B淋巴细胞和抗体

B淋巴细胞和抗体 抗原分两类 TI-Ag(TI1、TI2) TD-Ag 一、 对TI-Ag的识别 (一)识别TI1抗原(细菌的脂多糖LPS等) 1.高浓度 B细胞多克隆激活剂，与丝裂原受体结合，激活大多数B细胞(注:与BCR特异性识别无关); 2.低浓度 无多克隆激活作用，与BCR结合，激活结合TI1抗原的B细胞克隆。 二、对TD-Ag识别与提呈 (一)TD-Ag 蛋白质抗原，如病原微生物、血细胞和血清蛋白等。 (二) 识别与提呈 1.B细胞表位(蛋白质半抗原)?与特异性 BCR结合; 2.T细胞表位(抗原肽)- MHC-II类分子复合物 ?表达于APC(DC、M,、B细胞)细胞表面 ?TCR识别?Th细胞活化 ?辅助B细胞活化。 注:再次应答、抗原浓度低时，B细胞是最有效的抗原递呈细胞。 B细胞的表面分子及其作用 1. B细胞(抗原)受体复合物(BCR-Igα/ Ig β) (1)BCR(B cell receptor): 中文名:B细胞(抗原)受体 表达于成熟的B细胞表面，主要是IgM(单体)、IgD，成为膜表面免疫球蛋白(mIg) 。为B细胞特征性标志。 结构:膜表面Ig (surface membrane Ig, mIg) 胞外区 VH+VL 识别相应抗原 跨膜区 胞浆区 短，不能传递活化信号。 功能:结合特异性抗原 2) Igα/Igβ(CD79α/CD79β) 结构:异二聚体 ，胞浆区长， 含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。 功能:与BCR构成复合体，转导BCR与Ag结合的信号;参与mIg链的表达与转运。 B细胞共受体 提高B细胞对抗原刺激的敏感度，能增强B细胞活化信号的传递。 CD19:胞质区可传递活化信号。 CD21:即CR2，也为C3d受体， 参与BL的活化。也是EB病毒受体。 CD81: 协同刺激分子 CD40:表达于成熟的B细胞表面 CD80/CD86(B7.1/B7.2): 表达于活化的B细胞表面 BCR多样性产生的机制 B细胞的表面分子及其作用 • BCR复合体:BCR、Igα与Ig β分子(ITAM) • B细胞共受体:CD19/ CD21/ CD81/ CD225 • 协同刺激分子: CD80/CD86、CD40 • 其他表面分子:CKR、CR、FcR、丝裂原受体 CD79α/CD79β • 又称Igα/Igβ，与BCR组成Igα/Igβ -BCR复合物，胞外区为IgSF，其胞浆区有 ITAM。 • 分布:表达于除浆细胞外B细胞发育的各个阶段，是B细胞特征性标记。 • 功能:可结合B细胞内信号分子中SH2结构域，从而介导由BCR途径的信号转导。 CD19 分布于除浆细胞外的B细胞谱系发育的各个阶段，是B细胞的重要标记。CD19是CD19/CD21/CD81信号复合物中的一个成分，可与多种激酶结合，促进B细胞激活。 CD21,又称CR2和EB病毒受体 • 结构:胞外区有CCP结构域，胞内区具有多个PKC/PTK磷酸化部位。 • 分布:表达于成熟的B细胞、滤泡树突状细胞，以及咽部和宫颈上皮细胞，是B细 胞的重要标记。 • 功能:CD21与C3d结合，增强B细胞对抗原的应答和诱导免疫记忆。与EBV结合， 导致B细胞转化和增殖。 CD80/CD86，即B7-1/B7-2 • 结构:胞外区为IgSF，CD80胞内区短，有钙调蛋白依赖的磷酸化部位;CD86胞内 区有3个PCK磷酸化部位。 • 分布:静止单核细胞和树突状细胞CD80表达低、CD86表达高，活化T、B和单核 细胞表达均高。 • 功能:CD80/86与CD28结合为T细胞的活化提供重要的协同刺激信号(co-stimulating signal)。 CD80/86与CTLA-4结合亲和力高于B28，抑制T细胞活化。 CD40 • 结构:TNFR-SF。 • 分布:表达于成熟B细胞、某些上皮细胞和内皮细胞、淋巴样并指细胞、滤泡树突 状细胞以及活化的单核细胞。 • 功能:CD40L-CD40结合是B细胞活化的第二信号。 CD20、 CD22、 CD32 • CD20:表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞。在B细胞增殖和分化中起 重要的调节作用。是B细胞特异性标志。 • CD22:特异表达于B细胞，其胞内段含ITIM，是B细胞的抑制性受体，能负调节 共受体。 • CD32:即Fc,RIIb ，负调节B细胞。 B淋巴细胞的亚群 1.B1 表面标志CD5+ 产生于个体发育早期，有自我更新能力，长寿细胞; 主要位于胸腹腔、肠道粘膜固有层; 接受碳水化合物抗原刺激，产生低亲和力IgM。 针对自己抗原产生天然抗体。 2.B2 表面标志CD5- 产生于出生后，定位于淋巴器官; 是分泌抗体参与体液免疫应答的主要细胞; 接受蛋白质抗原刺激产生高亲和力抗体。 B-1主要生物学功能: 1)接受碳水化合物抗原刺激，产生低亲和力IgM，参与对多种细菌(尤其体腔中)的抗感染免疫; 2)产生低亲和力IgM类的生理性自身抗体，参与对衰老、 蜕变自身细胞的清除; 3)通过产生IgM类自身抗体参与某些自身免疫病的发生 B-2 细胞的主要生物学功能 - 参与体液免疫应答: BC+Ag,在Th辅助下, 活化增殖 ,分化浆细胞, 产生高亲和力抗体 - 抗原提呈: BC用BCR摄取Ag , 处理肽+MHCII , 提呈抗原给CD4T细胞，提供协同信号 - 免疫调节: 活化BC产生多种细胞因子，参与免疫调节 B细胞活化信号 (一)TI抗原刺激B细胞活化 —— 直接作用。 (二)TD抗原刺激B细胞活化 —— 需两种信号 1.第一信号(抗原刺激信号)—— 抗原与BCR(B细胞)结合; 2.第二信号(Th细胞信号)—— 有二种方式 (1)Th细胞-B细胞间接触作用:CD40L-CD40等 (2)Th细胞分泌细胞因子:IL-2、4、5、6等 B细胞介导的免疫应答绝大多数是由TD抗原引起的。 B淋巴细胞的功能 1、产生抗体介导的体液免疫应答 中和作用:针对病毒和胞内菌感染、外毒素 调理作用:Fc/C3b 参与补体的溶细胞或溶菌作用:MAC ADCC:NK等 2、提呈可溶性抗原 APC细胞中，只有B细胞才能提呈可溶性抗原。 活化B细胞表达CD80/86，为,,活化提供第二信号。 3、免疫调节:通过与其他细胞的接触及产生细胞因子参与免疫调节、炎症反应及造血过程 B细胞成熟过程 • 第一阶段发生在骨髓 : 骨髓中的pro-B细胞丢失CD43，即转化为pre-B细胞，进 而发育为μ+的不成熟B细胞;进一步发育为μ+δ +的成熟B细胞。B细胞分化的 非抗原依赖期，进行阴性选择。 • 第二阶段发生在外周免疫器官: 接受抗原刺激后，B细胞可发生类型转换，最终分 化为浆细胞。 B细胞分化的抗原依赖期，进行阳性选择。 B细胞发育过程中的阴性选择 前B细胞在骨髓中分化为未成熟B细胞后，表面表达mIgM，此时能识别自身抗原的B细胞克隆以其BCR(mIgM)与骨髓中出现的自身抗原发生结合，产生负信号，发生细胞凋亡。这是B细胞自身耐受------中枢耐受产生的机制。 B细胞发育过程中的阳性选择 在外周，成熟的B细胞受抗原刺激后，免疫球蛋白基因可发生体细胞高频突变，再加上抗原的选择，留下了表达高亲和力BCR的细胞克隆。此为亲和力成熟或B细胞的阳性选择。 抗体概述 1.抗体(antibody, Ab) 机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 抗体的形成: 抗体的分布: 1)血清(主要) 2)组织液及外分泌液 2.免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig) (1)定义:具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。 (2)存在形式: 膜型(membrane immunoglobulin, mIg) — B细胞膜上的抗原受体; 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg) — 分泌进入体液, 介导体液免疫应答。 免疫球蛋白的结构 一、基本结构 (一)重链(heavy chain，H) 2条 轻链(light chain，L) 2条 (二)可变区(variable region, V区) 恒定区(constant region, C区) (三)超变区( hyper-variable region, HVR),又称 互补决定区(complementary determining region, CDR) 骨架区(framework region, FR) (四)铰链区(hinge region) 二、功能区(domain) 轻链:VL，CL 重链:VH，CH1，CH2，CH3(IgG、IgA 和 IgD)，CH4(IgM和IgE) 主要功能 (1)VH和VL — 抗原结合部位; (2)CH1,3和CL — Ig遗传标志所在; (3)CH2(IgG)、CH3(IgM) — C1q结合部位; (4)CH2,CH3(IgG) — 结合并通过胎盘; (5)CH3(IgG) — FcγR结合部位; (6)CH4(IgE) — FcεR结合部位。 三、水解片段 1.木瓜蛋白酶(Papain) ? IgG Fab段(fragment of antigen- binding,抗原结合 片段) Fc段(fragment crystalizable,可结晶片段) 2.胃蛋白酶(Pepsin)? IgG F( ab′)2 pFc ′ 3.意义:阐明Ig分子生物学作用; 构建基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 抗体。 四、其它成分 1.连接链(joining chain，J链) 2.分泌片(secretory piece, SP) 免疫球蛋白的类型 一、同种型(isotype) 同一种属每个个体都具有的免疫球蛋白的抗原特异性，其抗原决定簇主要存在于Ig的C区。 1.类和亚类(根据H链的抗原性不同) IgG —γ(gamma) 类 IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ(delta) IgE — ε(epsilon) 亚类IgG:IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA:IgA1, IgA2 IgM: IgM1, IgM2 2.型和亚型(根据轻链C区抗原特异性不同分型) (1)型 κ(kappa)型 λ(lambda)型 (2)亚型(λ链): OZ(+) (或λ1) :第190位(亮氨酸) OZ(-) (或λ2) :第190位(精氨酸) Kern(+)(或λ3) :第154位(甘氨酸) Kern(-)(或λ4) :第154位(丝氨酸) 抗体的多样性 Ig分子是由三个不连锁的Igκ，Igλ和IgH基因所编码的，分别位于不同的染色体上。 免疫球蛋白的基因库 1. H基因库(重链基因连锁群)第14号染色体 2.κ基因库(κ链基因连锁群)第2号染色体 3.λ基因库(λ链基因连锁群)第22号染色体 Ig的基因结构及其重排和表达 1.κ链 Vκ(约100个)、 Jκ(5个)、 Cκ(1个) 2.λ链 Vλ(约30个)、 Jλ-Cλ(4个) 3.H链 V基因(约95个) D基因(27个) J基因(6个) C基因(9个) H链V区基因是由V，D，J三种基因片段经重排组成，首先发生D与J基因片段的连接形成D-J，然后再与V片段连接，是通过七聚体-间隔序列-九聚体识别信号和重组酶而完成的。 Ig的类别转换 定义:一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排， 使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换(class switching) 抗体多样性主要由基因控制。(1)胚系中众多的V、D、J基因片断;(2)VDJ连接的多样 性;(3)体细胞突变;(4)N区的插入;(5)L链H链相互随机配对。 抗体的功能 一、 V区的功能 — 识别并特异性结合抗原 单体(IgG, IgE) — 2价 二聚体(分泌型IgA) — 4价 五聚体(IgM) — 10价(5价) 中和效应 — 中和毒素和病毒 与Ag结合 — 促吞噬细胞吞噬 二、 C区的功能 1.激活补体系统 Ab(IgM、IgG) + Ag C1q ? 补体经典途径 IgG4、IgA和 IgE的凝聚物 ? 补体旁路途径 2.介导免疫细胞活性 (1)调理作用(opsonization):IgG + 抗原(颗粒性) ? FcγR(单核、巨噬细胞及中性 粒细胞)? 促吞噬细胞吞噬; (2)ADCC:IgG + 抗原(靶细胞) ? Fc γR(NK 细胞)? 杀伤靶细胞; (3)介导超敏反应:?型、?型和?型超敏反应。 3.穿越胎盘和粘膜 抗体产生的一般规律 (一)初次应答(primary response) 1.概念 抗原初次进入机体所产生的应答。 2.特点 (1)潜伏期(诱导期)长(约7,10天); (2)抗体的种类以IgM为主; (3)抗体亲和力低; (4)维持时间短; (5)总抗体水平低。 (二)再次应答(secondary response) 1.概念:抗原再次进入机体所产生的应答。 2.特点 (1)潜伏期短(约2,3天); (2)抗体的种类以IgG为主; (3)抗体亲和力比初次应答明显增强; (4)维持时间长; (5)总抗体水平高。 (三)意义 1.证明适应性免疫应答具有记忆性; 2.是疫苗接种的理论基础; 3.非活疫苗预防接种，常需二次以上。 抗体的生物学活性 1(抗体与抗原的特异性结合: 刺激抗体产生的物质为抗原，抗体分子只与其相应的抗原发生结合称为特异性结合。例如，白喉抗毒素只能中和白喉杆菌外毒素，而不能中和破伤风外毒素，反之亦然。 2(抗体与补体的结合: 在一定条件下，抗体分子可以与存在于血清中的补体分子相结合，并使之活化，产生多种生物学效应，称之为抗体的补体结合现象，揭示了抗体分子与补体分子间的相互作用。 3(抗体的调理作用: 抗体的第三种功能是可增强吞噬细胞的吞噬作用。在体外的实验中，如将免疫血清加入中性粒细胞的悬液中，可增强对相应细菌的吞噬作用，称这种现象为抗体的调理作用。自此揭示了抗体分子与免疫细胞间的相互作用。为了说明抗体分子这些生物学功能，必须进一步了解抗体分子的结构与功能的关系。 抗体的免疫效应 (一)中和作用 IgG(血液)和SIgA( 粘膜) 1.结合外毒素 中和毒性; 2.结合病毒 阻止病毒吸附进入宿主细胞。 (二)激活补体 Ag-Ab(IgG, IgM)复合物 ?激活补体经典途径?膜攻击复合体?溶解靶细胞。 (三)免疫调理 (四)ADCC IgG + 靶细胞 ?FcγR( NK细胞等) ?杀伤靶细胞。 (五)粘膜抗感染 SIgA ?粘膜抗感染。 (六) 超敏反应:可引起I、II、III型超敏反应。 (七) 自身免疫病 (八) 可引起移植超急排斥反应。 (九) 肿瘤逃逸:肿瘤细胞的封闭抗体。 抗体的应用 (1)抗原的纯化和结构分析 (2)细胞发生、分化及功能的阐明 (3)临床疾病的诊断和治疗 (4)抗体酶 抗体酶(又称催化抗体) 催化抗体又称抗体酶，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，它又是一类免疫系统产生的且有催化活性的抗体，能够特异性识别抗原并以非共价键形式与其结合，然后催化裂解抗原或与抗原发生其他的化学反应。 抗体酶的催化特征 1、与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应 有更强的专一性和稳定性 催化作用机制不同 2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性 反应的可逆性 反应的量效性 反应过程 抗体酶的催化作用机理 1、过渡态理论与抗体酶 2、抗体酶催化的三种重要反应机制 水解作用机制 基团转移 连续反应机制 3、抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应 : 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。 脱羧反应中介质效应 ;有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 :在疏水溶剂中，活性较高。 抗体酶的制备 1、细胞融合法:用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白(如牛血清白蛋白)偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。 2、抗体结合位点化学修饰法:抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点 3 . 引入辅助因子法 很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键。且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键 . 4 用生物工程的方法产生抗体 Fab片断由轻链和重链的VH及CH1部分组成，作为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。从人或动物的抗原中抽取基因，然后用酶反应复制基因的聚合酶链反应(PCR)技术重新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。这些基因库是存储在细菌病毒里，通过随机地将基因和轻重链结合的方法，就可大量制造Fab片断了。片断里的基因是通过细菌的形式表达出来的。这就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体。 5、拷贝法:用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。 6、共价抗原免疫法 这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。 抗体酶的筛选 1、ELISA法;用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体 。 2、酶学活性检测法:直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。 3、短过渡态类似物法:以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 4、基因筛选法 :应用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。 抗体酶的应用前景 1、 抗体酶在帮助戒毒方面的应用 Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的 。 2.抗体酶用于肿瘤治疗 目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗(ADEPT)技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然交药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性 。 基因工程抗体 定义:在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体。 人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody) 改型抗体 (reshaped humanized antibody) 小分子抗体 双特异性抗体(bispecific antibody) 酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)是将酶作为标记物质，使之和抗原(或抗体)结合形成酶与抗原(或抗体)复合物，然后再根据待测抗体(或抗原)与复合物专一且定量的结合关系，通过测定待测抗体(或抗原)结合的标记酶活力，从而计算出抗原或抗体的量。 免疫记忆 B细胞免疫记忆是指B细胞再次遇到相同抗原时，快速产生高效价、高亲和力抗体的现象。 记忆B细胞库(二种类型) ?长寿记忆B细胞 —— 不能分泌抗体; ?长寿浆细胞 —— 能分泌抗体。 B细胞记忆的诱导 Ag ?成熟B细胞(生发中心)?增殖分裂成中心母细胞(centroblast)?BCR改变 ?与FDC(滤泡性树突状细胞)上的抗原结合: BCR(低亲和力) ?B细胞阴性选择，发生凋亡; BCR(高亲和力) ?B细胞阳性选择，发育成浆细胞或者记忆细胞。 记忆B细胞对再次抗原的应答 再次抗原 ?记忆B细胞克隆快速大量扩增 ?抗体分泌细胞增多(较初次应答多8,10倍以上)