蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究

蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究 蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法 的比较研究 第19卷第3期湖南文理学院(自然科学版) 2007年9月JournalofHunanUniversityofArtsandScience(Natural— S— cienceEdition) V_0I.19No.3 Sep.2007 文章编号:1672—6146(2007)03—0034—03 葸酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究 郭冬生,彭小兰 (1.湖南丈理学院科技处,湖南常德415000;2.湖南省畜牧兽医研究所,湖南长沙 410131) 摘要:实验用蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法分 别测定了17种饲料样品的淀粉含量,实验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,两种 测定方法差异极显着<0.01),但两种测定方法测出的数据 有极显着的强相关关系,相关系数R=0.9959<o.o1),其 回归关系为y=O.966,7063. 关键词:蒽酮比色法;酶水解法;淀粉 中图分类号:Q652文献 标识 采样口标识规范化 下载危险废物标识 下载医疗器械外包装标识图下载科目一标识图大全免费下载产品包装标识下载 码:A 淀粉是谷物,籽实和块根块茎饲料中的主要组 成成分,也是动物营养中重要的供能营养物质,淀 粉是饲料 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和食品检测中需要经常测定的营养指 标之一,因此,淀粉的测定方法除了要求测定结果 准确外,还需要操作简便和快捷.目前,国际上最 经典最准确的淀粉测定方法是瑞典人J.Holm(1986) 提出的快速分析测定淀粉的方法(starch/starke; 38(1986);224~226),在该方法中,样品先后经过 热稳定性0【一淀粉酶(0【.amylase),淀粉葡萄糖苷酶 (amyloglucosidase)葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase) 的处理,然后用分光光度计在450nl/1下比色测定. 该方法具有准确,快速的优点,缺点是三种酶制剂 在国内很难同时购得,而且酶制剂规格千差万别, 同时由于酶制剂价格昂贵,造成了测定成本会很高, 在一般的饲料食品检测中是不允许的,因此限制了 该方法的推广应用.高氯酸水解一葸酮比色法也是 国内流行的一种淀粉测定方法,该方法操作简便, 快速,而且成本低廉,适宜于一般的实验室分析操 作,但用该方法测定纤维含量很高的粗饲料时,测 定结果的可靠性和准确性有待于进一步的考证研究. 中华人民共和国国标(GB5009.9—85)中淀粉的测定 方法(酶水解法)具有其权威性,其分析测定结果也 很具有说服力,但该方法中的试验操作步骤极其繁 琐,也给一般的实验室分析操作带来很多不便,也 限制了其推广普及.本试验收集了常用动物饲料l7 种,其中包括能量饲料,蛋白质饲料和粗饲料,分 别用高氯酸水解一蒽酮比色法和国标中的酶水解法 分析测定其淀粉含量,对两种测定结果进行比较研 究,为实验室的淀粉分析测定提供试验依据. 1材料与方法 1.1实验材料 收集常用动物饲料样品l7种,包括能量饲料 (玉米,高粱,小麦,麸皮,次粉),蛋白质饲料(豆 粕,棉粕,菜粕,大豆,花生饼)和粗饲料(曹蓿, 羊草,玉米秸,稻草粉,啤酒糟,玉米青贮,大豆 秸),风干,用4O目的筛子进行粉碎,装在广口瓶 中备用.采用《饲料分析及饲料质量检测技术》(杨 胜,1993)中的方法测定饲料样品的干物质含量. 1.2实验方法 1.2.1葸酮比色法 实验原理:用乙醇溶液去除饲料样品中的可溶 性糖,再用高氯酸溶液溶解残留物中的淀粉,使淀 粉与其他成分分离,在浓硫酸的作用下,蒽酮与淀 粉反应生成蓝绿色的化合物,用分光光度计测定在 640nm下的吸光度. 试剂配制:8O%乙醇溶液;52%高氯酸溶液: 葸酮试剂(将0.4g葸酮溶于100mL88%硫酸溶液 中,现用现配);淀粉标准液(将200mg淀粉倒入100 mL烧杯中,加入5mL蒸馏水,加入65mL52%高 氯酸溶液,搅拌全部溶解,转入100mL溶量瓶中, 加水定容,浓度2mg/mL:取上述标准淀粉溶液 1O.00mL于250mL溶量瓶中,加水定容,此淀粉 溶液的浓度为8Oug/mL.) 标准曲线:在洁净的试管,分别加入O.O,l0.O, 2O.O,4O.O,6O.O,8O.Oug淀粉标准液,每一个浓度 2个重复,加水调整各试管溶液均为2.00mL,在冰 水中冷却2min,加入6.00mL葸酮一硫酸溶液,摇 匀,在冰水中冷却2min.将试管放入沸水中5min, 各试管显色呈蓝绿色,取出试管,冷却至室温.用 2.00mL蒸馏水按照上述操作作为空白参比,于640 nm波长下比色,测定各试管溶液的吸光度.以吸光度为横坐标,淀粉浓度作为纵坐标,绘制工作曲线, 进行曲线拟合,得到吸光度和淀粉浓度之间的回归 第3期郭冬生,彭小兰葸酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究35 公式. 操作步骤:称取2.5g饲料样品于50mL离心 管中,其中包括2个重复,加入80%乙醇溶液2滴 使样品湿润,再加入5mL水摇匀,加入25mL热 的80%乙醇溶液,摇匀后放置5min,以2500转/ 分钟速度离心5min,倾出上清液.再用30mL80 %乙醇溶液提取1次.于上述残留物中加入5mL水 和30mL52%高氯酸溶液,搅拌10min,以2500 转/分钟离心10min,将上清液转入100mL溶量 瓶中,残留物再用35mL52%高氯酸溶液提取,合 并提取液,以水定容.过滤,弃去最初5mL滤液.吸 取10.O0mL滤液于250mL溶量瓶中,加水定容.取 上述淀粉提取液2.00mL,测定沸水浴显色后溶液 的吸光度. 100 — 80 冒60 b0 40 20 0 0 吸光度OD 图1标准曲线 计算公式:淀粉(%)一G/(8M).式中,G为由饲 料样品提取液测定的吸光度,由工作曲线回归公式 计算出来的淀粉毫克数;M为饲料样品的质量.最 后换算成每克饲料干物质中淀粉的含量. 1.2.2酶水解法 实验原理:样品经过除去脂肪和可溶性糖后, 其中淀粉在淀粉酶的作用下水解成双糖,再用盐酸 将双糖水解成单糖,单糖能够把铜盐还原为氧化亚 铜,加入硫酸铁后,氧化亚铜被氧化成铜盐,而铁 盐被还原成亚铁盐,再用高锰酸钾溶液滴定还原生 成的亚铁盐,根据高锰酸钾溶液的消耗量,计算氧 化亚铜含量,再查国标(GB5009.7.85:25~29)得出 还原性糖含量,然后换算成淀粉的含量. 试剂配制:乙醚;85%乙醇;0【一淀粉酶(由芽 孢杆菌提取,最适pH5.5,7.5,最适T50?,70?, 活力单位不小于4000):0.5%淀粉酶溶液(称取淀粉 酶0.5g,加入100mL水溶解,加入数滴甲苯或三 氯甲烷,防止长霉,贮于冰箱中);碘溶液(称取3.6 g碘化钾溶于20mL水中,加入1.3g碘,溶解后加 水稀释至100mE);6N盐酸;甲基红指示剂;20 %氢氧化钠;碱性酒石酸铜甲液(称取34.639g硫酸 铜(CuSO4.5H2O),加适量的水溶解,加0.5mL硫酸, 再加水稀释至500mL,用精制石棉过滤);碱性酒 石酸铜乙液(称取173g酒石酸钾钠与50g氢氧化 钠,加适量水溶解,并稀释至500mL,用精制石棉 过滤,贮存于橡胶塞玻璃瓶中);精制石棉(取石棉 先用3N盐酸浸泡2,3d,用水洗干净,再加入10 %氢氧化钠溶液浸泡2"---3d,倒出溶液,再用热的 碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时,用水洗干净.再用3 N盐酸浸泡数小时,用水洗至不呈现酸性.然后加 水振摇,使成为微细的奖状软纤维,用水浸泡并贮 存于玻璃瓶中备用.);0.1000N高锰酸钾;硫酸铁 溶液(称取50g硫酸铁,加入200mL水溶解,慢慢 加入100mL硫酸,冷却后加水稀释至1000mL.) 样品处理:称取饲料样品2.0~5.0g,其中包括 2个重复,置于放有折叠滤纸的漏斗内,先用50mL 乙醚分5次洗除脂肪,再用约100mL85%乙醇洗 去可溶性糖,将残留物移入到250mL烧杯中,并 用50mL水洗涤滤纸合漏斗,洗液并入到烧杯中, 将烧杯放置在沸水浴中加热15min,使淀粉糊化, 冷却到60?以下,加20mL淀粉酶溶液,在55?, 60?保温1h,并不断搅拌.然后取出一滴此溶液加 入一滴碘溶液,应该不显现蓝色,如果显现蓝色, 再加入20mL淀粉酶溶液继续加热糊化,直到加碘 不显现蓝色为止.加热到沸腾,冷却后转移到250 mL的容量瓶中,加水到刻度,混匀过滤,弃去初 滤液.取50mL滤液置于250mL锥形瓶中,加5 mL6N盐酸,装上回流器,在沸水浴中回流1h, 冷却后加2滴甲基红指示液,用20%氢氧化钠溶液 中和至中性,将溶液转入到100mL容量瓶中,洗 涤锥形瓶,洗液并入到锥形瓶中,加水至刻度,混 匀备用. 测定步骤:吸取50mL处理后的样品液,放入 到400mL烧杯中,加入25mL碱性酒石酸铜甲溶 液和25mL乙溶液,在烧杯上盖一个表面皿,在4 min内煮沸腾,再准确煮沸2min,乘热用铺好石棉 的古式坩埚抽滤,并用60?热水洗涤烧杯及沉淀, 直到洗液不呈现碱性为止.将古式坩埚放回到原 400mL烧杯中,加入25mL硫酸铁溶液和25mL 水,用玻璃棒搅拌使氧化亚铜完全溶解,以0.1000 N高锰酸钾标准液滴定到微红色为终点.同时吸取 50mL水,按照上面的方法步骤作空白试验. 计算公式:X1=(Vo)xNx71.54.式中为样品 中还原性糖相当于氧化亚铜的质量(mg);V为样品 36湖南文理学院(自然科学版)2007钲 液消耗标准高锰酸钾溶液的体积(mL);Vo为空白液 消耗标准高锰酸钾溶液的体积(rn1);N为标准高锰 酸钾溶液的浓度;71.54一lmLlmol高锰酸钾溶液 相当于氧化亚铜的质量(mg). 根据计算的氧化亚铜的质量,查中华人民共和 国国标中《相当于氧化亚铜质量的葡萄糖,果糖, 乳糖,转化糖的质量表》(GB5009.7—85),查找氧 化亚铜的量相当于葡萄糖的量A,再按照下面的公 式计算淀粉含量:,-(x0.9)/(rex(50/250)x(vl/ 100)xl000))xl00.其中为样品中淀粉的含量 (%);A为测定样品中还原性糖的含量(mg);0.9为 葡萄糖换算成淀粉的换算系数;m为饲料样品的质 量(g);',l为测定用样品处理液的体积(mL). 1-3数据处理 用SPSS10.0软件统计分析中的t检验,检验两 种淀粉测定方法结果的差异显着性;并用SPSS10.0 进行一元回归分析,得出回归公式,相关系数(R) 和显着性水平(P),并用Excel2000作出散点图. 2结果与讨论 表1两种淀粉测定方法测定17种饲料的淀粉含量 j型 避 比色法测定数值 图2蒽酮比色法与酶水解法一元回归 用t检验两种测定方法的显着性时p<0.01,说 明两种淀粉测定方法测出的数值差异极显着;对两 组数据进行一元回归分析时,相关系数R=O.9959 <O.01),说明两种测定方法测出的数据有极显着 的强相关关系,其回归关系为y=0.9669x--0.7063. 从表中的数据可以看出,用酶水解法测定的值 明显小于用葸酮比色法测定的数值,差异极显着. 在用酶水解法测定操作过程中,实验现象虽然很明 显,如颜色变化和沉淀的生成等,但实验操作步骤 极其繁琐,饲料样品要经过多次洗涤,过滤,定容 和糊化,在这些操作过程中难免会成饲料样品的损 失浪费,造成结果产生较大的误差.在样品处理液 抽滤过程中,可以看到抽滤坩埚底部磁板上渗透有 暗红色的氧化亚铜沉淀颗粒,同时由于氧化亚铜颗 粒极其微细,可能透过石棉和坩埚底部磁板,进入 到抽滤瓶废液中,可以看到抽滤瓶底部有少量的氧 化亚铜沉淀,这些都是造成测定结果偏小的原因. 淀粉是由D一葡萄糖单元聚合而成的多糖,根据其 聚合方式和淀粉形态不同,可以分为直链淀粉和支 链淀粉,直链淀粉是由D一葡萄糖通过0c一1,4糖苷 键聚合而成的直链大分子,而支链淀粉含有多级分 支结构,分支处的连接键为0c一1,6糖苷键.由于酶 水解法中用的酶制剂为0c一淀粉酶,而0c一淀粉酶 只能水解0c—l,4糖苷键,淀粉被0c一淀粉酶作用后 剩下水解不完全的支链寡糖,支链寡糖主要由0c一 1,6糖苷键连接,因此淀粉水解不充分完全也是造成 测定结果偏小的又一个原因.同时酶制剂的规格千 差万别,淀粉酶的纯度和活性也是不可忽视的原因. 高氯酸水解一蒽酮比色法虽然操作简便快捷,而且 操作本身引起的误差可能不是很大,同时分光光度 计度数也很精确,但由于饲料样品是经过高氯酸水 解的,而高氯酸是具有强氧化性的强酸,可能会破 坏饲料中的纤维素和木质素等碳水化合物成分,产 生葡萄糖类似物,造成结果产生较大的误差,尤其 对于粗纤维含量高的粗饲料误差可能会更大.该实 验中测定的淀粉含量与营养成分表中的数据也有很 大的差别,原因可能是淀粉含量与饲料品种,土壤 和栽培条件,直链与支链淀粉的比例及饲料本身成 熟度等因素有关,同时如果饲料储存时间太久也可 能造成淀粉含量的下降,尤其对淀粉含量丰富的谷 物籽实饲料损失会更大. 3小结 高氯酸水解一蒽酮比色法和(下转第48页) 湖南文理学院(自然科学版)2007年 PathogenicityofMetarhizium(Metsh.) SorokinandBeauveriabassianaon Coptotermesformosanus GUOChun-qiu,LIUGuang-ming,TIANZong—cheng, ZHANGJian—hua,CHENKai—xing,HUANGJian-hua (DepartmentofLifeSciences,HunanUniversityofArtsand Science,ChangdeHunan415000) Abstract:Thisexperimentdealtwiththepathogenicityof Metarhizium(Metsh.)SorokinandBeauveriabassianaon Coptotermesformosanusthroughthedaubandfeeding infectingways.Theprimaryresultsshowedthatthetwokinds ofentomogenousfungihadcertainpathogenicityon Coptotermesformosanus,andthepathogenicitywasverylow duringtheshortinfectedperiod,whichmaybecausedbythe socialbehaviorofCoptotermesformosanustocontrolthe growthanddistributionoftheentomogenousfungi,SOthe potentialoftheentomogenousfungiasthebiologictermiticides hastobeproved. Keywords:Metarhizium(Metsh.)Sorokin;Beauveriabassiana; CoptotermesformosanusShiraki;pathogenicity 收稿日期:2007.09.15 基金项目:国家教育部科学技术研究重点项目(03093);湖 南省自然科学基金项目(02JJY2055) 作者简介:郭春秋(1963一),男,副教授,主要从事微生物学 的教学与研究. (责任编校:江河) (上接第36页) 酶水解法各有优缺点,两种测定结果虽然有极显着 的强相关关系,但两种测定结果差异极显着.对于 淀粉含量高,而且粗纤维含量低的谷物籽实饲料, 推荐使用高氯酸水解一葸酮比色法,其测定结果误 差较小,而且操作步骤快捷简便;对于粗纤维含量 高的粗饲料,建议用酶水解法测定,但由于操作步 骤繁琐,应尽量减少操作本身造成的实验误差,而 且应该选用纯度高,活性强的酶制剂;如果要求测 定结果很精确,而且经济条件也允许,建议使用 J.Holm(1986)提出的快速分析测定淀粉的方法. 参考文献: f1】JHolm,IBjorck,ADrews,eta1.Arapidmethodforthe analysisofstarch[J].starch/starke,1986,38:224-226. [2】HallMB,JPJennings,BALewis,eta1.Evaluationof starchanalysismethodsforfeedsamples[J].Journalofthe ScienceofFoodandAgriculture,2000,81:17—21. [3】MaryBHall,WilliamHHoovehJocelynPJennings,eta1. Amethodforpartitioningneutraldetergent-soluble carbohydrates[J].JournaloftheScienceofFoodand Agriculture,1999,79:2079—2086. [4】宁开桂.实用饲料分析手册[M】.北京:中国农业科技出 版社,1993. [5】中华人民共和国国家标准.食品中还原性糖的测定方法, GB5009.7.85[S].中华人民共和国卫生部,1985—05.16发 布. [6】中华人民共和国国家标准.食品中淀粉的测定方法,GB 85[S].中华人民共和国卫生部,1985—05—16发布. 5009.9— [7】李德发.中国饲料大全[M】.北京:中国农业出版社, 2001. ComparativeStudyonAntrone ChromametryandEnzymaticHydrolysisfor AssayStarchMethod GUODong.sheng,PENGXiao.1an (1.DepartmentofScienceandTechnology,HunanUniversity ofArtsandScience,ChangdeHunan415000; 2.HunanProvinceInstituteofAnimalScience&Veterinary Medicine,ChangshaHunan410131) Abstract:Inthisexperiment,seventeenconventionalfeedsare analyzedwithantronechromametry(),)andenzymatic hydrolysis)methodsforstarchcontents.Theresultsshowed thattherewasasignificantregressionrelationshipbetweenY valueandvalue.-Y=0.9669一0.7063,R=0.9959,P< 0.01,n=17.ButthroughttestedbetweenandY,P<0.01,it wasconcludedthatandYvaluewassignificantdifference. Keywords:starch;antronechromametry;enzymatichydrolysis 收稿日期:2007.06.21 基金项目:湖南省自然科学基金项目资JJ/(06JJ50040);湖南 省教育厅项目资助(06C604) 作者简介:郭冬生(1973.),男,硕士,讲师,研究方向为反刍 动物营养. (责任编校:谭长贵)