叶绿体的提取
叶绿体的分离
原理:
研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲液溶液中，0~4度温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。
仪器与用具:
冰箱;离心机;扭力天平;显微镜;pH计;研钵;量筒;移液管;离心管;脱脂纱布等。分离器皿都须在0度下预冷。
试剂:
1. 分离介质:含0.33 mol/L山梨醇，50 mmol/L Tris-HCl(或Tricine)pH7.6，5 mmol/L MgCl，210 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L 异抗坏血酸纳。
配法:称60 g山梨醇、6.06 g Tris、1 g MgCl?6HO、0.6 g NaCl、0.77 g EDTA-Na、0.4 222g 异抗血酸钠，溶解后用1 mol/L HCl调pH至7.6，定容至1000 ml。
2. 悬浮和测定介质?:0.66 mol/L 山梨醇，2 mmol/L MgCl，2 mmol/L MnCl，4mmol/L 22EDTA，10 mmol/L 焦磷酸钠，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。
配法:称60g山梨醇、0.2g MgCl?6HO、0.2g MnCl?4HO、0.75g EDTA-Na、2.23g 22222NaPO?10HO、6.06g Tris，溶解后用1 mol/L HCl调pH至7.6，定容至500ml。 4272
3. 悬浮和测定介质?:测定介质?稀释1倍。
方法:
1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0~4度冰箱或冰瓶中预冷。
2. 分离介质30~50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。
3. 取冷却的菠菜叶片10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。 4. 将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。 5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质?，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。
6. 用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质?稀释，置显微镜(400~600倍)下，观察叶绿体的形态。
叶绿体被膜完整度的测定
原理:
由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破的叶绿体Hill反应速率就可以计算叶绿体被膜的完整度。
仪器与用具:氧电极测氧全套装置
Rubisco(RuBP羧化酶)活性的测定
原理:
根据Cavinl循环得知，在RuBP羧化酶作用下1 mol RuBP与1 mol CO反应生成2 mol 3-2
磷酸甘油酸，后者在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶作用下，被NADH还原成3-磷酸甘油醛，其反应如下:
2+ RuBP羧化酶，Mg
RuBP+CO + HO ?—————————? 2×3-PGA 222+ 3-PGA激酶，Mg
2×3-PGA + 2ATP ?—————————? 2×1，3-二磷酸甘油酸 + 2ADP
3-磷酸甘油醛脱氢酶
+2×1，3-二磷酸甘油酸 + 2NADH ?—————————? 2×3-二磷酸甘油酸 + 2NAD +2Pi
从上述总式可以看出，每固定1 mol CO就有2 mol NADH被氧化，NADH的减少量可用分2
光光度计在340 nm下测出，进而计算出RuBP羧化酶的活性。
仪器与用具:
分光光度计;冷冻离心机;自动部分收集器，蛋白质检测仪;凝胶电泳装置;Sephadex(葡聚糖)层析柱(长度与直径视所提蛋白的质量而定);恒温水浴;匀浆器;纱布。 试剂:
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