质谱在医院检验中的应用

质谱在医院检验中的应用 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 CONTENTS质谱工作原理与类型介绍质谱在医院检验中的发展史质谱在医院检验中的应用质谱使用注意事项与仪器维护技巧目录CONTENTS质谱工作原理与类型介绍质谱在医院检验中的发展史质谱在医院检验中的应用质谱使用注意事项与仪器维护技巧4质谱定义和用途质谱是什么？特殊的天平：称量离子的质量。MassSpectrometry(质谱学)：是一门研究气相离子结构、性质及反应行为的科学。MassSpectrography(质谱法)：质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。MassSpectrograph(质谱仪)：将离子按照质荷比差异进行分离和检测的仪器质谱能做什么？定性：化合物的分子量和结构定量：混合物中目标组分的含量领域：化学、生物学、医学、药学、环境、物理、 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 、能源等质谱工作原理与类型介绍质谱的独到之处是什么？4S特性：Sensitivity灵敏Speed快速Specificity特异Stoichiometry化学计量100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.75质谱工作原理与类型介绍质谱(massspectrometry,MS)技术是一种重要的检测分析技术,通过将待测样本转换成高速运动的离子,根据不同的离子拥有不同的质荷比(m/z)进行分离和检测目标离子或片段,然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量。近年来,质谱技术发展迅速,通过改进离子源和分离器相继发展了多种类型的质谱仪如电喷雾离子源质谱(ESI-MS)、大气压化学电离离子源质谱(APCI-MS)、四级杆(QQQ)质谱仪、离子阱质谱技术以及各种串联、联用质谱仪等多种类型,极大提高了检测的分辨率和检测范围。质谱技术最先应用于计量和分析化学领域,在临床检验中质谱仍属于一种年轻的检测方法。但自从其在临床检验应用以来,便以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力,尤其和气相、高效液相色谱仪的联用极大的扩展了质谱技术在临床检验中的分析范围。质谱(massspectrometry,MS)6质谱学领域的诺贝尔奖质谱工作原理与类型介绍1906年：物理学奖贡献：正电荷离子束在磁场中的偏转磁质谱仪的基础同位素分析J.I.Thomson1989年：物理学奖W.Paul贡献：离子阱技术的发明。2002年：化学奖贡献：电喷雾(ESI)电离方法生物大分子分析J.B.FennKoichiTanaka(田中耕一)贡献：基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)电离方法生物大分子分析7质谱分类质谱工作原理与类型介绍SIMS检验医学领域的应用：主要用于临床样本（血液、尿液、毛发、组织等）的元素分析，如Zn、Mg、Ca、Fe、Cu、Mu等ICP-MS火花源双聚焦质谱仪LC-MS/MSGC-MS/MSLC-QTOF-MSGC-QTOF-MS用于生命、医学、农业科学、化学、化工、药物、毒物等领域的化合物结构鉴定、定量分析、气相离子化学等分子量测定；蛋白质、多肽纯度测定；肽质量指纹图谱；肽序列测定技术；蛋白质的翻译后修饰鉴定ICP-MSLC-MS/MSLC-QTOF-MS生物质谱质谱同位素质谱无机质谱有机质谱生物质谱8质谱分类质谱工作原理与类型介绍根据分辨率的不同，可以分为3类：9质谱常用概念－质荷比质谱工作原理与类型介绍质荷比(m/z)离子的质量数与电荷数之比。若离子所带电荷为z=1，则质荷比等于该离子的质量数。质量数的定义：以12C原子的1/12定义为一个质量单位，用u表示。1u=1.66054x10-27kg其它常用符号，Da,道尔顿，1Da=1u；amu，atommassunit，原子质量数单位，1amu=1u。色谱图：TIC：TotalIonChromatogram总离子流色谱图EIC：ExtractedIonChromatogram提取离子流色谱图MC：MassChromatogram质量色谱图(同EIC)MIC：MixedIonChromatogram混合离子流色谱图采集模式：SIM：SelectedIonMonitoring选择性离子监测模式Scan：扫描模式SRM:SelectiveReactionMonitoring选择反应监测MRM:MultipleReactionMonitoring多反应监测子离子扫描(ProductIonScan)；母离子扫描(PrecursorIonScan)；中性丢失扫描(NeutralLossScan)10质谱常用概念－质谱图质谱工作原理与类型介绍质谱图(MassSpectrum)质谱仪产生的信息是离子的质量及其强度，这些数据可以列成表。最常用的是以质荷比(m/z)为横座标，强度为纵座标制成的质谱图。MS中的各种图谱11质谱工作原理简化流程质谱工作原理与类型介绍12三重四级杆质谱（MS/MS）工作原理简化流程质谱工作原理与类型介绍串联质谱法或多级质谱法，缩写为MS/MS或MSn，涉及两级以上的质谱分析，包括引起离子质量或电荷改变的解离过程或化学变化。13三重四级杆质谱（MS/MS）工作原理简化流程质谱工作原理与类型介绍最常用的MS/MS实验中，第一级质量分析器用于选择一个前体离子（precursorion），或称为母离子（parention）,然后，用适当的活化方法，常用碰撞诱导解离（collision-induceddissociation,CID）使这一离子裂解生成产物离子（productions）或称为子离子（daughterions）及中性碎片：mp+→mf++mn式中，mp+为前体离子，mf+为产物离子，mn为中性碎片，第二级质谱用于分析产物离子。产物离子扫描:ProductIonScan（PIS）MRM模式M+14三重四级杆质谱（MS/MS）工作原理简化流程质谱工作原理与类型介绍Scan模式SIMandSRM15三重四级杆质谱（MS/MS）工作原理简化流程质谱工作原理与类型介绍中性丢失扫描：NeutralLossScan（NLS）扫描模式汇总16质谱离子源-ESI源（电喷雾离子源）质谱工作原理与类型介绍17质谱显微镜质谱工作原理与类型介绍医学和药学研究………代谢物或者药物在脏器里面是如何分布？药物有没有递送到目标部位？目前常用得方法：匀浆，蛋白沉淀，萃取目标物，定性和定量分析免疫染色，放射性或萤光标记，显微镜观察目标物存在于脏器得那个部位？⇒Where???繁琐且成本高/标记物解离/原药及其代谢物无法区分质谱显微镜(iMScopeTRIO)18质谱工作原理与类型介绍质谱显微镜(iMScopeTRIO)19质谱工作原理与类型介绍质谱显微镜(iMScopeTRIO)目录CONTENTS质谱工作原理与类型介绍质谱在医院检验中的发展史质谱在医院检验中的应用质谱使用注意事项与仪器维护技巧21发展史质谱在医院检验中的发展史011919年第一台质谱仪被英国人发明以来，质谱技术已走过将近百年历史。02上世纪80年代以来由于软电离方法的发明，质谱技术才进入生命科学领域。032000年质谱技术在国外进入临床医学检验领域并取得较快进展，虽然它在临床检验中仍属于一种年轻的检测方法，但是其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力。22发展史质谱在医院检验中的发展史临床上应用相对成熟的质谱技术分为3类，分别是液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、微生物质谱和核酸质谱(MALDI-TOF)。目前，只有MALDI-TOF技术国内部分厂商能自主生产并应用于临床诊断，而技术难度较高的液相色谱串联质谱技术则仍主要由国外质谱厂商巨头如SCIEX、Waters、赛默飞世尔、岛津、安捷伦、布鲁克等所垄断。目录CONTENTS质谱工作原理与类型介绍质谱在医院检验中的发展史质谱在医院检验中的应用质谱使用注意事项与仪器维护技巧24应用1：新生儿疾病筛查质谱在医院检验中的应用仪器：LC-MS新生儿疾病兔唇先天性心脏病唐氏儿地中海贫血25应用1：新生儿疾病筛查质谱在医院检验中的应用利用衍生化法检测氨基酸、肉碱等化合物，可同时筛查十几种新生儿疾病（疾病种类可增加）质谱技术能够做到筛查效率高、结果可靠，费用相对低廉，这是常用分析方法例如细菌抑制法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析法、荧光酶免疫分析法等不可企及的。可以预测，随着临床对于疾病的认识和方法的建立，筛查项目的数量将会逐渐增加。以我国每年2200万新生儿中有苯丙酮尿症患儿1700例和先天性甲状腺功能减低症患儿5000例计算，及时诊断和治疗有着十分重要的社会意义和经济效益。26应用2：具有临床意义的内源性和（或）外源性化合物的监测质谱在医院检验中的应用仪器：LC-MSGC-MS内分泌激素和营养素的监测对个体的疾病诊断、预测和评价健康状态都是非常有帮助的。以维生素D及其代谢产物为例，国内外最新研究认为，维生素D与心血管疾病、代谢性疾病和肿瘤等疾病的发生间具有一定相关性。目前，临床以检测25(OH)-D总量来表示维生素D状况，虽然25(OH)-D水平在体内波动小，相对而言，浓度较高易于测量，半减期较长(~3周)，但LC-MS检测法比放免法、酶免疫法等快速且灵敏，更耐用。1,25(OH)2-D3是维生素D状态最好的监测指标，但其在体内含量极低且不稳定，目前已开发出可用以检测1,25(OH)2-D3的LC-MS法，比放射免疫分析法有更高的特异度和灵敏度，且安全。维生素D327应用2：具有临床意义的内源性和（或）外源性化合物的监测质谱在医院检验中的应用另外，临床要求监测儿童体内极低量性激素变化情况，但免疫法检测低于试剂盒检测下限的数据波动很可能不能反映体内真实水平。质谱技术可为我们提供pg甚至是fg级的检测限，但需注意高分辨带来的高背景噪音问题，应综合考虑。28应用3：治疗药物监测质谱在医院检验中的应用仪器：LC-MS作为临床个体化治疗重要组成部分，对于一些血药浓度与疗效关系密切、有明确的有效浓度范围、治疗窗较窄、体内代谢个体差异大、药物中毒症状与疾病症状难以鉴别、用于长期治疗和抢救的药物等情况下，临床需测定体液中药物的浓度，指导临床个体化治疗，让患者利益最大化而风险最小化。美国病理学家学会研究表明，采用LC-MS法检测结果更具有真实性和实验可信度，已成为治疗药物监测必备的分析方法。目前，临床实验室仍以免疫分析为主要方法，质谱分析法由于自动化程度不足和缺少认证试剂在近期内难以取代前者，但依旧是实验室非常好的参考方法。29应用4：微生物鉴定质谱在医院检验中的应用仪器：MALDI-TOF质谱仪感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为“金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ”，但能培养成功的仅为少数，且病原体（尤其是真菌）的培养周期较长，费用颇高，因此微生物非培养技术正是为满足难培养或者感染早期诊断需要所建立的方法，包括蛋白质组学、基因组学、宏基因组技术、DNA指纹技术、分子杂交及生物芯片技术等。皮疹艾滋病真菌30应用4：微生物鉴定质谱在医院检验中的应用此处介绍应用MALDIBiotyper高通量微生物鉴定系统，通过鉴定病原体自身独特的蛋白质组成，在MALDI-TOF质谱仪中得到指纹图。该系统另一个重要的组成部分是已包含3千多种微生物蛋白特征指纹图谱数据库，通过特征模式峰的匹配值作鉴定。质谱技术鉴定微生物的优点在于其操作简单（微生物单个菌落前处理简单）、快速且高通量（每1.5h可检测100个样本），灵敏度高（100ng蛋白即可检出），准确率高(<5u，m/z：~10000u)，成本经济（<1欧元），稳定性及重现性好（微生物蛋白指纹谱峰主要集中在2～20ku质量范围内，这些持续高表达的蛋白质受微生物生长环境和状态影响很小）31应用5：生物标志物研究质谱在医院检验中的应用仪器：LC-MSGC-MSMALDI-TOF质谱仪由于质谱技术的高灵敏度、高准确率及易于自动化等特点，毫无疑问地成为解决蛋白质组学关键手段之一，在生物标志物研究中是必不可少的一种手段。生物质谱技术在其中扮演了重要角色，其测定生物大分子的相对分子质量高达400ku，准确率高达0.100~0.001%，远高于目前常规应用的十二烷基硫酸钠电泳和高效凝胶色谱技术。利用肽质量指纹谱技术，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选，寻找新的生物标志物。同时，利用生物质谱的准确相对分子质量测定，可实现对二硫键和自由巯基及蛋白质翻译后修饰如糖基化等的快速定位与确定，包括SNPs在内，生物质谱已实现对数十个碱基寡核苷酸的分子量和序列进行测定，应用浸入分裂法结合。目录CONTENTS质谱工作原理与类型介绍质谱在医院检验中的发展史质谱在医院检验中的应用质谱使用注意事项与仪器维护技巧33三重四级杆定量分析方法：质谱使用注意事项与仪器维护技巧生物等效性试验标准操作规程1检测程序1.1操作者按规定进入实验室后，先检查仪器的状态标识，确定仪器运行正常后，方可进行仪器操作。1.2按《项目检测计划书》的要求配制流动相，并设定仪检测器参数。采用液相色谱和单级质谱时，应设置适宜的积分方法。1.3按《项目检测计划书》的要求处理样品，待仪器平衡、系统适应性考察合格后，进样检测。1.4原始图谱的积分要求1.4.1液相色谱检测加载最终确定的积分方法，复核原数据后，采用复制粘贴的方法将原数据输入Excel表进行统计计算，并按要求进行有效数字的取舍，并设定适宜的浓度单位。积分方法改变应 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 。1.4.2液质检测串联质谱采用定量分析软件计算色谱峰面积，其积分方法为仪器默认，不可人为更改。单极质谱在加载最终确定的积分方法，复核原数据后，将原数据输入Excel表中进行统计计算。并按作业指导书的要求进行有效数字的取舍，并设定适宜的浓度单位。积分方法改变应记录。34三重四级杆定量分析方法：质谱使用注意事项与仪器维护技巧生物等效性试验标准操作规程2方法学的确证（Validation）一般对于首次建立的分析方法需要连续进行的方法学确证试验。特异性残留效应标准曲线和定量范围定量下限(LLOQ)精密度与准确度稳定性提取回收率稀释可靠性已测样品再分析基质效应35三重四级杆定量分析方法：质谱使用注意事项与仪器维护技巧生物等效性试验标准操作规程2方法学的确证（Validation）残留效应1、配制方法按《项目检测计划书》中实验要求配制空白血浆样品8个样本，定量上限血浆样品6个样本。2、检测方法2个空白血浆样品检测，2个高浓度点的血浆样品检测，2个空白血浆样品检测，反复后两个步骤3次。空白血浆样品的文件命名为Carry-over-blank-01~Carry-over-blank-08;高浓度点血浆样品的文件命名为Carry-over-sd7-01~Carry-over-sd7-06.3、实验要求空白血浆样品的待测物响应值不超过当日检测定量下限最低响应值的20%，内标干扰物质的最大响应值应不超过当日检测内标平均响应值的5%。采用自动进样检测的项目应考察，不采用自动进样检测的项目可选作。自动进样器应选用洗针模式进行考察。36三重四级杆定量分析方法：质谱使用注意事项与仪器维护技巧生物等效性试验标准操作规程2方法学的确证（Validation）精密度与准确度用QC样品的批间、批内RSD考察方法的精密度，用RE考察方法的准确度。批内/日内精密度和准确度重在考察方法的重复性；批间/日间精密度和准确度重在考察样品测定时仪器的性能、试剂、标准曲线、环境条件等发生微小变化而导致测定结果的变异。1、配制方法按SOP中实验要求配制低、中、高质控样品每个浓度各6个样本。2、检测方法方法学确证连续3天每浓度6样本分析。文件命名QCx-01~QCx-06（x=1、2、3；）3、实验要求批间、批内的RSD均应小于15%，RE应在理论浓度的±15%范围内。RSD用单因素方差分析统计计算。37三重四级杆定量分析方法：质谱使用注意事项与仪器维护技巧生物等效性试验标准操作规程2方法学的确证（Validation）基质效应考察生物样本中的内源性物质对待测组分的离子抑制或增强程度。LC-MS和LC-MS-MS应考察此项，液相色谱不需要考察。1、配制方法Set1：取低、中、高三个浓度的标准溶液和内标溶液，用非生物基质的空白溶液（即流动相溶液）稀释至相应体积（每浓度水平与体内浓度水平相当），即得纯标准品的样本。Set2：每个浓度配制至少6个不同来源的空白生物基质溶液，用此溶液分别将低、中、高三个的浓度标准溶液和内标溶液稀释至相应体积（与Set1制备的溶液体积相同）。2、检测方法Set1：每个浓度6样本分析，一般情况下即为回收率样品，文件命名为Recovery-x-01~Recovery-x-06（x=L、M、H；）Set2：不同来源空白生物基质单样本分析，文件命名为Recovery-x-01~Recovery-x-06（x=L、M、H；）3、实验要求将上述Set1和Set2样品引入LC/MSn系统进行分析，获得待测物和内标的信号强度，其中待测物或内标在Set2和Set1中信号强度的比值(Set2/Set1)为绝对基质效应，用基质效应因子(matrixfactor，MF)来表示。待测物与内标MF的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalizedMF)。内标归一化基质效应因子(IS-normalizedMF)的相对标准偏差应小于15%。38三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧调谐（Tuning）39三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧调谐（Tuning）40三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧调谐（Tuning）41三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧准备调谐液标准品42三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧大气压下离子化适用范围ESI和APCI的比较(1)——样品类型ESI和APCI的比较(2)——基质和流动相43三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧ESI和APCI的比较(3)——溶剂离子化技术的选用——小结1)非极性和低极性化合物也许不适合用API(APCI，ESI)进行离子化，而用气质联用GCMS(EI)，会有更好的灵敏度和重现性2)LC/MS的主要检测对象是有机化合物（也可以检测络合物形式中的无机化合物）3)APCI适于低至中等极性的化合物，尤其是热稳定的化合物4)ESI适于中至高极性化合物，尤其是在溶剂中即可离子化的化合物5)ESI检测可产生大分子化合物的多电荷离子44三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧LC/MS流动相的选择如流动相合适(ACN/MeOH/water+volatilebuffer)，反相HPLC的液相条件可以直接用于LC/MS的分析流动相应使用高级别的化学试剂使用挥发性缓冲盐，如醋酸铵或甲酸铵替代磷酸缓冲盐。挥发性缓冲盐调节pH：pH2.5~4:withFA,conc.~0.1%pH4~5:withHAc,conc.0.1~0.5%pH7:withNH4AcpH>7:withNH3aqueoussolution45三重四级杆仪器维护质谱使用注意事项与仪器维护技巧LC/MS流动相的选择能否使用磷酸缓冲盐?由于下述原因，磷酸盐缓冲液被广泛使用：在短波长区的低吸收；宽的pH缓冲作用范围(pH=2-4,6-8,11-13)；使用磷酸盐的一大缺陷是其易结晶，结晶将会使LC/MS接口堵塞；最好使用挥发性缓冲盐，如醋酸铵或甲酸铵替代磷酸缓冲盐；如果应用挥发性缓冲盐调节pH，有时能够获得用磷酸盐相似的结果。选择流动相添加剂时注意事项强酸物质，例如三氟乙酸（TFA）、H2SO4等，负离子模式下会引起离子抑制强碱物质，例如三乙胺、季铵盐等，正离子模式下引起离子抑制离子对试剂如十二烷基磺酸钠(SDS)会导致严重离子抑制。