ROCK1 在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的作用

ROCK1 在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的作用 ROCK1在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的作用 刘 冬～熊仁平～陈星云～李 平～宁亚蕾～彭 艳～赵 艳～杨 楠～周元国 (400042重庆，第三军医大 学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心，创伤烧伤及复合伤国家重点实验室) [摘要] 目的 探讨ROCK1在地塞米松(dexamethasone，Dex)抑制中性粒细胞释放和单核细胞粘附中的作用。方法 检测 -地塞米松和法舒地尔(Fasudil，Fas)抑制佛波脂(PMA)诱导的中性粒细胞释放超氧化物阴离子(O)和髓过氧化物酶(MPO)2 以及U937单核细胞粘附的程度，并检测ROCK1和RhoA的表达和活性改变。此外观察糖皮质激素受体拮抗剂--米非司酮 (mifepristone，M)和蛋白质合成抑制剂--放线菌酮(cycloheximide,C)对地塞米松这些作用的影响。实验分组:对照组、PMA组、 -PMA+Dex组、PMA+Dex+M组、PMA+Dex+C组和PMA+Fas组。结果 地塞米松可以显著抑制中性粒细胞释放O和MPO[(1.25?0.10) 2 vs (1.95?0.10);(1.07?0.06) vs (1.75?0.08)，P<0.05]，而法舒地尔对其无明显抑制作用(P>0.05)。地塞米松和法舒地尔均可抑制U937 细胞粘附[(0.09?0.01) vs (0.08?0.01) vs (0.28?0.06)， P<0.05]。米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松的这些作用(P>0.05)。 结论 地塞米松以非ROCK1依赖方式抑制中性粒细胞释放;以ROCK1依赖方式通过非基因组效应抑制U937单核细胞的粘附。 [关键词] 地塞米松;非基因组效应;ROCK1 [中图法分类号] [文献标志码] A Role of ROCK1 in Dexamethasone inhibited neutrophil release and monocyte adhesion Liu Dong, Xiong Renping，Chen Xingyun,Li Ping, Ning Yalei，Peng Yan， Zhao Yan， Yang Nan， Zhou Yuanguo(Molecular Biology Center, State Key Laboratory of Trauma, Burn, and Combined Injury, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, ThirdMilitary Medical University, Chongqing 400042, China.) [Abstract] Objective To explore mechanism of the inhibition effect of dexamethasone (Dex) on neutrophil release and monocyte adhesion. Methods Detect the inhibition level of Dex and Fasudil affect on the release -superoxide anion (O) and myeloperoxidase(MPO) of neutrophil (PMN) after treat with PMA, and detect the 2 adhesion ability change of U937 cells to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) after stimulate as same as above mentioned. And detect the expression and activity of ROCK1 and RhoA were also examined.Furthemore, evaluate how glucocorticoid receptor antagonists (mifepristone，M) and protein synthesis inhibitors(cycloheximide， C) affect on dexamethasone.Samples divided to:control group, PMA group, PMA+Dex group,PMA+Dex+M group,PMA+Dex+C group and PMA+Fas group.Results The results showed that Dex can inhibit the release O2- and MPO of PMA-stimulated PMN (1.25?0.10 vs 1.95?0.10;1.07?0.06 vs 1.75?0.08，P<0.05),but fasudil had not this function(P>0.05).Dexamethasone and Fasudil can inhibited adhesion ability of U937 cell siginificantly(0.09?0.01 and 0.08?0.01 vs 0.28?0.06， P<0.05). Mifepristone and Cycloheximide did not interfere with the effect of Dex. Conclusion Dexamethasone inhibits neutrophil release via non-ROCK1 dependent pathway ; and discourage U937 monocyte adhesion in ROCK1 dependent pathway via non-genomic effects. [Key words] dexamethasone; non-genomic effects;ROCK1 Supported by the National Natural Science Foundation of China (30470988) and the Project of Innovation Team of Ministry of Education (IRT0712). Corresponding author: Zhou Yuanguo, Tel:86-23-68757471，E-mail:ygzhou@cta.cq.cn [基金项目] 国家自然科学基金(30470988);教育部创新团队基金(IRT0712) [通信作者] 周元国，电话:(023)68757471，E-mail:ygzhou@cta.cq.cn 5中性粒细胞作为机体中重要的炎性细胞，在机体个/ml，将细胞置于24孔板中，每组3个孔。分组如为5×10 抵抗外界病原入侵的阶段起到了积极的防御作用。其下:(1)对照组;(2)PMA(200ng/ml)组;(3)PMA+Dex ----6 64 (mol/L)组;(4)PMA+Dex(1可通过氧化爆发和脱颗粒来释放氧自由基(O)和多100mol/L)+RU-486(102--64mol/L)组;(5)种细胞内容物如髓过氧化物酶(MPO)等来杀灭病菌PMA+Dex(10 mol/L)+CHX(10 mol/L)[1][5]。但是当中性粒细胞被过度激活后，会大量聚集在组;(6)PMA+ Fas(100μmol/L)组。反应30min后终止反[2]应，测定步骤按照试剂盒内说明书进行。处理组均与对照组相血管内皮上，释放其内容物、炎症介质，级联放大 [3]对比。 炎症反应，对机体造成损害，从而引起一系列疾病。 临床上常采用大剂量糖皮质激素冲击疗法来治疗上1.2.3 U937与HUVEC细胞粘附水平测定 用CCK-8法测 [4]述急性炎症反应，这种快速治疗作用称为“非基因得的OD值反应细胞数。处理组OD值减去已贴壁的HUVEC组效应”。但是糖皮质激素具体是通过何种机制发挥细胞数基础值，即测得粘附上的U937细胞数目。96孔板中每 3这种强大的抑制炎症反应的功能，尚有待研究。 孔加入加入4×10个HUVEC，孵育12 h。待细胞贴壁后后每 4本实验以大鼠中性粒细胞和U937单核细胞株为孔加入5×10个U937细胞。分组处理情况同上。孵育30min对象，通过联合应用ROCK特异性抑制剂(法舒地尔)后，弃上清，PBS吹洗2次。每孔加入CCK-8溶液后，孵育1, 2h来探讨糖皮质激素快速抑制炎症细胞释放和粘附功，在450nm波长下使用酶标仪检测OD值。以OD值反映细 胞粘附量。 能的作用机制与RhoA/ROCK信号通道的关系。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.2.4 ROCK1活性测定 收集处理后的U937细胞。采用1.1 材料和仪器 Pull down法收集各组中U937细胞ROCK1蛋白，等量分置于 EP管中。每管加入5SD大鼠12只，4,6周，雌雄不限，体质量约200g，购μl 抗-ROCK1 抗体，室温摇晃1,2h。于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心。人单每管中加入25μl 磁珠，室温混匀，1h。收集磁珠轻洗2,3 [6]核巨噬细胞细胞株U937、人脐静脉内皮细胞HUVEC均为第次后。收集ROCK1蛋白留作活性测定。ELISA法检测ROCK1三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心液氮保的活性参照Cyclex说明书进行。使用D(450)/D(540)nm 测定 其吸光度。将处理组均与对照组相对比。 存。DMEM、 RPMI1640培养基和胎牛血清购于GIBCO。PMA、 地塞米松(Dex)、米非司酮(RU-486，M)、放线菌酮(CHX，1.2.5 ROCK1 mRNA表达水平测定 使用Trizol法提取总C)均购于Sigma公司。法舒地尔(Fasudil，Fas)购于旭化成RNA，经紫外定量分析后使用逆转录试剂盒(TaKaRa公司)制药株式会社。Cell Couting Kit-8(CCK-8)和超氧化物检测进行逆转录。再使用实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)试剂盒购于碧云天生物技术研究所。髓过氧化物酶(MPO)测进行定量。引物序列:ROCK1 上游:试盒购于南京建成生物工程研究所。兔抗人抗RhoA抗体购于5’-ATGAGTTTATTCCTACACTCTACCACTTTC-3’;下游:北京博奥森公司。兔抗人ROCK1抗体购于SantaCruz公司。5’-TAACATGGCATCTTCGACACTCTAG-3’，GAPDH 上游:RhoA活性测定试剂盒购于Neweast公司。ROCK1活性检测5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’; 下游:5’- ELISA试剂盒购于Cyclex公司。Protein A/G 磁珠购于PierceTAGCCAAATTCGTTGTCATACC-3’。PCR反应条件为:95? [7]公司。山羊抗小鼠/兔的二抗购于Sigma公司。 4min，95? 30s，59? 15s，72? 15s，40次循环。GAPDH 作为内参。 1.2 方法 1.2.1 细胞分离及培养 大鼠外周血中性粒细胞分离实验1.2.6 RhoA活性测定 收集处理后的U937细胞，提取总蛋采用大鼠中性粒细胞分离液(TBD公司)。按其说明书操作进白。每管等量加入蛋白提取物，用1×裂解Buffer将蛋白提取行。U937细胞和HUVEC细胞分别在含10%胎牛血清的物中液体调至1ml体积。加入1μl的抗-活化RhoA抗体和20μlRPMI1640和含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞的磁珠悬液，摇晃1h，4?。使用1×裂解Buffer 洗3遍，收常规放置于37?、5% CO的细胞孵育箱中孵育。 集磁珠。加入20μl上样缓冲液重悬磁珠。样品煮沸5min后5 2 -1.2.2 中性粒细胞释放O和MPO的检测 调整细胞密度000×g，离心10s。使用Western blot测定活化RhoA蛋白变化2 情况。将处理组与对照组相比较。 1.2.7 RhoA及ROCK1蛋白表达测定 提取细胞总蛋白后 定量。取30μg总蛋白与2×Loading buffer煮沸后以7.5% SDS PAGE凝胶电泳分离。湿转蛋白至PVDF膜，室温封闭5h后， :300)和抗ROCK1一抗(1:500)，室加入抗RhoA一抗(1 温孵育2h。然后分别加入山羊抗小鼠/兔的二抗(1:5 000)。 ECL化学发光法显示结果并压片曝光。Labworks 4.6图像分析 [8]软件分析条带灰度值，使用β-actin作为内参。 1.3 统计学处理 x,s上述实验结果以均数?标准差( )表示，分别使用1:对照组,2:PMA组,3:PMA+Dex组,4:PMA+Dex+M组,5:PMA+Dex+C 组,6:PMA+Fas组 Sigmaplot 11.0和SPSS 17.0分别进行绘图及统计学分析。多组 间比较采用单因素方差分析。 图 1 各处理组中U937细胞的粘附情况 2 结果 2-2.1 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放O2.3 地塞米松和法舒地尔均可抑制U937细胞内 和MPO的影响 ROCK1的活化 当使用PMA(200ng/ml)作为中性粒细胞的刺激剂时，中由图2结果显示，当U397细胞加入PMA刺激后，ROCK1 2-性粒细胞中释放出O和MPO的水平较对照组有明显升高的活性较对照组有明显增加(P <0.05)。地塞米松和法舒地尔 -6(P<0.05),提示刺激较明显。10mol/L的Dex可以有效抑制可以有效抑制ROCK1的活性(P<0.05)。而PMA+Dex+M组、 PMA+Dex+C组与PMA+Dex组相比并无显著性差异(P>0.05)。 中性粒细胞的释放(P <0.05)，而100μmol/L的法舒地尔抑制 效果并不显著，与对照组之间无明显差异(P >0.05)。 PMA+Dex+M组、PMA+Dex+C组与PMA+Dex组相比并无显著 性差异(P >0.05)。 2-x,s表 1 PMA、地塞米松和法舒地尔对中性粒细胞释放O和MPO影响(n=3，) 2-组别 O MPO 对照组 1.00?0.09 1.00?0.07 aaPMA组 1.95?0.10 1.75?0.08 b bPMA+Dex组 1.25?0.10 1.07?0.06 bbPMA+Dex+M1.31?0.08 1.12?0.09 组 b bPMA+Dex+C组 1.30?0.07 1.13?0.01 PMA+Fas组 1.84?1.13 1.64?0.04 1:对照组,2:PMA组,3:PMA+Dex组,4:PMA+Dex+M组,5:PMA+Dex+Ca:P <0.05～与对照组比较,b:P <0.05～与PMA组比较 组,6:PMA+Fas组 图 2 各组U937细胞中ROCK1活性变化 2.2 地塞米松和法舒地尔均可抑制U937细胞的粘附 水平 2.4 地塞米松对U937细胞内ROCK1 mRNA表达的影响 加入PMA刺激后，U937细胞的粘附率较之未刺激组明显地塞米松对U937细胞内ROCK1 mRNA的表达无明显影响，提高(P<0.01)。当加入地塞米松和法舒地尔后粘附率显著低图3提示各组间ROCK1的mRNA变化情况无明显差异于PMA刺激组(P<0.01)。此外，PMA+Dex+M组、PMA+Dex+C(P >0.05)。 组与PMA+Dex组相比并无显著性差异(P >0.05)。 1:对照组,2:PMA组,3:PMA+Dex组,4:PMA+Dex+M组,5:PMA+Dex+C 组 A:Western blot检测结果,B:半定量分析结果 1:对照组,2:PMA图 3 各组间U937细胞内ROCK1 mRNA表达情况 组,3:PMA+Dex组,4:PMA+Dex+M组,5:PMA+Dex+C组 图 5 Western blot检测各组U937细胞中RhoA(A)ROCK1(B)蛋白表达 2.5 地塞米松对U937细胞内RhoA的活化的抑制作用 图4结果显示，阳性对照显著性高于阴性对照，说明实验 3 讨论 质量控制较好(P <0.01)。PMA显著性增加RhoA的活性(P 多种炎症反应对机体的损伤机制主要是由于中<0.05)而其余各组间:PMA、PMA+Dex、PMA+Dex+M、-性粒细胞释放颗粒内容物如超氧化物阴离子(O)和2PMA+Dex+C的RhoA活性并无明显差异(P >0.05)。 髓过氧化物酶(MPO)对血管内皮细胞造成损伤，并且释放大量细胞因子诱导更多的白细胞粘附在血管内皮和上皮细胞。因此，抑制中性粒细胞释放和降低白细胞对内皮细胞的粘附成为治疗急性炎症的首要环节。糖皮质激素在抗炎、免疫抑制等方面发挥重要 [9]的作用。在人们熟知的糖皮质激素基因组效应外，还存在着另外作用途径:非基因组效应，又称快速效应。其不影响基因转录和蛋白质合成过程而发挥作[10]用，起效时间短、见效快。临床上为了抑制急性炎 症反应通常使用大剂量糖皮质激素冲击疗法，效果较A:Western blot检测结果,B:半定量分析结果 1:阴性对照组,2:[11]阳性对照组PMA组,3:对照组,4:PMA组,5:PMA+Dex组,6:PMA+Dex+M为显著。但糖皮质激素非基因组作用机制尚不清 组,7:PMA+Dex+C组 楚。 图 4 Western blot检测各组U937细胞中活化的RhoA蛋白含量变化 我们前期研究发现糖皮质激素在快速抑制炎症 -6阶段的作用呈剂量依赖性，而非时间依赖性。10 2.6 各组间U937细胞内RhoA和ROCK1的蛋白变化 mol/L地塞米松可以有效快速抑制炎症反应。在本实各处理组间的RhoA及ROCK1的蛋白含量没有明显变化-6验中进一步发现，10 mol/L的地塞米松在30min内(P >0.05)(图5A、B)。 -可以显著性抑制中性粒细胞释放氧自由基(O)、髓2过氧化物酶(MPO)和U937单核细胞的粘附，且该过程并不能够被糖皮质激素受体拮抗剂--米非司酮(RU-486)和蛋白质合成抑制剂--放线菌酮(CHX)所抑制。提示该过程并不是通过经典的基因组效应，而是通过非基因组效应发挥作用。 近年来，炎症疾病中的关键调节分子 ROCK(Rho-associated coiled-coil protein kinase)引起人们越来越多的关注。ROCK属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，以两种同源性极高的异构体形式存在(ROKα/ROCK2和ROKβ/ROCK1)。已被证实ROCK在急 [12-13][14]6. Rubenstein NM, Callahan JA, Lo DH,et al. Selective glucocorticoid 性肺损伤、心血管疾病和缺血性脑损害等多种 control of Rho kinase isoforms regulate cell-cell interactions[J]. 炎症疾病中起重要作用。且有学者证明ROCK的两种 Biochemical and biophysical research communications, 2007. 亚型中，ROCK1对于炎性细胞的粘附、侵润起重要 [15]354(2): 603-607. 调节作用，ROCK2则无此作用。由此推断出在炎 7. Ho CC, Lai KC, Hsu SC, et al. Benzyl isothiocyanate (BITC) inhibits 症细胞粘附过程中起主要作用的是ROCK1而非 migration and invasion of human gastric cancer AGS cells via ROCK2。本研究在此基础上，发现ROCK抑制剂(法 suppressing ERK signal pathways[J]. Human & Experimental 舒地尔)同样可在短期内显著性降低U937细胞的粘 Toxicology, 2010. 30(4): 296-306. 附，但对中性粒细胞的释放并无明显影响。该结果提 8. Liu X, Li P, Liu P, et al. The essential role for c-Ski in mediating 示ROCK1是单核细胞粘附的关键调节分子，而并不 TGF-beta1 induced bi-directional effects on skin fibroblast 在中性粒细胞释放过程起主要作用。本研究发现地塞 proliferation through a feedback loop[J]. Biochem. J, 2008. 409(1): 米松可在短期内显著性抑制ROCK1的活性，而不对 289-297. 其蛋白表达产生影响，且该作用并不被米非司酮和放 9. Remmelts HH, Meijvis SC, Kovaleva A,et al. Changes in serum 线菌酮所扭转。 cortisol levels during community-acquired pneumonia: The 以上结果提示地塞米松以ROCK1依赖方式通过 influence of dexamethasone[J]. Respir Med, 2012. 非基因组效应抑制U937单核细胞的粘附，而以非 10. Zen M, Canova M, Campana C,et al. The kaleidoscope of ROCK1依赖方式抑制中性粒细胞释放。该实验的部 [6]glucorticoid effects on immune system[J]. Autoimmunity Reviews, 分结果与Rubenstein的实验结果相吻合。 2011.10(6):305-310 RhoA作为ROCK1的经典上游效应分子，可通 11. Zheng Y, Xiong S, Jiang P,et al. Glucocorticoids inhibit 过直接结合ROCK1的Rho结合域(rho-binding lipopolysaccharide mediated inflammatory response by domain,RBD)来激活ROCK1，在ROCK1活性调节[16]downregulating microRNA-155: a novel anti-inflammation 中起到了重要作用。糖皮质激素是否通过调节 mechanism[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2012. RhoA来影响ROCK1的活性变化，尚不得而知。本 12. Rikitake Y,Oyama N,Wang CYC, et al. Decreased perivascular 研究结果提示在此短时效应中，地塞米松对RhoA的 fibrosis but not cardiac hypertrophy in ROCK1+/- haploinsufficient 活性及蛋白表达无明显影响，提示地塞米松并以非 mice[J]. Circulation, 2005. 112(19): 2959-2965. RhoA依赖途径抑制ROCK1活性。 13. Lu G,Hein TW,Kuo L,et al. Rho Kinase-mediated Coronary Arteriolar 综上所述，本实验揭示了地塞米松通过不同途径 Constriction to Endothelin-1: Mechanistic Implications for Cardiac 分别于中性粒细胞和单核细胞，产生快速的抑制炎症 Syndrome X[J]. Translational Biomedicine, 2010. 1(2). 反应的效果。为进一步明确糖皮质激素抑炎的机制提 14. 赵红，胡松，张拥波,et al. Rho激酶与脑血管疾病[J]. 神经损伤出新的思路。 与功能重建, 2008. 3(10): 357-359 参考文献: 1. Badwey, JA, Karnovsky. Active oxygen species and the functions of 15. Noma K, Rikitake Y, Oyama N, et al.ROCK1 mediates leukocyte phagocytic leukocytes[J]. Annual review of biochemistry, 1980. recruitment andneointima formation following vascular injury[J]. 49(1):695-726. The Journal of clinical investigation, 2008. 118(5):1632-1644. 2. Matsuda, N, Y. Hattori. Systemic inflammatory response syndrome 16. Hall, A.,Rho GTPases and the control of cell behaviour[J]. (SIRS): molecular pathophysiology and gene therapy[J]. Journal of Biochemical Society Transactions, 2005. 33(5): 891-895. pharmacological sciences, 2006.101(3):189-198. (收稿:2012-03-19;修回:2012-04-06) 3. Aldridge AJ. Role of the neutrophil in septic shock and the adult ,编辑 王 红, respiratory distress syndrome[J]. Eur J Surg, 2002. 168(4): 204-214. 4. Clark, AR. Anti-inflammatory functions of glucocorticoid-induced genes[J]. Molecular and cellular endocrinology, 2007. 275(1-2): 79-97. 5. Slotta JE, Braun OO, Menger MD, et al. Fasudil, a Rho-kinase inhibitor, inhibits leukocyte adhesion in inflamed large blood vessels in vivo[J]. Inflammation Research, 2006. 55(9): 364-367.