYWORDS:Bioinformatics,Silkworm,SSRpolymorphicmarker,Zc11romosome 目 录 目 录 摘要??jI ABSTRACT........................................................................................................III 目 录??I 1.文献综述??..1 1.1SSR分子遗传标记及其在家蚕中的应用??..1 1.1.1分子标记概述??.1 ’- _o? 1.1.2分子标记的优点??l 1.1.3SSR分子标记技术?2 1.1.4SSR分子标记在家蚕中的应用?..3 1.1.4。l遗传图谱构建.3 1.1。4.2基因定位??.4 1.1.4.3亲缘关系及遗传多样性分析的研究4 1.1.4.4DNA指纹技术及分子标记辅助育种5 1.1.5展望5 1.2家蚕基因组研究?6 1.2.1家蚕分子遗传图谱构建?.6 1.2.2家蚕基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ?..7 1.2.3家蚕的Z染色体连锁基因的相关研究?8 2.引 言..11 目 录 2.1研究背景和意义11 2.2研究内容?13 2.2.1引物设计?13 2.2.2筛选两亲本间的多态性标记??13 2.2.3多态性标记的遗传分析?13 2.2.4易位片段功能基因的分析14 2.3技术路线.14 3.实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 、设计与方法??15 3.1实验材料.15 3.1.1供试材料?15 3.1.2品种组配?l5 3.2主要仪器、试剂.16 3.2.1主要仪器?16 3.2.2主要试剂?l6 3.3实验设计l6 3-3.1引物设计?l6 3.3.2亲本间多态性标记的筛选17 3.3.3亲本杂交后代F1代的遗传分析.17 3.3.4回交一代BCl的遗传分析??..17 3.3.5F1代双带型标记的克隆验证??.18 3.3.6利用生物信息学分析功能基因?18 3.4实验方法?18 II 目 录 3.4.1雌雄蛾基因组DNA的提取??18 3.4.2PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测19 3.4.3PCR产物回收、克隆测序19 3.4.4利用生物信息学方法分析功能基因?..19 4.结 果??.20 4.1两亲本间多态性SSR标记的筛选?..20 4.2Fl代遗传分析?.20 4.3W染色体遗传验证??21 4.3.1BCl代遗传稳定性的验证分析?21 4.3.2Fl代雌双带型标记的克隆验证?2l 4.4功能基因的生物信息学分析?23 4.4.1Goloeo基因25 4.4.2Bmcyc基因26 4.4.3Ociad基因.26 4.4.4心厂基因?.27 4.4.5Aat基因?.28 4.4.6Or3基因?.30 4.4.7Cl-ehannel基因??31 4.4.8H-atps基因31 4.4.9Pah基因?.3l 5.讨仑??..33 5.1SSR多态性标记的筛选及遗传验证?33 III L目 录 5.2功能基因的分析.33 5.3小结?..36 参考文献.37 附录??44 附录1:家蚕Z染色体Scaf.26与Scaf.72中SSR标记引物?..44 附录2:常用试剂配制??57 附录3:Fl代双带型标记?57 附录4:FI代双带型差异条带特异性引物序列?58 攻读学位期间发表的学术论文.59 致 谢??.60 IV 文献综述 1.文献综述 1.1SSR分子遗传标记及其在家蚕中的应用 19世纪后半叶,孟德尔遗传规律的发现,为生物遗传的研究及应用开辟了一 条新 的道路。随后,细胞标记、生化标记以及分子标记等相继出现,推动了整个生 物遗传学 的发展,特别是近阶段分子标记的快速发展并在不同的领域的广泛应用,加 快了生物遗 传机制研究的步伐。本章节主要概述了分子标记的种类及特点,着重阐述了 SSR分子 标记的特点及其在家蚕中的应用。 1.1.1分子标记概述 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义分子标记是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA片段,即DNA标记【1,21。一般所指的分子标记都是指DNA标记。分子标记是从 DNA水平上直接反应DNA序列差异的技术手段,数量丰富且多态性高。 至今,研究人员己开发了多种分子标记,包括一类基于杂交的标记技术,如限制性 长度片段多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP【3】;一类基于PCR 的标记技术,如扩增片段长度多态性 AmplifieFragmentLengthPolymorphism,AFLP HI、随机扩增多态性DNARandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPDf5】、简单重 复序列SimpleSequenceRepeat,SSR、加锚微卫星寡核苷酸Inter-simpleSequence Repeat,ISSR【6】等;其他,如单核苷酸多态性SimpleNucleotidePo ymorphism,SNP 世 。f1-o 1.1.2分子标记的优点 形态标记、细胞标记和生化标记都是对遗传物质间接的反映,它们较易受到环境等 文献综述 各种因素的影响【7】,缺乏稳定性,操作繁琐费时且材料比较受限制。与形态标记、细胞 标记和生化标记相比较,分子标记是一种较理想的遗传标记。它具有以下优点:1数 量丰富,遍及整个基因组:2检测方便,可对不同发育时期、不同组织部位进行检测, 无组织特异性,不受基因表达与否的限制,不受环境等条件的影响;3样品需求量少; 4表现“中性”,即无基因多效性;5多态性高;6许多分子标记表现为共显性 遗传;7信息量大,遗传稳定;8检测快速,简便经济。 基于分子标记的这些优点,分子标记技术己成为遗传学、育种学、物种起源与进化 等研究领域中常用的技术手段之一,并且在应用研究中不断地受到更新、改良。 1.1.3SSR分子标记技术 简单序列重复simplesequencerepeat,SSR又叫微卫星microsatellite或短 串联 重复序列Shomtrandemrepeat,STR,是一类建立在PCR基础上的分子标记。SSR是 以2.5个碱基为重复单位串联而成的长约几十个碱基的序列,其两侧是相对保守的单拷 贝序列。SSR广泛的分布在真核生物基因组中,约占真核基因组的6%,大约每10.50 碱基就会出现一个SSR位点【8】。SSR形成的原因一般认为是DNA复制过程中碱基的滑 动、错配或是有丝分裂、减数分裂过程中染色体间发生不均等交换造成的。 相比较其他分子标记,SSR是一种较为稳定、特异的分子标记,自问世以来,得到 了广泛的关注以及开展了大量的应用研究。SSR标记的特点体现在:1在真核生物基 因组中SSR资源丰富,在各染色体中分布均匀,并且是唯一一个在着丝粒区域附近分 布的分子标记【9】;2SSR标记是基于简单的PCR技术的分子标记,操作简单,应用灵 活;3对样品的需求量少,且由于PCR反应的灵敏性,对样品DNA的质量要求不高; 4SSR位点重复的次数和程度存在差异大,多态性高,但重复单位的突变率较小,大 约仅为0.5x10.4-5.0x104,遗传稳定【8】;5共显性,符合孟德尔遗传;6每个PCR扩 增片段表示这一位点上的一个等位基因,有研究显示,SSR标记相比较其他的分子标记, 所揭示的的等位基因数目较多【10】;7带型直观,分析简单,便于观察和 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 ;8SSR 标记的特异性强,可用作构建DNA指纹图谱以及品种分类鉴定【11-13】;9结果重复性 好。 但是,SSR标记技术需要知道重复序列两侧的DNA序列的信息,如果无法利用DNA 2 文献综述 数据库中数据,则必须先建立含SSR的基因组文库,进行克隆、测序,然后再设计合适 的引物。此步骤的工作量较大且繁琐f141。 1.1.4SSR分子标记在家蚕中的应用 家蚕Bombyxmori属鳞翅目Lepidoptera昆虫,该目为昆虫纲中仅次于鞘翅 目的第2个大目。家蚕分布范围极广,它不仅是一种重要的经济昆虫,是丝绸原料的主 要来源,在社会农业经济中占有重要地位;而且还是昆虫科学实验的重要模式生物,在 各类研究中被广泛地应用。家蚕染色体数目n28,2n56,是雌杂合型昆虫,其性染色 体表现为雌体ZW,雄体ZZ。 目前,随着分子标记技术的R趋成熟,在家蚕的研究中,各种分子标记在构建遗传 图谱、基因定位等方面均发挥了其作用特点,其中SSR标记也以其高效、稳定等特点, 迅速的发展起来,在家蚕构建遗传连锁图谱、基因定位、遗传多样性分析、品种鉴定、 种质资源保存、分子标记辅助育种等研究领域得到了广泛的应用,成为最常用一种分子 标记之一。 1.1.4.1遗传图谱构建 遗传图谱geneticmap又称连锁图谱1inkagemap,是以两个位点的交换率为 图距来表示多态性标记在染色体上的排列位置的图谱ll纠。 分子连锁图谱是由分子标记构建的遗传图谱,它具有多态性高、数量多、稳定可靠 的特点,分子标记已成为遗传图谱构建的主要手段之一。高密度的分子连锁图谱是基因 定位、图位克隆、寻找与表型性状紧密连锁标记及进行分子辅助育种等的有力工具,是 遗传学、育种学、物种起源及进化研究的坚实基础f旧。 目前,已有多种家蚕分子标记遗传图谱公布,并已经把部分基因定位在图谱上。第 一张家蚕分子连锁图谱是I扫Goldsmith等【17】构建的I疆LP连锁图谱,包含T60个I心LP标 记。随后,各类分子标记遗传图谱迅速的发展起来,SSR因其多态性高、共显性、重复 性好等特点也成为了构建连锁图的主力标记之一,在许多经济作物和一些模式研究生物 中都利用SSR构建了分子连锁图谱,为辅助育种、遗传研究、基因克隆等工作创造了条 件。 文献综述 2005年,Miao等118】用大造、c108为试材,构建了包含518个SSR标记的家蚕遗传图 谱,分布在家蚕28条连锁群上,图谱总长度为3431.9cM,相邻两标记间的平均距离为 6.63cM。同年,Prasad等分析了家蚕中198个微卫星的频率和分布,并用36对多态性SSR 标汜对13个家蚕品系进行了多态性分析,构建了包含8个连锁群的SSR图谱【19】。 1.1.4.2基因定位 利用分子标记的进行基因定位是基因定位克隆和辅助育种的重要前提,利用 分子标 记可筛选出与目的基因连锁的标记。其中,SSR标记多态性高且在染色体中分布均匀, 是基因定位的理想标记,是一类高效、可靠的分子标记,在基因定位中得到了广泛的应 用。 在家蚕基因定位研究中,白会钗刚等利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分 析,筛选到3个位于12连锁群上的SSR标记与耐氟基因连锁。李霞等【2l】利用家蚕雌性不 发生交换的特点,将黄血抑制基因Yellowinhibitor,J定位于第9连锁群中,筛选出 S0904、S0905和S0906三个与I基因连锁的SSR标记,其中S0904与廛因连锁最为紧密, 图距为7.4cM。杨晓博等五利用SSR标记对家蚕裸蛹基因州d进行连锁定位分析,将基 因叫d定位于第25连锁群上,位于SSR标记$2511和$2513之间,与两标记间的遗传距离 分别为0.1cM和1.1cM。 1.1.4.3亲缘关系及遗传多样性分析的研究 遗传多样性,也称为遗传变异,是指种内不同群体和个体间的遗传多态性的程度, 它是物种进化的本质【2引。SSR标记多态性丰富且分布在整个基因组中,是研究物种之间 亲缘关系以及遗传多样性分析的好工具。SSR标记的遗传多样性的分析在大豆、玉米、 水稻等经济作物中有大量的研究【24.261,在动物研究领域中,家蚕作为一种昆虫模式生物, 利用SS财行对其亲缘关系以及遗传分析的研究显得更有意义。 Reddy等127J用SSR标记技术对6种滞育蚕、7种非滞育蚕共13个品系进行遗传多样性 分析,239条条带中多态性条带为184条,总多态位点百分比为76.99%,结果表明,SSR 标记的多态性高,并具有共显性遗传特点及符合孟德尔分离定律。沈利等【28】利用筛选 出的8个家蚕SSR标记对6个家蚕品种进行DNA分子水平的多态性分析,共产生23个等位 4 文献综述 基因,平均每个位点近3个等位基因,杂合度范围0.0.750,平均杂合度为0.50;同样, 李竞等【29J用SSR标记技术对中国5个不同地区的野桑蚕及2个家蚕品种进行遗传多样性 分析,25个SSR标汜位点共产生58个等位基因。结果表明SSR标记能较好 地反映家蚕不 同品种间丰富的遗传变异。“等‘121利用26对SSR引物31个家蚕品种进行了遗产多样性分 析,供试材料在26个SSR位点上检测出188个等位基因,每个SSR位点的等位基因数的变 化范围为2.17个,平均为7.2个,杂合度范围0.0.60,多态性信息量PICpolymorphism indexcontent值的变幅为0.12.O.89,平均为0.66。结果表明SSR标记信息丰富、多态性 高,是遗传多样性研究的一个有效的工具。 遗传多样性的研究是生物多样性保护、种质资源的保护及利用、遗传育种的应用的 前提条件,不仅在家蚕中,在其他物种中,SSR标记都是遗传多样性研究的快速有效的 方法之一。 1.1.4.4DNA指纹技术及分子标记辅助育种 SSR标记在DNA指纹技术及品种鉴定和分子标记辅助育种中也有广泛应用。DNA 指纹技术简单来说就是指利用SSR标记找出品种的特异性强的DNA片段,用于品种的鉴 定和保护。在家蚕研究中,研究人员130,311分别在DNA水平上构建了不同家蚕品种I拘DNA 指纹图谱,证明了SSR标记具有品种特异性,适合亲缘关系较近的品种的鉴定。SSR标 记不仅在DNA指纹技术及品种鉴定上体现了重要的应用价值,也是分子标记辅助育种 的可靠手段。 继分子标记发展以后,依靠分子标记对目的基因进行选择在育种中得到了广泛的应 用,它打破了常规选择方法的局限,弥补了常规选择的不足,直接提高了育种的效率和 质量【32】。SSR依靠其优点,成为分子标记辅助育种有力的工具之一,对SSR标记的遗传 图谱的构建、利用SSR进行的基因定位等研究也为分子标记辅助育种打下了基础。 1.1.5展望 分子标记自问世以来,在分子生物学研究领域作出了巨大的贡献。SSR标记因其分 布广泛均匀、多态性高、特异性强、共显性遗传、操作简单、重复性好等优点,在遗传 图谱构建、基因定位、遗传多样性分析、DNA指纹技术及品种鉴定和分子标记辅助育 文献综述 种等方面得到了广泛的应用,并取得了较大的成就。家蚕作为一种昆虫模式 生物,已有 许多SSR标记相关的研究,取得的这些成果不仅完善了家蚕基因组研究的内容,更是对 昆虫类以及其他物种的相关研究的启发和铺垫。 1.2家蚕基因组研究 本节综述了家蚕基因水平上的研究,介绍了家蚕分子遗传图谱的构建、家蚕基因组 计划以及家蚕Z染色体上的研究进展等内容。以期为家蚕Z染色体相关的研究奠定理论 基础。 1.2.1家蚕分子遗传图谱构建 家蚕不仅是一种重要的经济动物,也是一种主要的模式生物。各种分子标记,比如 RAPD标记、AFLP标记、SNP标记等在构建家蚕遗传图谱工作中发挥了重要的作用,为 开展家蚕分子生物学研究奠定了基础。 Goldsmith等117j于1994年构建了第一张家蚕分子标记连锁图谱。随后,Promboon等 【33】构建了家蚕RAPD标记连锁图谱,它包括了168个RAPD标记,涵盖了家蚕28连锁群, 连锁图总图距约达900cM。1998年,YaSukocm【34】利用RAPD标记,对7,757种引物进行 分析,构建了一张包含1,018个分子标记,28个连锁群的高密度分子连锁图谱,总图距 达2,000cM左右,大大丰富和完善了家蚕的遗传图谱。之后,西南农业大学的李斌等【35】 构建了含有182个RAPD标记的连锁图。 随着分子标记技术的发展,SSR标记、SNP标记等各种分子标记连锁图谱在家蚕中 也获得构建。2001年,何宁佳等【36】结合SADF与RAPD标记构建家蚕连锁图,图谱共标 记有293个分子标记,标记间的平均距离为3.2?26.0cM。同年,谭远德等【37】构建了一张 包含356个标记,30个连锁群的家蚕AFLP分子连锁图谱,图谱总长6,512cM。之后,Zhao 等四又采用AFLP标记构建T33个连锁群含407个有效位点的总连锁群的长度达3676.7 cM的遗传图谱,标记间平均距离为9.1cM。张烈等【391用改进的AFLP分子标记方法,构 建了具有814个标记,36个连锁群的家蚕高密度AFLP分子标记连锁图谱。该连锁图谱总 长为13,005cM,标记密度为15.98cM。 6 文献综述 2005年,Prasad所在研究室【聊、黄勇平研究员领导的研究团队f18】分别采用SSR分子 标记构建了家蚕遗传图谱。2006年,Yasukochi等f40Jx,-t数据库中/;勺BAC序列、功能基因 序YlJEST序列和STS标记进行分析,构建了一张高密度的STS标记连锁图,包含950个标 记。 同年,Yamamoto等【4l】构建了家蚕的第一张SNP标记连锁图,该图谱包含了家蚕的 28个染色体,总图距为1,034cM。在此基础上,Yamamoto等142】再次完善了家_蚕SNP标 记连锁图,将l,755个SNP标记排列在28条染色体上,共构建了6,221contigs,定位了724 个单拷贝基因,964个表达序列标签expresseds quencetags,ESTs,标记间平均距 离达到0.81cM的高密度分子连锁图谱。此精细图谱不但涵盖了家蚕基因组全部28条染 色体,还包含约10%的家蚕功能基因和约76%的家蚕基因组序列,为家蚕基因定位及克 隆提供了一个新的资源,也为鳞翅目和其他昆虫的基因组学的研究创造了一个新的平 厶 口。 目前,家蚕分子遗传图谱的构建工作已取得了较大的进展,随着分子生物学时代 的到来,家蚕基因组水平的研究更加成为家蚕研究领域的热点。分子遗传图谱为家蚕精 细图谱的构建、功能基因的研究与分析创造了条件,为家蚕基因组计划的顺利进行奠定 了基础,为家蚕基因组水平研究的发展提供了理论依据。 二二: 1.2.2家蚕基因组计划 家蚕是重要的模式生物,自20世纪初以来,家蚕已成为遗传学、细胞学等研究领 域的热点。家蚕基因组计划的成功实施对遗传学、分子生物学等生物学科的发展研究具 有重大的意义。 1995年,人类基因组计划正式启动,为家蚕全基因组测序工作提供基础。2000年, 黑腹果蝇Drosophilamelanogasger基因组全序列图谱绘制成功、人类基因组框架图 绘制完成以及拟南芥Arabidopsisthaliana基因组测序完成,这三件在基因组学上具有 历史突破性的大事促成了家蚕基因组计划的正式启动。 日本率先开展了大规模的基因表达序列标签ExpressedSequenceTags,EST 测 序工作,共发表EST序列近40,000条,其中近6,000条独立序列,覆盖家蚕全基因组约 30%f431。随后,程道军等?1以大造为材料,构建具有代表性的13个家蚕组织的cDNA文 7 文献综述 库,测序得到84,791条EST序列,拼接得到27,693个非重复序列,其中17,260条独立序列。 2004年,中R分别完成家蚕基因组测序。日本报道了一个3倍覆盖度的家蚕基因组序列 H副。中国西南大学采用霰弹法WhloeGenomeShotgun,WGS测序策略,完成了一 个除w染色体外6倍覆盖度的家蚕全基因组序列,并绘制了家蚕基因组框架副461。 家蚕基因组计划的顺利完成,为构建家蚕精细遗传图谱创造了有利条件。2007年, 日本构建了至今为止密度最高、标记最多的家蚕精细分子遗传图谱,此图谱包含l,775 个SNP标记,涵盖家蚕28个连锁群,标记间平均距离达到O.81cM。此图谱的构建,是家 蚕分子生物学的研究发展中的一个里程碑,也为家蚕功能基因组学、蛋白质 组学等的研 究提供了理论依据。 1.2.3家蚕的Z染色体连锁基因的相关研究 家蚕Z染色体上包含着许多重要特性的基因。目 前,以形态标记为主的家蚕经典遗传学图谱共含有约 240个形态突变位点,这些突变位点分布在28个连锁 群上,其中有15个标记被定位于Z染色体上,如晚 熟基因1atematurity,lm、大卵基因giantegg, e、 油蚕基因distincttranslucentlarvalskin,od、伴性 油蚕sex.1inkedtranslucent,os、伴性赤蚁chocolate larvalcolor,sch及痕迹翅突变基因vestigial,vg 等【471图1.1。 ??种妒。p抖 图1.1家蚕Z染色体性状连锁图九州大 随着分子标记的迅速发展,研究人员已构建了许 学基因资源中心家蚕遗传 学部, 2005J 多染色体相关的各种分子标记遗传图谱,其中包括了 Fig.1.1Bombyxmoriz chromosome IinkagemadfSilkwormGenetiCS z染色体分子标记的开发与图谱的构建。shi等【52】利 Div蔷on1、烈ST. Genetic 用RFLP构建了包含16个连锁群的遗传图谱,其中9 ,、R.e?sou代髓,Kyu5hu UnlV粥ity, Z,UUJJ 个分子标记位于Z染色体上。2005年,Nguu等【53】 将189个cDNA标记定位于28个连锁群中,Z染色体上包含7个分子标记,长度达约 44eM。Yasukochi等【34J构建了涵盖28个连锁图的RAPD分子标记连锁图谱,共包含1,388 个分子标记,18个标记位于Z染色体,图距达80cM。Nagarajad等【54】以油蚕基因Dd 象~ 脚 ‖Z 撬硝 m l lTlIlIlllIlltlI毒ll ?h?o ? S;c 54 7髯 n4 b 4 ??,气 4 ,: 56衅? “^ 9 5 l :: ,j 4 44 4 5 文献综述 为锚定标记构建了&廿D、SSR、FISSR标记的共16个分子标记的Z染色体连 锁图谱, 全长334.5cM。谭远德等【37J利用AFLP技术对家蚕782和od100两个品系 及其回交子 代进行DNA多态性分析,得到共包含356个标记位点的涵盖30个连锁群的遗传图谱, 其中Z染色体上共有19个AFLP标记,连锁长度为418.8cM见图1.2。 2008年,Kimiko掣42】对家蚕的三个BAC文库的进行了末端测定序列,并对表达 序列标签进行了酶切分析,最终建立了一张共有1,775个SNP标记的高密度家蚕分子标 记图谱,其中Z染色体共包含53个SNP标记,长度达44.9cM。利用该图谱,中日两 国科学家对家蚕全基因组序列进行重新比对和拼接,将分子连锁图谱进行整合,构建了 一张涵盖家蚕基因组全部28条染色体的精细物理图谱。通过分析,共预测出了14,623 个家蚕基因,目前已将76%的基因组片段和82%的基因定位到了家蚕染色体上。该精 细图谱将家蚕Z染色体划分为5个scaffold:Bmscaf23、Bmscaf8、Bmscaf142、 Bmscaf26和Bmscaf72,全长共22.4Mb[55J。 一 虽然家蚕Z染色体上的分子标记已有许多,但Z染色体连锁的功能基因克隆研究 还不多。SuzukiMG首次报道家蚕.Z染色体连锁基因并没有剂量补偿现象,他通过 Northern杂交将对两个来自家蚕Z染色体的单拷贝的功能基因片段T15和Bmkettin进 行表达分析,发现家蚕Z染色体连锁基因在雄蚕中的表达水平高于在雌蚕。后来他们 又对家蚕Z染色体/-Bmkettin附近的三个重叠的BAC进行测序,获得320kb基因组序 列,其中包含13个基因功能基因,形成一个微共线性簇;通过对这10多个基因表达水 平的定量RT-PCR检测,证实了家蚕没有剂量补偿效y立[48,49】。Tan等【371利用AFLP标记, 将家蚕的油蚕基因谢定位在P1T3840和P3T3827间。牛宝龙等【50】以长翅蝶磷酸甘油 醛异构酶基因tpi的cDNA序列为模板,在家蚕中成功克隆了与Z染色体连锁的同 源基因Bmtpi。2008年,Fujii等【51】利用三个Z染色体上片段缺失或易位的染色体畸变 品系研究家蚕性连锁基因图谱,最终定位了油蚕基因Dd,痕迹翅基因曙和飞行肌肉障 碍基因md三个与Z染色体连锁的基因。 Z染色体的分子遗传图谱的构建以及Z染色体相关基因的研究已取得了很大 的进 展。Z染色体中“分子密码”隐藏着家蚕各种生命活动形式的真相,相对于 整条染色体 来说,家蚕Z染色体的研究还有许多研究工作要做。家蚕全基因组序列研究、 家蚕精 细图谱构建等的发展,不仅推进了家蚕Z染色体功能基因的研究,也为整个 家蚕基因 9 义献综述 水平研究奠定了基础。 +t?l *l 鬈兰 兰 一; RAPD I让LP ,?? ShiJ,1995 专 囊 二三 RAPD aP轴“?*? qn?‘m o,~??‰?m ‰rwh ”I'?t4,?? YasukochiY.2006Nagaraja,2005 RFLP l o l 誓 工3 乏童 22 2露 ,? 矗磊 Nguu2005 AFLP Group3 ChromosortmZ, TanYD,2001 图1.2家蚕z染色体分子标记连锁图 Fig.1.2BombyxmoriZchoromsomelinkagemapofmolecularmarkers 10 露: 脚 一 ? 。 % ?"跏m m‖.: ‰ 悠久的历史,自5000 夏建国等【56】对雌雄蚕的经济性状差异做了调查研究,结果表明雄蚕与雌 蚕相比,5龄雄 蚕的成长倍数大,食量少,对高温多湿等不良环境的抗逆性强。如果在育种技 术上能做 到专养雄蜀,既能节省养殖成本,又能提高产丝效率,直接提高经济效益。 目前,控制雄蚕性别的方法有雄核发育、限性遗传等。另外,性连锁平衡致死 系可 以控制后代群体性比,也可达到专养雄蚕的目的。1996年,浙江省农业科学 院蚕桑所 从俄罗斯科学院引进了性连锁平衡致死雄蚕品系S.8中系、S.14日系以及相应的 易位品系。何克荣等【57】把平衡致死系的性别控制基因导入到实用品种中去,成功选育 出实用雄蚕品种。 1975年,Strunnikov院士等用辐照诱变方法育成了家蚕性连锁平衡致死系【58】。其特 点是:性连锁平衡致死系雄蚕的2个Z染色体上分别带有一个非等位突变基因Z,和易 1ethalgene1,,,和lethalgene2,厶,当此突变基因纯合时发生死亡。雌蚕的W染色 体上有从Z上易位过来的+OS片段,此片段掩盖了致死基因,,的致死作用。OS是油蚕基 因,隐形纯合时蚕体表现油状,全身通透油亮。在这一诱变过程中,OS基因作为一种 筛选的标记,用以检测Z染色体片段的易位。雌W染色体上还有来自10号常染色体显 性卵色基因+w2易位片段【59】。原10号染色体上的显性卵色基因+w2突变为隐性白卵W2, 用于雌雄筛选。 引 言 歪容品种霉 :00。 鲁0: 坳忿扩狞前肾静静司删旷 钐锈 弦憨 爨帮 熬就 撇嘲眵“晌醋罐辩 骶镩萨 八端萨 警鳜糍魏雾辜 P删锋缡黼糖蛾 掌蜜 馘糍舻 疑雯一曦 转蝴$溉 图2.1家蚕性连锁平衡致死系的性别控制原理Strunnikov,1975 Fig.2.1Sexcontrolofsex?linkagedb lancedlethalstrainStrunnikov,1975 由于以上特殊的基因型,当平衡致死系自交,平衡致死基因能得以完整保留。但当 常规品种雌性与性连锁平衡致死的雄性杂交,其后代雌蚕均在胚胎期死亡,而雄蚕能正 常孵化,达到专养雄蚕的目的如图2.1。虽然平衡致死系已经在生产中得到广泛应用, 但其分子机理还有待进一步研究。分子机理的研究是家蚕性连锁平衡致死系得以更好生 产应用的前提,为昆虫分子生物学的研究打下良好基础。 自家蚕基因组计划正式启动后,中日两国开始对家蚕基因图谱进行绘制,并在2004 年成功绘制了家蚕基因组框架图。2007年,日本构建了至今为止精度最高的家蚕分子 连锁图谱,此图谱包含1,775个SNP标记,覆盖28个连锁群,包含约10%的家蚕预测 基因和约76%的家蚕基因组序列,将家蚕Z染色体划分为5个scaffold //sgp.dna.affrc.godp/KAIKObaseO:Bm?scaf235.1Mb、B caf88.0Mb、 Bmscaf1420.5Mb、Bmscaf264.8Mb和Bmscaf722.0Mb,全长共22.4Mb 如图2.2。另外,Fujii等159J研究发现位于scaffold26中的分子标记N20.80b基因登 12 象死致簿 乎秘旷蟮 盘W疆辩阱强譬劓 盘斟瓣雉U 0朗龆懿姒?馨0匿龆A谴惩2一鼢黢待滗饿U2爨翳髫铷 引 言 录号:AB023114与OS油蚕基因连锁,位于Z染色体精细物理图谱19.2Mb附近。家 蚕精细分子图谱的构建,是我们开展家蚕分子生物学研究的基础之一,我们 以精细图谱 为参考,设计并开展相关的家蚕分子研究工作。 2.2研究内容 2.2.1引物设计 利用已公布的家蚕Z染色体连锁的 分子标记、EST及SGP网站公布的家蚕 Z染色体框架图提供的基因组序列,并 根据易位系的信息,以靠近OS标记的位 于染色体末端两个scaffoldscarf.26和 scarf.72为优先筛选区域,根据P50的 基因组序列,设计特异性引物。 2.2.2筛选两亲本间的多态性标记 通过PCR产物电泳分析的方法,设 计的特异性引物对性连锁平衡致死系2 平2雌蛾与野蚕两个品种的Z染色 体进行多态性分子标记,用于易位片段 的遗传分析。 2.2.3多态性标记的遗传分析 Scarf.23:耋‘ 一一; 墨i。 -警s胁、、\‘:、‘一。一 ?簪56Mb “’i誉苷垮 ’_苎秦:一一一一+。”誊&?_ Scarf.8”孽。。?~:?:、:基:: ,j兰叠::二??j?二-:蠹?i鬣基 ,Ii:嚣~ 一?“i一昙~~??::錾::疵??__一 “:2姥1 .一二鬟l3 6Mfb +9。葛8‰精: sc哆142:篙4:j1M强b,一一藿rag.s熏:’。一善豢”’吵?,.未鬟: ’:童‖’”- ~____? Scarf.26”~萋, ‘一-.苎;?7 一‘!%一E2,.一 ’::!。19 Mb “?:!;2BoMb Scaff:72“鼍j: 。.。一-氅i;;22.4Mb 图2.2家蚕Z染色体精细图谱来自KAIKObase Fig.2.2Thephysicalm pofZchromosomeof silkwormfromKAIKObase 平2雌蛾与野蚕雄蛾杂交得到Fl代;Fl代雌蛾与野蚕雄蛾回交得BCl代。 用在亲 本间筛选得到的多态性标记对Fl、BCl的雌蛾分别进行检测,遗传分析,找出 表现为限 性遗传的标记。 引 言 2.2.4易位片段功能基因的分析 用生物信息学方法分析易位片段的功能基因。 2.3技术路线 根据研究内容,设计技术路线如下: 结果 ???????????????????????????????????????????一_ 3.1实验材料 3.1.1供试材料 3.实验材料、设计与方法 试验材料为家蚕大造P50品种、家蚕性连锁平衡致死系2平2以及野蚕品种, 材料蚕品种由浙江省农科院蚕桑所蚕种室提供、饲养及配制。 3.1.2品种组配 Fl代培育:取平2品系刚羽化的雌蛾与野蚕雄蛾进行交配,雌蛾产卵得到Fl 代, 群养,待蚕卵经历幼虫期长至成虫时!将Fl雌蛾低温保存,用于基因组DNA 提取。Fl 代基因型见图3.1。 亲本 FI BCt ZW × 及 平2早 l野蚕古t 厂???????、???弋 zZ Fl杏 z F早了品I早 。I、 野蚕 zW BCI早 ZZ BCl杏 图3.1平衡致死系2与野蚕杂交1代FI及回交1代BCl的基因型 Fig?3.1Thegenotypeofthehybridsandbaekcrossesgen rationsofsex.iinkaged balancedlethalstrain2andwildsilkwo加 BCl的培育:取平2雌蛾与野蚕雄蛾杂交得到Fl代刚羽化的雌蛾与野蚕的雄 蛾进 行回交,雌蛾产卵得BCI,群养,待蚕卵经历幼虫期长至成虫时,取BCl雌、雄 蛾各 结果 50头,.70?低温保存,用于单蛾的基因组DNA提取。BCI代基因型见图3.1。 3.2主要仪器、试剂 3.2.1主要仪器 超低温冰箱U410,美国NBS公司;电泳仪DYY-2C,北京市六一仪器厂; 电子天平MP20k,上海恒平科学仪器有限公司;PCR仪T1,德国biometra公司; 超声波清洗器SB.3200,宁波新芝科器研究所:紫外分光光度仪DM640,美国 BeckmanCoulter公司;凝胶观测仪GDS.8000,MVP。 3.2.2主要试剂 PCR体系相关试剂dNTP、10xPCRBuffer、TaqDNAPolymerase、6xLoading Buffer及DNAmarkerDL2000均购自北京全式金公司;胶回收试剂盒购自上海鼎 国公司;pMDl8.T购自Takara公司大连;大肠杆菌TGl由本实验室保存;引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成;氯仿、异戊醇、琼脂糖均购自杭州华东医药; Tris饱和酚购自鼎国生物技术公司;无水乙醇购自安徽安特生物技术公司;染料SYBR GreenI购自济南皓博公司;蛋白酶K、RNA酶购自上海生工;磁珠法DNA抽提试剂 盒购自TOYOBO公司;细胞/组织基因组DN